Name: robust comparison of protein levels across tissues and throughout development using standardized quantitative western blotting
Uploaded: 2019-04-09T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Robust Comparison of Protein Levels Across Tissues and Throughout Development Using Standardized Quantitative Western Blotting at JoVE.com

E.J.N.G. נתמך על ידי טרסט (גרנט 106098/ת/14/Z). מימון אחרות סופק על ידי הקרן SMA (SMA בבריטניה קונסורציום; T.H.G. & Y-טי ח'), אירופה SMA (T.H.G, D.v.D.H. & E.J.N.G.), ה-DTP אוניברסיטת אדינבורו ברפואה דיוק (T.H.G., שראשי & A.M.M.), ומרכז Euan מקדונלד לחקר מחלת עצבי התנועה המוטורית (T.H.G).

רקמות עבור הליך זה התקבלו מחקרים בבעלי חיים אושרו על ידי ועדת האתיקה פנימית באוניברסיטת אדינבורו, בוצעו קונקורדנציה עם מוסדיים, תקנות משרד הפנים בבריטניה תחת סמכותו של רלוונטיות אישי פרויקט רשיונות.
הערה: פרוטוקול זה הותאם באמצעות ערכות מתוקננת, זמינים מסחרית, ריאגנטים על ...

<ol>
	<li>Bertoni, T. A., Perenha-Viana, M. C., Patussi, E. V., Cardoso, R. F., Svidzinski, T. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western+blotting+is+an+efficient+tool+for+differential+diagnosis+of+paracoccidioidomycosis+and+pulmonary+tuberculosis.">Western blotting is an efficient tool for differential diagnosis of paracoccidioidomycosis and pulmonary tuberculosis.</a> Clinical and Vaccine Immunology. 19 (11), 1887-1888 (2012).</li><li>Hutchinson, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Costs+and+outcomes+of+laboratory+diagnostic+algorithms+for+the+detection+of+HIV.">Costs and outcomes of laboratory diagnostic algorithms for the detection of HIV.</a> Journal of Clinical Virology. 58 Suppl 1, (2013).</li><li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets:+procedure+and+some+applications.">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li><li>Eaton, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+protein+analysis+as+a+reliable+loading+control+for+quantitative+fluorescent+Western+blotting.">Total protein analysis as a reliable loading control for quantitative fluorescent Western blotting.</a> PloS One. 8 (8), e72457 (2013).</li><li>Ghosh, R., Gilda, J. E., Gomes, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+necessity+of+and+strategies+for+improving+confidence+in+the+accuracy+of+western+blots.">The necessity of and strategies for improving confidence in the accuracy of western blots.</a> Expert Rev Proteomics. 11 (5), 549-560 (2014).</li><li>Jensen, B. C., Swigart, P. M., Simpson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ten+commercial+antibodies+for+alpha-1-adrenergic+receptor+subtypes+are+nonspecific.">Ten commercial antibodies for alpha-1-adrenergic receptor subtypes are nonspecific.</a> Naunyn-Schmiedebergs Archives of Pharmacology. 379 (4), 409-412 (2009).</li><li>Jositsch, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suitability+of+muscarinic+acetylcholine+receptor+antibodies+for+immunohistochemistry+evaluated+on+tissue+sections+of+receptor+gene-deficient+mice.">Suitability of muscarinic acetylcholine receptor antibodies for immunohistochemistry evaluated on tissue sections of receptor gene-deficient mice.</a> Naunyn-Schmiedebergs Archives of Pharmacology. 379 (4), 389-395 (2009).</li><li>Smejkal, G., Gallagher, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+semidry+protein+transfer+efficiency+with+transverse+gradient+gel+electrophoresis.">Determination of semidry protein transfer efficiency with transverse gradient gel electrophoresis.</a> Biotechniques. 16 (2), (1994).</li><li>Eaton, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+modern+quantitative+fluorescent+western+blotting+with+troubleshooting+strategies.">A guide to modern quantitative fluorescent western blotting with troubleshooting strategies.</a> Journal of Visualized Experiments. (93), e52099 (2014).</li><li>Hunter, G., Roche, S. L., Somers, E., Fuller, H. R., Gillingwater, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+storage+parameters+on+measurement+of+survival+motor+neuron+(SMN)+protein+levels:+implications+for+pre-clinical+studies+and+clinical+trials+for+spinal+muscular+atrophy.">The influence of storage parameters on measurement of survival motor neuron (SMN) protein levels: implications for pre-clinical studies and clinical trials for spinal muscular atrophy.</a> Neuromuscular Disorders. 24 (11), 973-977 (2014).</li><li>Fosang, A. J., Colbran, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transparency+Is+the+Key+to+Quality.">Transparency Is the Key to Quality.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (50), 29692-29694 (2015).</li><li>Taylor, S. C., Berkelman, T., Yadav, G., Hammond, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+defined+methodology+for+reliable+quantification+of+Western+blot+data.">A defined methodology for reliable quantification of Western blot data.</a> Molecular Biotechnology. 55 (3), 217-226 (2013).</li><li>Goasdoue, K., Awabdy, D., Bjorkman, S. T., Miller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standard+loading+controls+are+not+reliable+for+Western+blot+quantification+across+brain+development+or+in+pathological+conditions.">Standard loading controls are not reliable for Western blot quantification across brain development or in pathological conditions.</a> Electrophoresis. 37 (4), 630-634 (2016).</li><li>Rocha-Martins, M., Njaine, B., Silveira, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avoiding+pitfalls+of+internal+controls:+validation+of+reference+genes+for+analysis+by+qRT-PCR+and+Western+blot+throughout+rat+retinal+development.">Avoiding pitfalls of internal controls: validation of reference genes for analysis by qRT-PCR and Western blot throughout rat retinal development.</a> PloS One. 7 (8), e43028 (2012).</li><li>Aghamaleky Sarvestany, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+quantitative+proteomic+profiling+identifies+disruption+of+ubiquitin+homeostasis+as+a+key+driver+of+Schwann+cell+defects+in+spinal+muscular+atrophy.">Label-free quantitative proteomic profiling identifies disruption of ubiquitin homeostasis as a key driver of Schwann cell defects in spinal muscular atrophy.</a> Journal of Proteome Research. 13 (11), 4546-4557 (2014).</li><li>Fuller, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+Muscular+Atrophy+Patient+iPSC-Derived+Motor+Neurons+Have+Reduced+Expression+of+Proteins+Important+in+Neuronal+Development.">Spinal Muscular Atrophy Patient iPSC-Derived Motor Neurons Have Reduced Expression of Proteins Important in Neuronal Development.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 506 (2015).</li><li>Liu, N. K., Xu, X. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=beta-tubulin+is+a+more+suitable+internal+control+than+beta-actin+in+western+blot+analysis+of+spinal+cord+tissues+after+traumatic+injury.">beta-tubulin is a more suitable internal control than beta-actin in western blot analysis of spinal cord tissues after traumatic injury.</a> Journal of Neurotrauma. 23 (12), 1794-1801 (2006).</li><li>Moritz, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tubulin+or+Not+Tubulin:+Heading+Toward+Total+Protein+Staining+as+Loading+Control+in+Western+Blots.">Tubulin or Not Tubulin: Heading Toward Total Protein Staining as Loading Control in Western Blots.</a> Proteomics. 17 (20), (2017).</li><li>Groen, E. J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+and+tissue-specific+variability+of+SMN+protein+levels+in+mouse+models+of+spinal+muscular+atrophy.">Temporal and tissue-specific variability of SMN protein levels in mouse models of spinal muscular atrophy.</a> Human Molecular Genetics. 27 (16), 2851-2862 (2018).</li><li>Chaytow, H., Huang, Y. T., Gillingwater, T. H., Faller, K. M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+survival+motor+neuron+protein+(SMN)+in+protein+homeostasis.">The role of survival motor neuron protein (SMN) in protein homeostasis.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. , (2018).</li><li>Groen, E. J. N., Talbot, K., Gillingwater, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+therapy+for+spinal+muscular+atrophy:+promises+and+challenges.">Advances in therapy for spinal muscular atrophy: promises and challenges.</a> Nature Reviews: Neurology. 14 (4), 214-224 (2018).</li><li>Fitzmaurice, G. M., Laird, N. M., Ware, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Applied longitudinal analysis. , (2004).</li><li>Jordan, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Population+sampling+affects+pseudoreplication.">Population sampling affects pseudoreplication.</a> PLoS Biology. 16 (10), e2007054 (2018).</li><li>LaFauci, G., Adayev, T., Kascsak, R., Brown, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+Quantification+of+the+Fragile+X+Mental+Retardation+Protein+1+(FMRP).">Detection and Quantification of the Fragile X Mental Retardation Protein 1 (FMRP).</a> Genes (Basel). 7 (12), (2016).</li></ol>

עם עיצוב ניסיוני המתאים, אמצעי בקרה ניתוח סטטיסטי, סופג המערבי יכול לשמש כדי לבצע הערכות כמותיות אמין של ביטוי חלבונים בתוך ובין מבחר מגוון של דגימות ביולוגיות. פרוטוקול שנתאר בכתב היד הנוכחי נועד לשמש קו מנחה עבור חוקרים המעוניינים להשתמש המערבי סופג לבצע ניתוח כמותי גדול יותר ומורכב יו?...

סופג המערבי היא טכניקה המשמשת בדרך כלל כדי לזהות ולכמת ביטוי חלבון, כולל רקמות homogenates או תמציות. במהלך השנים, טכניקה זו הובילה רבים ההתקדמות במחקר בסיסי וקליני, שבו הוא יכול לשמש ככלי אבחוני כדי לזהות הנוכחות של מחלה1,2. סופג המערבי תוארה לראשונה בשנת 1979 כשיטה כדי להעביר חלבונים לזיהוי ג'לים ניטרוצלולוזה גליונות והמחש לאחר מכן חלבונים באמצעות נוגדנים משניים radioactively מתויג או מצומדת כדי fluorescein . או peroxidase3... דרך פיתוח ערכות זמינים מסחרית, ציוד, שיטות סופג המערבי יש יותר ויותר סטנדרטית, פשוטה עם השנים. אכן, הטכניקה עכשיו בקלות מתבצעת על ידי מדענים עם רקעים ורמות שונות של ניסיון. עם זאת, כמו עם טכניקות רבות ניסיוני דומה, התוצאה של ניתוח תספיג בקלות מושפעת האפשרויות עיצוב, ביצוע הניסוי. זה חשוב, לכן, כי הנגישות של מתוקננת שיטות מערביות סופג לא יטשטשו את הצורך תכנון ניסויי זהיר ועיצוב. שיקולים ניסיוני כוללים, אך אינם מוגבלים, לדוגמא, טיפול, בחירה והכנה אימות של נוגדנים לגילוי חלבון ויעילות ג'ל-כדי-הממברנה העברה של קטן או גדול במיוחד (< 10 או > 140 kDa) חלבונים4,5,6,7,8,9. חלבון איכותי של המדגם המקורי ממלאת תפקיד משמעותי בקביעת התוצאה של הניתוח תספיג עוקבות. כמו חלבון יכול להיות מופק מגוון רחב של מקורות, כולל שורות תאים, רקמות חייתיים של פוסט-מורטם ברקמות אנושיות, ודוגמאות עקביות בטיפול ועיבוד נדרש כדי להשיג תוצאות לשחזור. לדוגמה, כאשר נדרש אחסון לטווח ארוך של דגימות לחילוץ חלבון, זה חשוב להבין כי למרות חלבון יציב בדרך כלל ב-80 מעלות צלזיוס, ההבדלים חלבון יציבות בין חלבונים שחולצו ורקמות שלם ב- 80 ° C כבר דווח על10. יתר על כן, כדי לקבל הערכות לשחזור של כמויות חלבון, המגון עקבית של דגימות היא קריטית. אופטימיזציה של מאגרי פירוק שונים ושיטות המגון (למשל, ידני המגון בהשוואה בשיטות אוטומטיות) עשוי להידרש לפני התחלת ניסוי כמותי בקנה מידה גדול.
נורמליזציה אסטרטגיות לתיקון השתנות וטעינה של כימות חלבונים חיוניים כדי להשיג תוצאות חזקות, כמותית של ביטוי חלבון. ניהול משק בית חלבונים כגון β-אקטין, α-טובולין, β-טובולין, גליצראלדהיד-3-פוספט דהידרוגנאז (GAPDH) מסורתי שימשו לנרמל את רמות החלבון על כימות. עם זאת, נורמליזציה משק מסוים חלבונים למטרות כימות יותר ויותר ביקורת על העבר כמה שנים11,12. לדוגמה, הביטוי של חלבונים משק בית יכול להשתנות על פני שלבים התפתחותיים שונים13,14, מעבר ברקמות של בעלי חיים מאותו4, ותחת שונים המחלה התנאים4,15 16, ,17. לכן, השימוש של חלבונים ספציפיים משק מגביל את האפשרויות של הפיכת מורכבים יותר השוואות בין ביטוי חלבון מ ברקמות שונות, timepoints שונים, תחת משתנה תנאי הניסוי. אלטרנטיבה משק החלבונים כדי לשלוט על חלבון טעינת וריאציה הוא השימוש של כתם חלבון הכולל (TPS) את התוויות, מדמיין כל החלבונים הנוכח במדגם. תוכנית-המיתאר מאפשר נורמליזציה אות המבוסס על עומס חלבון הכולל יותר מאשר רמות של חלבון ספציפי אחד, ולפיכך כימות של תוכנית-המיתאר אות צריך להיות דומים ואף לשחזור ללא תלות במצב ניסיוני, סוג הדגימה או timepoint התפתחותית . דוגמאות חלבון הכולל כתמי צבע מאכל פונסו S העיניינים ג'לים, Coomassie R-350, עברית, Epicocconone, Amydo השחור, Cy5 (שבתוך הפניה למעורר 18). כל השיטות האלה יש יתרונות ספציפיים ומגבלות, שיטת הבחירה תלויה בזמן, כלים זמינים, כמו גם את הגדרת הניסוי4,18.
בנוסף לשימוש תוכנית-מיתאר כדי לתקן בתוך-הממברנה וטעינה של כימות השתנות, ייתכן צורך להשוות בין דגימות בין ממברנות שונות, במיוחד בעת ביצוע ניתוח ביטוי חלבונים בקנה מידה גדול. עם זאת, השתנות של גורמים כמו הנוגדן מחייב יעילות וסיכום בעוצמה הכתם חלבון יכול להכיר עוד יותר השתנות בין דגימות חלבון זה מנותחים על ג'לים נפרד ממברנות. על כימות חזקים במצב הזה, לכן שצריך להציג צעד נוסף נורמליזציה להביא בחשבון השתנות בין-הממברנה. זו יכולה להיות מושגת על-ידי הכללת תקן הטעינה פנימי בכל אחד הקרומים בנפרד שנותחה נשמר קבוע לאורך ניסויים. תקן זה יכול ללבוש הצורה של כל חלבון lysate זה ניתן להשיג בכמויות מספיקות כדי לשמש מעבר ממברנות כל כלול את הניסוי. כאן, אנו משתמשים lysate של מוח העכבר (המתקבל עכברים פקד בן 5 יום), המוח הוא הומוגני ברצון, החלבון שהושג lysate מכיל כמות משמעותית של חלבון-ריכוז גבוה. טעינת תקן פנימי שהפקידים מאפשר דוגמאות על ממברנות נפרד מנורמל, בהשוואה ישירות.
כאן, אנו מתארים את פרוטוקול מפורט פותחו כדי לאפשר לנו לבצע השוואות מורכבות של חלבון ביטוי וריאציה על פני ברקמות שונות, מודלים העכבר (כולל מודלים המחלה), התפתחותיים timepoints19. על ידי שילוב תוכנית-מיתאר פלורסנט עם השימוש טעינת פנימי סטנדרטי, הצלחנו להתגבר על מגבלות הקיימות מספר דוגמאות ומצבים ניסיוני ניתן להשוואה במסגרת ניסוי יחיד. גישה זו מרחיבה את השימוש בטכניקות מסורתיות תספיג, ובכך לאפשר לחוקרים לחקור יותר חלבון הביטוי על פני ברקמות שונות ודוגמאות.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fine Tipped Gel Loading Tips</td>
			<td>Alpha Laboratories</td>
			<td>GL20057SNTL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halt Protease Inhibitor Cocktail, EDTA-free 100x 5mL</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>78437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Handheld homogeniser&#160;</td>
			<td>VWR Collection</td>
			<td>431-0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iBlot 2 Gel Transfer Device</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>IB21001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iBlot Transfer Stack, PVDF, regular size</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>IB401031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Studio Lite</td>
			<td>Licor</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Free download from https://www.licor.com/bio/products/software/image_studio_lite/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 800CW secondary antibodies</td>
			<td>Licor</td>
			<td>--</td>
			<td>Select appropriate secondary antibody that is specific against host of primary antibody.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Novex Sharp Pre-stained Protein Standard</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>LC5800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15-well</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>NP0323BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE LDS Sample Buffer (4X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>NP0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE MOPS SDS Running Buffer (20X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>NP0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey Blocking Buffer</td>
			<td>Licor</td>
			<td>927-40000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Mouse anti-SMN (survival motor neuron) monoclonal antibody</td>
			<td>BD Transduction Laboratories</td>
			<td>610646</td>
			<td>Is used extensively in the SMN/SMA literature and gives consistent results regardsless of lot number</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REVERT Total Protein Stain, 250 mL&#160;</td>
			<td>Licor</td>
			<td>926-11021&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REVERT Wash Solution&#160;</td>
			<td>Licor</td>
			<td>926-11012&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA Lysis and Extraction Buffer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>89900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XCell&#160;SureLock Mini-Cell</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>EI0001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

robust comparison of protein levels across tissues and throughout development using standardized quantitative western blotting

סופג המערבי היא טכניקה המשמש בדרך כלל כדי לזהות ולכמת ביטוי חלבון. במהלך השנים, טכניקה זו הובילה רבים ההתקדמות במחקר בסיסי וקליני. עם זאת, כמו עם טכניקות רבות ניסיוני דומה, התוצאה של ניתוח תספיג בקלות מושפעת האפשרויות עיצוב, ביצוע הניסוי. חלבונים ספציפיים משק באופן מסורתי שימש לנרמל את רמות החלבון על כימות, אולם, אלה יש מספר מגבלות, ולכן יותר ויותר ננזף על השנים האחרונות. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול מפורט פותחו כדי לאפשר לנו לבצע השוואות מורכבות של חלבון ביטוי וריאציה על פני ברקמות שונות, מודלים העכבר (כולל מודלים המחלה) ו- timepoints התפתחותית. על-ידי שימוש כתם חלבון פלואורסצנטי הכולל היכרות עם השימוש טעינת פנימי רגיל, זה אפשרי להתגבר על מגבלות הקיימות במספר הדגימות אשר ניתן להשוות בתוך ניסויים ולהשוות באופן שיטתי את רמות החלבון על פני מגוון של תנאי הניסוי. גישה זו מרחיבה את השימוש בטכניקות מסורתיות תספיג, ובכך לאפשר לחוקרים לחקור יותר חלבון הביטוי על פני ברקמות שונות ודוגמאות.

נשלב דוגמאות לשימוש של תוכנית-המיתאר של תקן פנימי להקל על השוואות של רמות החלבון על פני רקמות ונקודות זמן. איור 1 מציג תוצאות סופג המערבי על חלבון המופק רקמות המתקבל neonatal (כמחנכת יום 5) לעומת עכברים בוגרים (10 - בן שבועיים). תוכנית-המיתאר Smn immunoblot מוצגים ב- <strong ...

Watch this Scientific Journal Video about Robust Comparison of Protein Levels Across Tissues and Throughout Development Using Standardized Quantitative Western Blotting at JoVE.com

Robust Comparison of Protein Levels Across Tissues and Throughout Development Using Standardized Quantitative Western Blotting

שיטה זו מתארת בגישה לשחזור ועמיד עבור ההשוואה של רמות החלבון ברקמות שונות, timepoints התפתחותיים שונים באמצעות מתוקננת כמותיים המערבי blotting בגישה.

השוואה חזקים של רמות החלבון על פני רקמות וברחבי פיתוח באמצעות מתוקננת כמותיים המערבי סופג

Western blotting is a technique that is commonly used to detect and quantify protein expression. Over the years, this technique has led to many advances ...

פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לענות על שאלות חשובות במחקר בסיסי וקליני על ידי התבוננות ביטוי חלבון על פני רקמות שונות ונקודות זמן. כדי לבצע כתמים מערביים כמותיים אמינים, אנו משלבים כתם חלבון כולל פלואורסצנטי עם בקרת טעינה פנימית. זה מתגבר על מגבלות המתעוררות בעת השוואת רקמות שונות על פני תנאים ניסיוניים.כדי לחלץ חלבונים מדגימות תאים או רקמות קפואות, הפשיר את הדגימות של מינוס 80 מעלות על קרח לפני שטיפת הדגימות לפי הצורך, על פי הטבלה. באמצעות homogenizer חשמלי כף יד עם עלה פוליפרופילן, הומוגניזציה דגימות שטף, לשטוף את העלי במים מזוקקים כפול וייבוש עם רקמה נקייה בין דגימות. השאירו את הדגימות על הקרח למשך 10 דקות, ולאחר מכן צנטריפוגה.לאחר מכן, להעביר את החלבון-מדגם המכיל supernatant לצינור חדש על הקרח מבלי להפריע גלולה. לכמת את ריכוז החלבון, להגדיר תקני אלבומין בסרום חזיר בריכוזים הולכים וגדלים ב- triplicate, ולהוסיף microliter אחד של כל דגימת חלבון כפול ל בארות המתאימות של צלחת אופטית 96-well. דגירה החלבון על בלוק חום 60 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות או יותר אם ריכוז החלבון צפוי להיות נמוך ולמדוד את הספיגה ב 560 ננומטר על קורא צלחת.יצא את מדידות קורא הלוחות וחשב את ריכוז החלבון על-ידי השוואת ערכי הספיגה הממוצעים של כל דגימה לעקומה סטנדרטית המתקבלת באמצעות תקן החלבון. כדי לנרמל את כמות החלבון, הכינו דילול של דגימות החלבון במאגר הדגימה ומים טהורים במיוחד והדגירה את הדגימות בבלוק חום של 70 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. לאחר מכן, מניחים את הדגימות על קרח לפני מערבולת וצנטריפוגה לזמן קצר.עבור אלקטרופורזה, להגדיר מראש ארבעה עד 12% ביס-טריס שיפוע ג'ל במערכת התא אלקטרופורזה ג'ל לטעון 3.5 microliters של תקן חלבון לתוך באר. בעת שימוש בתקן פנימי לנורמליזציה בין קרום, טען כמות השווה לדגימות האחרות לשלוש הבארות הראשונות ליד סולם החלבון וטען 30 מיקרוגרם של כל דגימה לתוך הבאר הנותרת. לאחר מכן, להפעיל את הדגימות דרך ג'ל הערימה ב 80 וולט במשך 10 דקות ואחריו 150 וולט במשך 45 עד 60 דקות נוספות.בסוף האלקטרופורזה, כדי להרכיב את ערימת ההעברה, מניחים את ג'ל החלבון על הערימה התחתונה המכילה את קרום הפוליווינילידין דיפלואוריד ואחריו נייר המסנן. השתמש בגלגלת סופג כדי להסיר את כל בועות האוויר למקם את הערימה העליונה על החלק העליון של נייר המסנן לפני גלגול הערימה שוב כדי להסיר בועות אוויר. מעבירים את כל הערימה למכשיר ההעברה עם האלקטרודה בצד שמאל של המכשיר ומ מניחים את ספוג הג'ל על גבי הערימה כך שהספוג מיושר עם המגעים החשמליים המתאימים במכשיר.לאחר סגירת המכסה, בחר והתחל את התוכנית המתאימה. בסוף התוכנית, חותכים את הממברנה לגודל הג'ל ושוטפים את הממברנה החתוכה במהירות במים מזוקקים כפולים לפני שממשימים עם כתם החלבון הכולל. עבור כתמי חלבון כוללים, מגלגלים את הממברנה לתוך צינור 50 מיליליטר כאשר צד החלבון פונה פנימה ומתייגים את הממברנה עם חמישה מיליליטר של תווי כתם חלבון על רולר במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר במכסה המנוע של האדים.בסוף הדגירה, לשטוף את הממברנה במהירות עם חמישה מיליליטר של פתרון לשטוף, החזרת הצינור בקצרה רולר בין שטיפות, ואחריו שטיפה קצרה עם מים טהורים במיוחד. מוסיפים שלושה מיליליטר של חיץ חסימה לממברנה ומחזירים את הממברנה לגלגלת במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. החלף את חיץ החסימה בנוגדן העניין העיקרי בריכוז האופטימי המתאים והידגר את הממברנה על הגליל במשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס.למחרת, לשטוף את הממברנה שש פעמים במשך חמש דקות עם חמישה מיליליטר של PBS טרי לכל לשטוף על רולר בטמפרטורת החדר. לאחר הכביסה האחרונה, להדק את הממברנה עם פתרון נוגדנים משני המתאים על רולר במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר ואחריו שלוש שטיפות במשך 30 דקות לכל לשטוף. לאחר הכביסה האחרונה, ייבשו את הממברנה ולהשתמש בנייר אלומיניום כדי לשמור על הממברנה מוגנת מפני אור.לרכישת תמונה, מקם את הממברנה בסורק כשיד החלבון פונה כלפי מטה ובחר את אזור הסריקה בתוכנה. לאחר מכן, לרכוש תמונות בשני הערוצים ולייצא את התמונות לתוכנית ניתוח תמונה מתאימה. הצג את ערוץ 700 הננומטר כדי להציג את תוצאת הכתמת החלבון הכוללת ובחר ניתוח וצייר מלבן כדי להגדיר את אזור העניין לנורמליזציה.לאחר מכן, העתק והדבק את אזור המלבן הראשון על כל דגימה בודדת כדי להבטיח שהאזור המוגדר יהיה באותו גודל עבור כל הנתיבים שנותחו. כדי לכמת את ריכוז החלבון בכל נתיב, העתק את התוצאות הן מכתם החלבון הכולל והן מחלבון המעניין לתוכנית גיליון אלקטרוני וקבע את אות הכתם הכולל הגבוה ביותר של חלבון. לאחר מכן, חלקו כל ערך אות כתמי חלבון לפי ערך זה כדי לקבל את ערך טעינת החלבון המנורמל ולחלק את ערך האות של 800 ננומטר מכל מדגם בגוף לפי ערך החלבון המנורמל המתאים לו כדי לחשב את יחס ביטוי החלבון היחסי בדגימות שונות.בתנומות מערביות מייצגות אלה, חלבונים המופקים מרקמות המתקבלות מיום לידה חמישה עכברים מושווים לחלבונים המופקים מעכברים בוגרים בני 10 שבועות. כימות עוצמת הפלואורסצנטיות של כתם החלבון הכולל הושג על ידי מדידת עוצמת הפלואורסצנטיות בתוך תיבת המלבן בכל נתיב. כאשר נתיבים שלמים מנותחים, עוצמת הפלואורסצנטיות נשארת דומה יחסית בין דגימות, מה שמצביע על כך שהשימוש בכתם החלבון הכולל לנורמליזציה מתאים למטרה זו.ניתן להשתמש בכתם החלבון הכולל הפלואורסצנטי גם כדי להשוות את רמות החלבון בנקודות זמן התפתחותיות שונות. לדוגמה, למרות שרמות החלבון של נוירון מוטורי הישרדות יורדות בבירור עם הגיל בעכברים, כימות החלבון המוכתם הכולל נשאר קבוע. השימוש בתקנים פנימיים, נורמליזציה מבוססת פלואורסצנטיות וסטטיסטיקה נאותה מגביר את החוסן של ניתוח ביטוי חלבון מורכב בתנאים שונים.פרוטוקול זה מוסיף לטכניקות כתם מערביות מסורתיות, מתגבר על הבעיות של בקרות טעינה והשוואות מתאימות על פני אצוות ניסיוניות, ומספק גמישות לניתוח ביטוי חלבון. גישה זו יכולה להיות מורחבת להשוואת ביטוי חלבון בתנאים ניסיוניים אחרים.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

באמצעות הפיגום ליפוזומים כדי לשקם אינטראקציות ליפידים-הפרוקסימלי חלבונים<em&gt; במבחנה</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

SorLA and CLC:CLF-1-dependent Downregulation of CNTFR&#945; as Demonstrated by Western Blotting, Inhibition of Lysosomal Enzymes, and Immunocytochemistry

SorLA and CLC:CLF-1-dependent Downregulation of CNTFRÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â± as Demonstrated by Western Blotting, Inhibition of Lysosomal Enzymes, and Immunocytochemistry

SorLA ו CLC: downregulation CLF-1-תלוי של CNTFRα כפי שהוכח על ידי המערב סופג, עיכוב של ליזוזומלית אנזימים, ו Immunocytochemistry

The heterodimeric cytokine Cardiotrophin-like Cytokine:Cytokine-like Factor-1 (CLC:CLF-1) targets the glycosylphosphatidylinositol (GPI)-anchored ...

Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging (cPILOT)

Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging cPILOT

לדוגמא ריבוב של רקמות משופרת שימוש משולב מבשר איזוטופים תיוג ו Isobaric תיוג (cPILOT)

There is an increasing demand to analyze many biological samples for disease understanding and biomarker discovery. Quantitative proteomics strategies ...

A Western Blotting Protocol for Small Numbers of Hematopoietic Stem Cells

מערבון סופג פרוטוקול עבור מספר קטן של תאי גזע Hematopoietic

Hematopoietic stem cells (HSCs) are rare cells, with the mouse bone marrow containing only ~25,000 phenotypic long term repopulating HSCs. A Western ...

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis (QDB)

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis QDB

תפוקה גבוהה, נחישות מוחלטת של התוכן של חלבון שנבחר ברמות רקמות באמצעות נקודה כמותיים כתם ניתוח (QDB)

Lacking a convenient, quantitative, high throughput immunoblot method for absolute determination of the content of a specific protein at cellular and ...

A11-positive &#946;-amyloid Oligomer Preparation and Assessment Using Dot Blotting Analysis

A11-positive ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-amyloid Oligomer Preparation and Assessment Using Dot Blotting Analysis

הכנה A11-חיוביות β-עמילואיד אוליגומר והערכה באמצעות נקודה סופג ניתוח

&#946;-amyloid (A&#946;) is a hydrophobic peptide with an intrinsic tendency to self-assemble into aggregates. Among various aggregates, A&#946; oligomer ...

Identification of Functional Protein Regions Through Chimeric Protein Construction

זיהוי של חלבון פונקציונלי אזורים באמצעות חלבון Chimeric בנייה

The goal of this protocol encompasses the design of chimeric proteins in which distinct regions of a protein are replaced by their corresponding sequences ...

Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein

אפיון ברמה המולקולרית באמצעות גישות ביוכימיות איתנות של חלבון קינאז חדש

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important ...