Name: robust comparison of protein levels across tissues and throughout development using standardized quantitative western blotting
Uploaded: 2019-04-09T15:00:00
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E.J.N.G. è supportato dal Wellcome Trust (grant 106098/Z/14/Z). Altri finanziamenti è stato fornito dal Trust SMA (SMA UK Consorzio; T.H.G. & Y-T. H.), SMA Europa (Tarantino, D.v.D.H. ed E.J.N.G.), il DTP di Università di Edimburgo in precisione medicina (T.H.G., L.L. & A.M.M.) e il centro di Euan MacDonald per ricerca di malattia del motoneurone (Tarantino).

Tessuti per questa procedura sono stati ottenuti dagli studi sugli animali che sono stati approvati dal comitato etico interno all'Università di Edimburgo e sono stati eseguiti in concordanza con istituzionali e normative UK Home Office sotto l'autorità dei pertinenti personali e licenze di progetto.
Nota: Questo protocollo è stato ottimizzato utilizzando standardizzati, disponibili in commercio kit e reagenti per incrementare la riproducibilità (Vedi Tabella materiali).</...

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	<li>Bertoni, T. A., Perenha-Viana, M. C., Patussi, E. V., Cardoso, R. F., Svidzinski, T. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western+blotting+is+an+efficient+tool+for+differential+diagnosis+of+paracoccidioidomycosis+and+pulmonary+tuberculosis.">Western blotting is an efficient tool for differential diagnosis of paracoccidioidomycosis and pulmonary tuberculosis.</a> Clinical and Vaccine Immunology. 19 (11), 1887-1888 (2012).</li><li>Hutchinson, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Costs+and+outcomes+of+laboratory+diagnostic+algorithms+for+the+detection+of+HIV.">Costs and outcomes of laboratory diagnostic algorithms for the detection of HIV.</a> Journal of Clinical Virology. 58 Suppl 1, (2013).</li><li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets:+procedure+and+some+applications.">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li><li>Eaton, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+protein+analysis+as+a+reliable+loading+control+for+quantitative+fluorescent+Western+blotting.">Total protein analysis as a reliable loading control for quantitative fluorescent Western blotting.</a> PloS One. 8 (8), e72457 (2013).</li><li>Ghosh, R., Gilda, J. E., Gomes, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+necessity+of+and+strategies+for+improving+confidence+in+the+accuracy+of+western+blots.">The necessity of and strategies for improving confidence in the accuracy of western blots.</a> Expert Rev Proteomics. 11 (5), 549-560 (2014).</li><li>Jensen, B. C., Swigart, P. M., Simpson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ten+commercial+antibodies+for+alpha-1-adrenergic+receptor+subtypes+are+nonspecific.">Ten commercial antibodies for alpha-1-adrenergic receptor subtypes are nonspecific.</a> Naunyn-Schmiedebergs Archives of Pharmacology. 379 (4), 409-412 (2009).</li><li>Jositsch, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suitability+of+muscarinic+acetylcholine+receptor+antibodies+for+immunohistochemistry+evaluated+on+tissue+sections+of+receptor+gene-deficient+mice.">Suitability of muscarinic acetylcholine receptor antibodies for immunohistochemistry evaluated on tissue sections of receptor gene-deficient mice.</a> Naunyn-Schmiedebergs Archives of Pharmacology. 379 (4), 389-395 (2009).</li><li>Smejkal, G., Gallagher, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+semidry+protein+transfer+efficiency+with+transverse+gradient+gel+electrophoresis.">Determination of semidry protein transfer efficiency with transverse gradient gel electrophoresis.</a> Biotechniques. 16 (2), (1994).</li><li>Eaton, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+modern+quantitative+fluorescent+western+blotting+with+troubleshooting+strategies.">A guide to modern quantitative fluorescent western blotting with troubleshooting strategies.</a> Journal of Visualized Experiments. (93), e52099 (2014).</li><li>Hunter, G., Roche, S. L., Somers, E., Fuller, H. R., Gillingwater, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+storage+parameters+on+measurement+of+survival+motor+neuron+(SMN)+protein+levels:+implications+for+pre-clinical+studies+and+clinical+trials+for+spinal+muscular+atrophy.">The influence of storage parameters on measurement of survival motor neuron (SMN) protein levels: implications for pre-clinical studies and clinical trials for spinal muscular atrophy.</a> Neuromuscular Disorders. 24 (11), 973-977 (2014).</li><li>Fosang, A. J., Colbran, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transparency+Is+the+Key+to+Quality.">Transparency Is the Key to Quality.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (50), 29692-29694 (2015).</li><li>Taylor, S. C., Berkelman, T., Yadav, G., Hammond, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+defined+methodology+for+reliable+quantification+of+Western+blot+data.">A defined methodology for reliable quantification of Western blot data.</a> Molecular Biotechnology. 55 (3), 217-226 (2013).</li><li>Goasdoue, K., Awabdy, D., Bjorkman, S. T., Miller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standard+loading+controls+are+not+reliable+for+Western+blot+quantification+across+brain+development+or+in+pathological+conditions.">Standard loading controls are not reliable for Western blot quantification across brain development or in pathological conditions.</a> Electrophoresis. 37 (4), 630-634 (2016).</li><li>Rocha-Martins, M., Njaine, B., Silveira, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avoiding+pitfalls+of+internal+controls:+validation+of+reference+genes+for+analysis+by+qRT-PCR+and+Western+blot+throughout+rat+retinal+development.">Avoiding pitfalls of internal controls: validation of reference genes for analysis by qRT-PCR and Western blot throughout rat retinal development.</a> PloS One. 7 (8), e43028 (2012).</li><li>Aghamaleky Sarvestany, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+quantitative+proteomic+profiling+identifies+disruption+of+ubiquitin+homeostasis+as+a+key+driver+of+Schwann+cell+defects+in+spinal+muscular+atrophy.">Label-free quantitative proteomic profiling identifies disruption of ubiquitin homeostasis as a key driver of Schwann cell defects in spinal muscular atrophy.</a> Journal of Proteome Research. 13 (11), 4546-4557 (2014).</li><li>Fuller, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+Muscular+Atrophy+Patient+iPSC-Derived+Motor+Neurons+Have+Reduced+Expression+of+Proteins+Important+in+Neuronal+Development.">Spinal Muscular Atrophy Patient iPSC-Derived Motor Neurons Have Reduced Expression of Proteins Important in Neuronal Development.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 506 (2015).</li><li>Liu, N. K., Xu, X. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=beta-tubulin+is+a+more+suitable+internal+control+than+beta-actin+in+western+blot+analysis+of+spinal+cord+tissues+after+traumatic+injury.">beta-tubulin is a more suitable internal control than beta-actin in western blot analysis of spinal cord tissues after traumatic injury.</a> Journal of Neurotrauma. 23 (12), 1794-1801 (2006).</li><li>Moritz, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tubulin+or+Not+Tubulin:+Heading+Toward+Total+Protein+Staining+as+Loading+Control+in+Western+Blots.">Tubulin or Not Tubulin: Heading Toward Total Protein Staining as Loading Control in Western Blots.</a> Proteomics. 17 (20), (2017).</li><li>Groen, E. J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+and+tissue-specific+variability+of+SMN+protein+levels+in+mouse+models+of+spinal+muscular+atrophy.">Temporal and tissue-specific variability of SMN protein levels in mouse models of spinal muscular atrophy.</a> Human Molecular Genetics. 27 (16), 2851-2862 (2018).</li><li>Chaytow, H., Huang, Y. T., Gillingwater, T. H., Faller, K. M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+survival+motor+neuron+protein+(SMN)+in+protein+homeostasis.">The role of survival motor neuron protein (SMN) in protein homeostasis.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. , (2018).</li><li>Groen, E. J. N., Talbot, K., Gillingwater, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+therapy+for+spinal+muscular+atrophy:+promises+and+challenges.">Advances in therapy for spinal muscular atrophy: promises and challenges.</a> Nature Reviews: Neurology. 14 (4), 214-224 (2018).</li><li>Fitzmaurice, G. M., Laird, N. M., Ware, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Applied longitudinal analysis. , (2004).</li><li>Jordan, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Population+sampling+affects+pseudoreplication.">Population sampling affects pseudoreplication.</a> PLoS Biology. 16 (10), e2007054 (2018).</li><li>LaFauci, G., Adayev, T., Kascsak, R., Brown, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+Quantification+of+the+Fragile+X+Mental+Retardation+Protein+1+(FMRP).">Detection and Quantification of the Fragile X Mental Retardation Protein 1 (FMRP).</a> Genes (Basel). 7 (12), (2016).</li></ol>

Con il disegno sperimentale appropriato, misure di controllo e analisi statistica, macchiarsi occidentale può essere utilizzato per rendere affidabili stime quantitative dell'espressione della proteina all'interno e tra una vasta gamma di campioni biologici. Il protocollo che descriviamo nel manoscritto attuale mira a servire come una guida per i ricercatori cercano di utilizzare Western blotting per intraprendere analisi quantitativa tra i più grandi e complessi gruppi di campioni, utilizzando una combinazione di fluo...

Macchiarsi occidentale è una tecnica comunemente utilizzata per rilevare e quantificare l'espressione della proteina, compreso in omogenati o estratti. Nel corso degli anni, questa tecnica ha portato a molti progressi nella ricerca clinica e di base, dove può essere utilizzato come strumento diagnostico per identificare la presenza di malattia1,2. Macchiarsi occidentale in primo luogo è stato descritto nel 1979 come un metodo per trasferire proteine dal gel di poliacrilammide ai fogli di nitrocellulosa e successivamente visualizzare proteine usando anticorpi secondari che sono stati etichettati radioattivo o coniugati con fluoresceina o perossidasi3. Attraverso lo sviluppo di kit commercialmente disponibili e attrezzature, metodi macchiantesi occidentali sono stati sempre più standardizzati e semplificati nel corso degli anni. Infatti, la tecnica viene eseguita prontamente dagli scienziati con diversi sfondi e livelli di esperienza. Tuttavia, come con molte tecniche sperimentali simili, l'esito delle analisi Western blot è facilmente influenzato dalla scelte operate nella progettazione e nell'esecuzione dell'esperimento. È importante, pertanto, che l'accessibilità dei metodi standardizzati di macchiantesi occidentali non oscurare la necessità di un'attenta pianificazione sperimentale e il design. Considerazioni sperimentali includono, ma non sono limitata a, campione di preparazione e movimentazione, selezione e convalida degli anticorpi per la rilevazione di proteine ed efficienza del trasferimento di gel alla membrana di particolarmente piccole o grandi (< 10 o > 140 kDa) proteine4,5,6,7,8,9. Qualità delle proteine del campione originale svolge un ruolo significativo nel determinare l'esito dell'analisi Western blot successivi. Come la proteina può essere estratta da una vasta gamma di campioni e fonti, tra cui linee cellulari, tessuti dai modelli animali e tessuti umani post mortem, coerenza nel trattamento e l'elaborazione è necessaria per ottenere risultati riproducibili. Ad esempio, quando a lungo termine conservazione dei campioni per l'estrazione proteica è necessaria, è importante rendersi conto che, anche se la proteina è generalmente stabile a-80 ° C, sono state differenze nella stabilità proteica proteine estratte e tessuti intatti a-80 ° C riferito10. Inoltre, per ottenere preventivi riproducibile di quantità di proteina, coerente omogeneizzazione dei campioni è fondamentale. Ottimizzazione del buffer di lisi diverse e metodi di omogeneizzazione (ad es., manuale omogeneizzazione rispetto ai metodi automatizzati) può essere richiesto prima di iniziare un esperimento su larga scala quantitativo.
Strategie di normalizzazione per correggere la variabilità di caricamento e quantificazione di proteine sono essenziali per ottenere risultati quantitativi, robusti dell'espressione della proteina. Servizio pulizie proteine come β-actina, α-tubulina e β-tubulina gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi (GAPDH) sono stati tradizionalmente utilizzati per normalizzare i livelli di proteina per la quantificazione. Tuttavia, normalizzazione alle proteine di pulizia specifico per scopi di quantificazione è stato sempre più criticato negli ultimi pochi anni11,12. Ad esempio, l'espressione di proteine le pulizie può cambiare nei diversi stadi di sviluppo13,14, attraverso i tessuti da stesso animale4e sotto varie malattia condizioni4,15 ,16,17. Pertanto, l'uso di proteine specifiche delle pulizie limita le possibilità di fare confronti più complessi tra l'espressione della proteina dai tessuti differenti, timepoints diversi e in diverse condizioni sperimentali. Un'alternativa alle proteine di pulizia al controllo per proteina variazione di carico è l'uso di una macchia di proteine totali (TPS) che le etichette e Visualizza tutte le proteine presenti in un campione. TPS permette la normalizzazione del segnale basato su carico proteico totale, piuttosto che i livelli di una proteina specifica e pertanto la quantificazione del segnale TPS dovrebbero essere comparabili e riproducibile indipendentemente dalla condizione sperimentale, tipo di campione o timepoint inerente allo sviluppo . Sono esempi di proteine totali macchie Ponceau S, gel senza macchia, Coomassie R-350, Sypro Ruby, Epicocconone, Amydo Black e Cy5 (rivisto in rif. 18). Ciascuno di questi metodi presenta specifici vantaggi e limitazioni e selezione del metodo dipende il tempo e gli strumenti disponibili, nonché la messa a punto sperimentale4,18.
Oltre a utilizzare un TPS per correggere per il carico all'interno della membrana e variabilità di quantificazione, può essere necessario confrontare campioni tra diverse membrane, in particolare quando si eseguono analisi di espressione di proteine su larga scala. Tuttavia, variabilità in fattori come anticorpo associazione efficienza e totale intensità di colorazione di proteina possono introdurre ulteriori variabilità tra i campioni della proteina che sono analizzati su gel separati e membrane. Per quantificazione solida in questa situazione, è pertanto necessario introdurre un ulteriore passo di normalizzazione per rappresentare la variabilità tra membrana. Ciò può essere ottenuto includendo uno standard interno carico su ciascuna delle membrane separatamente analizzate che viene mantenuta costante attraverso esperimenti. Questo standard può assumere la forma di qualsiasi proteina lisata che possono essere ottenuti in quantità sufficienti per essere utilizzati in tutte le membrane incluse nell'esperimento. Qui, usiamo un lisato di cervello di topo (ottenuto da topi di controllo 5 giorno vecchio), come cervello prontamente è omogeneizzato e il lisato proteico ottenuta contiene una notevole quantità di proteina ad un'alta concentrazione. Caricamento di uno standard interno in triplice copia permette campioni su membrane separate essere normalizzato e confrontato direttamente.
Qui, descriviamo un protocollo dettagliato che abbiamo sviluppato ci permettono di intraprendere confronti complessi della variazione di espressione di proteine in tessuti differenti, modelli murini (inclusi modelli di malattia) e punti temporali dello sviluppo19. Combinando un TPS fluorescente con l'utilizzo di un carico interno standard, siamo stati in grado di superare i limiti esistenti il numero di campioni e condizioni sperimentali che possono essere paragonate all'interno di un singolo esperimento. Questo approccio consente di espandere l'uso di tecniche tradizionali Western blot, consentendo ai ricercatori di esplorare meglio l'espressione della proteina attraverso campioni e tessuti differenti.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Fine Tipped Gel Loading Tips</td>
			<td>Alpha Laboratories</td>
			<td>GL20057SNTL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halt Protease Inhibitor Cocktail, EDTA-free 100x 5mL</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>78437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Handheld homogeniser&#160;</td>
			<td>VWR Collection</td>
			<td>431-0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iBlot 2 Gel Transfer Device</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>IB21001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iBlot Transfer Stack, PVDF, regular size</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>IB401031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Studio Lite</td>
			<td>Licor</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Free download from https://www.licor.com/bio/products/software/image_studio_lite/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 800CW secondary antibodies</td>
			<td>Licor</td>
			<td>--</td>
			<td>Select appropriate secondary antibody that is specific against host of primary antibody.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Novex Sharp Pre-stained Protein Standard</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>LC5800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15-well</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>NP0323BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE LDS Sample Buffer (4X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>NP0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE MOPS SDS Running Buffer (20X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>NP0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey Blocking Buffer</td>
			<td>Licor</td>
			<td>927-40000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Mouse anti-SMN (survival motor neuron) monoclonal antibody</td>
			<td>BD Transduction Laboratories</td>
			<td>610646</td>
			<td>Is used extensively in the SMN/SMA literature and gives consistent results regardsless of lot number</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REVERT Total Protein Stain, 250 mL&#160;</td>
			<td>Licor</td>
			<td>926-11021&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REVERT Wash Solution&#160;</td>
			<td>Licor</td>
			<td>926-11012&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA Lysis and Extraction Buffer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>89900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XCell&#160;SureLock Mini-Cell</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>EI0001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

robust comparison of protein levels across tissues and throughout development using standardized quantitative western blotting

Macchiarsi occidentale è una tecnica comunemente utilizzata per rilevare e quantificare l'espressione della proteina. Nel corso degli anni, questa tecnica ha portato a molti progressi nella ricerca clinica e di base. Tuttavia, come con molte tecniche sperimentali simili, l'esito delle analisi Western blot è facilmente influenzato dalla scelte operate nella progettazione e nell'esecuzione dell'esperimento. Proteine specifiche delle pulizie sono stati tradizionalmente usati per normalizzare i livelli di proteina per la quantificazione, tuttavia, questi hanno una serie di limitazioni e di conseguenza sono stati criticati sempre più negli ultimi anni. Qui, descriviamo un protocollo dettagliato che abbiamo sviluppato ci permettono di intraprendere confronti complessi della variazione di espressione di proteine in tessuti differenti, modelli murini (inclusi modelli di malattia) e punti temporali inerente allo sviluppo. Usando una macchia fluorescente della proteina totale e introducendo l'uso di un carico interno standard, è possibile superare le attuali limitazioni del numero di campioni che possono essere paragonati all'interno di esperimenti e confrontare sistematicamente i livelli della proteina attraverso un gamma di condizioni sperimentali. Questo approccio consente di espandere l'uso di tecniche tradizionali occidentali della macchia, consentendo ai ricercatori di esplorare meglio l'espressione della proteina attraverso campioni e tessuti differenti.

Ci sono esempi dell'uso di TPS e uno standard interno per facilitare i confronti dei livelli della proteina attraverso tessuti e intervalli di tempo. Figura 1 Mostra i risultati da Western blotting su proteine estratte da tessuti ottenuti da neonatale (postnatale giorno 5) rispetto ai topi adulti (10 - settimana vecchi). TPS e immunoblot Smn sono mostrati in Figura 1A, C. Quantificazione dell'intensità di fluore...

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Robust Comparison of Protein Levels Across Tissues and Throughout Development Using Standardized Quantitative Western Blotting

Questo metodo viene descritto un approccio affidabile e riproducibile per il confronto dei livelli della proteina in tessuti differenti e timepoints inerente allo sviluppo diversi utilizzando un approccio macchiante occidentale quantitativo standardizzato.

Robusto confronto dei livelli della proteina attraverso tessuti e sviluppo utilizzando standardizzati quantitativa Western Blotting

Western blotting is a technique that is commonly used to detect and quantify protein expression. Over the years, this technique has led to many advances ...

Questo protocollo può essere utilizzato per affrontare importanti questioni nella ricerca fondamentale e clinica esaminando l'espressione proteica tra diversi tessuti e punti di tempo. Per eseguire un blotting quantitativo occidentale affidabile, combiniamo una macchia proteica totale fluorescente con un controllo interno del carico. Ciò supera i limiti che sorgono quando si confrontano vari tessuti in condizioni sperimentali.Per estrarre proteine da campioni di cellule o tessuti congelati a scatto, scongelare i campioni di meno 80 gradi sul ghiaccio prima di lavare i campioni a seconda dei casi, secondo la tabella. Utilizzando un omogeneizzatore elettrico portatile con un pestello in polipropilene, omogeneizzare i campioni lavati, risciacquando il pestello in acqua doppia distillata e asciugandosi con un tessuto pulito tra i campioni. Lasciare i campioni sul ghiaccio per 10 minuti, seguiti da centrifugazione.Quindi, trasferire il supernatante contenente campioni proteici in un nuovo tubo sul ghiaccio senza disturbare il pellet. Per quantificare la concentrazione proteica, stabilire norme per l'albumina del siero bovino a concentrazioni crescenti in triplice copia e aggiungere un microliter di ciascun campione proteico in duplice copia ai pozzi appropriati di una piastra ottica a 96 pozzetti. Incubare la proteina su un blocco termico di 60 gradi Celsius per 10 minuti o più se si prevede che la concentrazione proteica sia bassa e misurare l'assorbimento a 560 nanometri su un lettore di piastre.Esportare le misurazioni del lettore di lastre e calcolare la concentrazione proteica confrontando i valori medi di assorbanza di ciascun campione con una curva standard ottenuta utilizzando lo standard proteico. Per normalizzare la quantità di proteine, preparare le diluizioni dei campioni proteici nel tampone del campione e nell'acqua ultra pura e incubare i campioni in un blocco di calore di 70 gradi Celsius per 10 minuti. Quindi, posizionare i campioni sul ghiaccio prima di vortice e centrifugare brevemente.Per l'elettroforesi, impostare un gel gradiente prefabbricato da quattro a 12%Bis-Tris nel sistema a camera di elettroforesi in gel e caricare 3,5 microlitri di uno standard proteico nel pozzo. Quando si utilizza uno standard interno per la normalizzazione tra membrane, caricare una quantità uguale agli altri campioni nei primi tre pozzi accanto alla scala proteica e caricare 30 microgrammi di ogni campione nei pozzi rimanenti. Quindi, eseguire i campioni attraverso il gel impilamento a 80 volt per 10 minuti seguito da 150 volt per altri 45-60 minuti.Al termine dell'elettroforesi, per assemblare la pila di trasferimento, posizionare il gel proteico sulla pila inferiore contenente la membrana di difluoruro di polivinilidene seguita dalla carta filtrante. Utilizzare il rullo di soffiatura per rimuovere eventuali bolle d'aria e posizionare la pila superiore sulla parte superiore della carta filtrante prima di far rotolare di nuovo la pila per rimuovere le bolle d'aria. Trasferire l'intera pila nel dispositivo di trasferimento con l'elettrodo sul lato sinistro del dispositivo e posizionare la spugna di gel sopra la pila in modo che la spugna sia allineata con i corrispondenti contatti elettrici sul dispositivo.Dopo aver chiuso il coperchio, selezionare e avviare il programma appropriato. Alla fine del programma, tagliare la membrana alle dimensioni del gel e lavare rapidamente la membrana tagliata con acqua doppia distillata prima di continuare con la macchia proteica totale. Per la colorazione proteica totale, arrotolare la membrana in un tubo da 50 millilitri con il lato proteico rivolto verso l'interno ed etichettare la membrana con cinque millilitri di soluzione proteica su un rullo per cinque minuti a temperatura ambiente in una cappa aspirante.Al termine dell'incubazione, lavare rapidamente la membrana con cinque millilitri di soluzione di lavaggio, restituendo brevemente il tubo al rullo tra i lavaggi, seguito da un breve risciacquo con acqua ultra pura. Aggiungere tre millilitri di tampone di blocco alla membrana e riportare la membrana sul rullo per 30 minuti a temperatura ambiente. Sostituire il tampone di blocco con l'anticorpo primario di interesse alla concentrazione ottimizzata appropriata e incubare la membrana sul rullo durante la notte a quattro gradi Celsius.Il giorno successivo, lavare la membrana sei volte per cinque minuti con cinque millilitri di PBS fresco per lavaggio sul rullo a temperatura ambiente. Dopo l'ultimo lavaggio, incubare la membrana con l'appropriata soluzione anticorpale secondaria sul rullo per un'ora a temperatura ambiente seguita da tre lavaggi per 30 minuti per lavaggio. Dopo l'ultimo lavaggio, asciugare la membrana e utilizzare un foglio di alluminio per mantenere la membrana protetta dalla luce.Per l'acquisizione dell'immagine, posizionare la membrana sullo scanner con il lato proteico rivolto verso il basso e selezionare l'area di scansione nel software. Quindi, acquisire immagini in entrambi i canali ed esportare le immagini in un programma di analisi delle immagini appropriato. Visualizzate il canale di 700 nanometri per visualizzare il risultato totale della colorazione delle proteine e selezionate Analisi (Select Analysis) e Disegna rettangolo (Draw Rectangle) per definire l'area di interesse per la normalizzazione.Quindi, copiare e incollare la prima area rettangolare in ogni singolo campione per assicurarsi che l'area definita sia della stessa dimensione per tutte le corsie analizzate. Per quantificare la concentrazione proteica in ogni corsia, copiare i risultati sia dalla macchia proteica totale che dalla proteina di interesse in un programma di foglio di calcolo e determinare il segnale di macchia proteica totale più alto. Quindi, dividere ogni valore totale del segnale di macchia proteica per questo valore per ottenere il valore di carico delle proteine normalizzate e dividere il valore del segnale di 800 nanometri da ogni singolo campione per il corrispondente valore proteico normalizzato per calcolare il rapporto di espressione proteica relativa in diversi campioni.In queste macchie occidentali rappresentative, le proteine estratte dai tessuti ottenuti dai topi del quinto giorno post-natale vengono confrontate con le proteine estratte da topi adulti di 10 settimane. La quantificazione dell'intensità di fluorescenza della macchia proteica totale è stata ottenuta misurando l'intensità della fluorescenza all'interno della scatola rettangolare su ogni corsia. Quando vengono analizzate intere corsie, l'intensità della fluorescenza rimane relativamente simile tra i campioni, indicando che l'uso della macchia proteica totale per la normalizzazione è adatto a questo scopo.La macchia proteica totale fluorescente può anche essere utilizzata per confrontare i livelli proteici in diversi punti di tempo di sviluppo. Ad esempio, sebbene i livelli di proteine dei motoneuroni di sopravvivenza diminuiscano chiaramente con l'età nei topi, la quantificazione totale macchiata di proteine rimane costante. L'uso di standard interni, normalizzazione basata sulla fluorescenza e statistiche adeguate aumenta la robustezza dell'analisi complessa dell'espressione proteica in diverse condizioni.Questo protocollo si aggiunge alle tradizionali tecniche western blot, superando i problemi di controlli di carico appropriati e confronti tra lotti sperimentali e fornendo flessibilità per l'analisi dell'espressione proteica. Questo approccio può essere esteso al confronto dell'espressione proteica in altre condizioni sperimentali.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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Ricerca

Biochimica

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