Name: robust comparison of protein levels across tissues and throughout development using standardized quantitative western blotting
Uploaded: 2019-04-09T15:00:00
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E.J.N.G.는 Wellcome 트러스트 (그랜트 106098/Z/14/Z)에 의해 지원 됩니다. SMA 신뢰 (SMA 영국 컨소시엄;에 의해 제공 된 다른 자금 T.H.G. & Y-T H.), SMA 유럽 (T.H.G, D.v.D.H. 및 E.J.N.G.), 정밀 의학 (T.H.G., L.L. & A.M.M.)에 딘 버 러의 대학 DTP 및 모터 신경 질병 연구 (T.H.G)에 대 한 이완 맥도날드 센터.

이 절차에 대 한 조직 내부 윤리 위원회에 딘 버 러의 대학에 의해 승인 된 기관으로 색인 및 관련 된 권위 아래 영국 홈 오피스 규정에서 동물 연구에서 가져온 개인 라이센스 프로젝트.
참고:이 프로토콜 최적화 된 표준, 상용 장비와 시 약을 사용 하 여 재현성을 증가 하기 위하여 ( 재료의 표참조).
1입니다. 샘플의 준비
<ol><li>
단백질...

<ol>
	<li>Bertoni, T. A., Perenha-Viana, M. C., Patussi, E. V., Cardoso, R. F., Svidzinski, T. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western+blotting+is+an+efficient+tool+for+differential+diagnosis+of+paracoccidioidomycosis+and+pulmonary+tuberculosis.">Western blotting is an efficient tool for differential diagnosis of paracoccidioidomycosis and pulmonary tuberculosis.</a> Clinical and Vaccine Immunology. 19 (11), 1887-1888 (2012).</li><li>Hutchinson, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Costs+and+outcomes+of+laboratory+diagnostic+algorithms+for+the+detection+of+HIV.">Costs and outcomes of laboratory diagnostic algorithms for the detection of HIV.</a> Journal of Clinical Virology. 58 Suppl 1, (2013).</li><li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets:+procedure+and+some+applications.">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li><li>Eaton, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+protein+analysis+as+a+reliable+loading+control+for+quantitative+fluorescent+Western+blotting.">Total protein analysis as a reliable loading control for quantitative fluorescent Western blotting.</a> PloS One. 8 (8), e72457 (2013).</li><li>Ghosh, R., Gilda, J. E., Gomes, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+necessity+of+and+strategies+for+improving+confidence+in+the+accuracy+of+western+blots.">The necessity of and strategies for improving confidence in the accuracy of western blots.</a> Expert Rev Proteomics. 11 (5), 549-560 (2014).</li><li>Jensen, B. C., Swigart, P. M., Simpson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ten+commercial+antibodies+for+alpha-1-adrenergic+receptor+subtypes+are+nonspecific.">Ten commercial antibodies for alpha-1-adrenergic receptor subtypes are nonspecific.</a> Naunyn-Schmiedebergs Archives of Pharmacology. 379 (4), 409-412 (2009).</li><li>Jositsch, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suitability+of+muscarinic+acetylcholine+receptor+antibodies+for+immunohistochemistry+evaluated+on+tissue+sections+of+receptor+gene-deficient+mice.">Suitability of muscarinic acetylcholine receptor antibodies for immunohistochemistry evaluated on tissue sections of receptor gene-deficient mice.</a> Naunyn-Schmiedebergs Archives of Pharmacology. 379 (4), 389-395 (2009).</li><li>Smejkal, G., Gallagher, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+semidry+protein+transfer+efficiency+with+transverse+gradient+gel+electrophoresis.">Determination of semidry protein transfer efficiency with transverse gradient gel electrophoresis.</a> Biotechniques. 16 (2), (1994).</li><li>Eaton, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+modern+quantitative+fluorescent+western+blotting+with+troubleshooting+strategies.">A guide to modern quantitative fluorescent western blotting with troubleshooting strategies.</a> Journal of Visualized Experiments. (93), e52099 (2014).</li><li>Hunter, G., Roche, S. L., Somers, E., Fuller, H. R., Gillingwater, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+storage+parameters+on+measurement+of+survival+motor+neuron+(SMN)+protein+levels:+implications+for+pre-clinical+studies+and+clinical+trials+for+spinal+muscular+atrophy.">The influence of storage parameters on measurement of survival motor neuron (SMN) protein levels: implications for pre-clinical studies and clinical trials for spinal muscular atrophy.</a> Neuromuscular Disorders. 24 (11), 973-977 (2014).</li><li>Fosang, A. J., Colbran, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transparency+Is+the+Key+to+Quality.">Transparency Is the Key to Quality.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (50), 29692-29694 (2015).</li><li>Taylor, S. C., Berkelman, T., Yadav, G., Hammond, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+defined+methodology+for+reliable+quantification+of+Western+blot+data.">A defined methodology for reliable quantification of Western blot data.</a> Molecular Biotechnology. 55 (3), 217-226 (2013).</li><li>Goasdoue, K., Awabdy, D., Bjorkman, S. T., Miller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standard+loading+controls+are+not+reliable+for+Western+blot+quantification+across+brain+development+or+in+pathological+conditions.">Standard loading controls are not reliable for Western blot quantification across brain development or in pathological conditions.</a> Electrophoresis. 37 (4), 630-634 (2016).</li><li>Rocha-Martins, M., Njaine, B., Silveira, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avoiding+pitfalls+of+internal+controls:+validation+of+reference+genes+for+analysis+by+qRT-PCR+and+Western+blot+throughout+rat+retinal+development.">Avoiding pitfalls of internal controls: validation of reference genes for analysis by qRT-PCR and Western blot throughout rat retinal development.</a> PloS One. 7 (8), e43028 (2012).</li><li>Aghamaleky Sarvestany, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+quantitative+proteomic+profiling+identifies+disruption+of+ubiquitin+homeostasis+as+a+key+driver+of+Schwann+cell+defects+in+spinal+muscular+atrophy.">Label-free quantitative proteomic profiling identifies disruption of ubiquitin homeostasis as a key driver of Schwann cell defects in spinal muscular atrophy.</a> Journal of Proteome Research. 13 (11), 4546-4557 (2014).</li><li>Fuller, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+Muscular+Atrophy+Patient+iPSC-Derived+Motor+Neurons+Have+Reduced+Expression+of+Proteins+Important+in+Neuronal+Development.">Spinal Muscular Atrophy Patient iPSC-Derived Motor Neurons Have Reduced Expression of Proteins Important in Neuronal Development.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 506 (2015).</li><li>Liu, N. K., Xu, X. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=beta-tubulin+is+a+more+suitable+internal+control+than+beta-actin+in+western+blot+analysis+of+spinal+cord+tissues+after+traumatic+injury.">beta-tubulin is a more suitable internal control than beta-actin in western blot analysis of spinal cord tissues after traumatic injury.</a> Journal of Neurotrauma. 23 (12), 1794-1801 (2006).</li><li>Moritz, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tubulin+or+Not+Tubulin:+Heading+Toward+Total+Protein+Staining+as+Loading+Control+in+Western+Blots.">Tubulin or Not Tubulin: Heading Toward Total Protein Staining as Loading Control in Western Blots.</a> Proteomics. 17 (20), (2017).</li><li>Groen, E. J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+and+tissue-specific+variability+of+SMN+protein+levels+in+mouse+models+of+spinal+muscular+atrophy.">Temporal and tissue-specific variability of SMN protein levels in mouse models of spinal muscular atrophy.</a> Human Molecular Genetics. 27 (16), 2851-2862 (2018).</li><li>Chaytow, H., Huang, Y. T., Gillingwater, T. H., Faller, K. M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+survival+motor+neuron+protein+(SMN)+in+protein+homeostasis.">The role of survival motor neuron protein (SMN) in protein homeostasis.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. , (2018).</li><li>Groen, E. J. N., Talbot, K., Gillingwater, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+therapy+for+spinal+muscular+atrophy:+promises+and+challenges.">Advances in therapy for spinal muscular atrophy: promises and challenges.</a> Nature Reviews: Neurology. 14 (4), 214-224 (2018).</li><li>Fitzmaurice, G. M., Laird, N. M., Ware, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Applied longitudinal analysis. , (2004).</li><li>Jordan, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Population+sampling+affects+pseudoreplication.">Population sampling affects pseudoreplication.</a> PLoS Biology. 16 (10), e2007054 (2018).</li><li>LaFauci, G., Adayev, T., Kascsak, R., Brown, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+Quantification+of+the+Fragile+X+Mental+Retardation+Protein+1+(FMRP).">Detection and Quantification of the Fragile X Mental Retardation Protein 1 (FMRP).</a> Genes (Basel). 7 (12), (2016).</li></ol>

적절 한 실험 설계, 제어 측정 및 통계 분석, 서쪽 더 럽 히는 단백질 식 및 생물 학적 샘플의 다양 한 범위 사이 신뢰할 수 있는 양적 견적을 사용할 수 있습니다. 우리는 현재 원고에서 설명 하는 프로토콜 형광 기반의 조합을 사용 하 여 샘플, 더 크고 복잡 한 그룹 전체 정량 분석을 수행을 더럽혀 서 사용 하고자 하는 연구자에 대 한 지침 서 역할을 목표로합니다 탐지 방법, 총 단백질 로딩 정규?...

서 부 럽 일반적으로 감지 단백질 표정, 조직 homogenates 또는 추출 물 등을 계량 하는 데 사용 되는 기술입니다. 년 동안,이 기술을 주도하 고 있다 기본 및 임상 연구에 많은 발전을 그것은 사용할 수 있는 진단 도구로 질병1,2의 존재를 확인 하. 서 부 럽 처음에 설명 되었다 1979 니트로 시트 polyacrylamide 젤에서 단백질을 전송 후 했다 방사성으로 분류 하거나 fluorescein에 활용 된 이차 항 체를 사용 하 여 단백질을 시각화 하는 방법으로 또는 과산화 효소3. 상용 장비 및 장비 개발을 통해 서쪽 더 럽 히 방법은 점점 표준화 하 고 되었습니다 년간 단순화. 실제로, 기술은 다양 한 배경과 경험의 수준의 과학자 들에 의해 쉽게 수행 이제 됩니다. 그러나, 많은 유사한 실험 기법, 것과 같이 서쪽 오 점 분석의 결과 쉽게 영향을 설계 및 실험의 실행에서 만든 선택. 그것은 중요 한, 그러므로, 표준화 된 서쪽 더 럽 히 메서드의 액세스 가능성 모호한 실험 계획에 대 한 필요성 및 디자인 하지 않습니다. 실험적인 고려 사항 포함, 하지만 제한, 샘플 준비 및 처리, 선택 및 단백질 검출을 위한 항 체의 유효성 검사 및 특히 소형 또는 대형의 젤 막 전송 효율 (< 10 또는 > 140 kDa) 단백질4,,56,7,,89. 원래 샘플의 단백질 품질 후속 서쪽 오 점 분석의 결과 결정에 중요 한 역할을 한다. 단백질 샘플 및 세포, 조직, 동물 모델에서 사후 인간의 조직, 등의 다양 한에서 추출 될 수로 처리 및 처리에 일관성 재현성 결과를 얻이 필요 합니다. 예를 들어 단백질 추출에 대 한 샘플의 장기 보관이 필요한 경우 그것은, 단백질은-80 ° C에 일반적으로 안정, 추출 된 단백질 및-80 ° C에서 그대로 조직 단백질 안정성에 차이 되었다는 것을 실현 하는 것이 중요 보고 된10. 또한, 단백질 양의 재현할 수 견적을 얻으려면, 샘플의 일관 된 균질 결정적 이다. 다른 세포의 용 해 버퍼 및 균질 화 방법 (예를 들어, 수동 균질 자동된 방법에 비해)을 최적화 하는 것은 대규모 양적 실험을 시작 하기 전에 필요할 수 있습니다.
단백질 로드와 부 량 변화에 대 한 해결 하기 위해 정규화 전략 단백질 식의 강력 하 고, 양적 결과 얻기 위해 필수적입니다. 단백질 β-말라 등 내부 관리, α-tubulin, β-tubulin, 및 glyceraldehyde-3-인산 효소 (GAPDH) 전통적으로 사용 되어 왔습니다 정량화에 대 한 단백질 수준을 정상화 하. 그러나, 정량화 목적을 위해 특정 가사 단백질 정규화 점점 받아왔다 지난 몇 년 동안11,12이상. 예를 들어 가사 단백질의 표현 같은 동물4, 그리고 다양 한 질병 조건4,15 아래 조직에 걸쳐 서로 다른 발달 단계13,14를 변경할 수 있습니다. ,,1617. 따라서, 특정 가사 단백질의 사용 다른 조직, 다른 timepoints와 다양 한 실험 조건 아래에서 단백질 표정 사이 더 복잡 한 비교를 만들기의 가능성을 제한 합니다. 로드 변형 단백질에 대 한 제어를 가사 단백질 대신 총 단백질 얼룩 (TPS)를 사용 하 여 해당 레이블 이며 샘플에 존재 하는 모든 단백질을 시각화. TPS 신호 정규화 총 단백질 부하에 따라 수 보다는 특정 한 단백질의 수준 및 그러므로 TPS 신호의 정량화 해야 한다 비교 실험 조건, 샘플 형식 또는 발달 timepoint에 재현 . 총 단백질 얼룩 포함 됩니다 Ponceau S, 얼룩-무료 젤, Coomassie R-350, Sypro-루비, Epicocconone, Amydo 블랙와 Cy5 (참고 18에서 검토). 이러한 각 메서드는 특정 이점 및 제한 하 고 메서드 선택 실험 설치4,18뿐만 아니라 시간 및 사용할 수 있는 도구에 따라 달라 집니다.
내 막 로드와 부 량 변화에 대 한 수정 하는 TPS를 사용 하 여, 그것을 다른 세포 막, 대규모 단백질 표정 분석을 수행 하는 경우에 특히 사이 샘플을 비교할 필요할 수 있습니다. 그러나, 항 체 바인딩 효율성과 총 단백질 얼룩 강도 같은 요인에서 변화를 소개 추가 별도 젤에 분석 단백질 견본 및 막 사이 변화 합니다. 이 상황에서 강력한 정량화에 대 한 그것은 멤브레인 사이 가변성을 더 정규화 단계를 소개 하는 데 필요한 따라서. 이 실험에서 일정 하 게 유지는 별도로 분석 된 막의 각각에 내부 로드 표준 포함 하 여 달성 될 수 있다. 이 표준은 모든 단백질을 실험에 포함 하는 모든 세포 막에 걸쳐 사용 될 충분 한 수량에 얻어질 수 있다 lysate의 형태를 걸릴 수 있습니다. 여기, 우리 두뇌는 즉시 무 균 하 고 높은 농도에 단백질의 상당한 금액을 포함 하는 취득된 단백질 lysate lysate 쥐의 뇌 (5 일 오래 된 컨트롤 마우스에서 얻은)의 사용 합니다. 3 중에는 내부 표준 로드 정상화 하 고 직접 비교를 별도 세포 막에 샘플 수 있습니다.
여기, 우리는 우리가 다른 조직, (를 포함 하 여 질병 모델), 마우스 모델 및 발달 timepoints19단백질 식 변화의 복잡 한 비교를 수행 하기 위해 수 있도록 개발 하는 상세한 프로토콜을 설명 합니다. 결합 하 여 형광 TPS는 내부 로드 표준의 사용과, 우리 수 샘플 및 단일 실험에서 비교 될 수 있는 실험 조건에서에서 기존의 한계를 극복할 수 있었다. 이 방법은 전통적인 서쪽 오 점 기법, 수 있도록 더 나은 다른 조직 및 샘플 단백질 식이 탐구 하는 연구자의 사용을 확장 합니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fine Tipped Gel Loading Tips</td>
			<td>Alpha Laboratories</td>
			<td>GL20057SNTL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halt Protease Inhibitor Cocktail, EDTA-free 100x 5mL</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>78437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Handheld homogeniser&#160;</td>
			<td>VWR Collection</td>
			<td>431-0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iBlot 2 Gel Transfer Device</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>IB21001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iBlot Transfer Stack, PVDF, regular size</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>IB401031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Studio Lite</td>
			<td>Licor</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Free download from https://www.licor.com/bio/products/software/image_studio_lite/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 800CW secondary antibodies</td>
			<td>Licor</td>
			<td>--</td>
			<td>Select appropriate secondary antibody that is specific against host of primary antibody.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Novex Sharp Pre-stained Protein Standard</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>LC5800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15-well</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>NP0323BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE LDS Sample Buffer (4X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>NP0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE MOPS SDS Running Buffer (20X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>NP0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey Blocking Buffer</td>
			<td>Licor</td>
			<td>927-40000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Mouse anti-SMN (survival motor neuron) monoclonal antibody</td>
			<td>BD Transduction Laboratories</td>
			<td>610646</td>
			<td>Is used extensively in the SMN/SMA literature and gives consistent results regardsless of lot number</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REVERT Total Protein Stain, 250 mL&#160;</td>
			<td>Licor</td>
			<td>926-11021&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REVERT Wash Solution&#160;</td>
			<td>Licor</td>
			<td>926-11012&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA Lysis and Extraction Buffer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>89900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XCell&#160;SureLock Mini-Cell</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>EI0001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

robust comparison of protein levels across tissues and throughout development using standardized quantitative western blotting

서 부 럽 감지 하 고 단백질 식 계량 일반적으로 사용 되는 기술입니다. 년 동안,이 기술은 기초 및 임상 연구에 많은 발전을 주도하 고 있다. 그러나, 많은 유사한 실험 기법, 것과 같이 서쪽 오 점 분석의 결과 쉽게 영향을 설계 및 실험의 실행에서 만든 선택. 그러나 특정 가사 단백질 단백질 수준을 정량화에 대 한 정상화 하는 데 사용 되었습니다 전통적으로,, 이러한 제한 수 있고 따라서 점점 더 지난 몇 년 동안 강평 되었다. 여기, 우리는 우리가 다른 조직, (를 포함 하 여 질병 모델), 마우스 모델 및 발달 timepoints 단백질 표정 변화의 복잡 한 비교를 수행 하기 위해 수 있도록 개발 하는 상세한 프로토콜을 설명 합니다. 형광 총 단백질 얼룩을 사용 하 고 내부 로드 표준의 사용을 도입, 가능 하다 실험에서 비교 될 수 있는 고 단백질 수준에 걸쳐 체계적으로 비교 샘플 수에 기존의 한계를 극복 하는 다양 한 실험 조건입니다. 이 방법은 전통적인 서쪽 오 점 기법, 수 있도록 더 나은 다른 조직 및 샘플 단백질 식이 탐구 하는 연구자의 사용을 확장 합니다.

우리는 조직 및 시간 포인트 단백질 레벨의 비교를 용이 하 게 TPS는 내부 표준의 사용의 예제를 포함 합니다. 그림 1 은 신생아 (출생 후 5 일) (10 주 된) 성인 쥐 비교에서 얻은 조직에서 추출 하는 단백질에 서 부 럽에서 결과 보여줍니다. TPS 및 Smn immunoblot 그림 1A, C에에서 나와 있습니다. 각 레인에 사각형 상자 안에...

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Robust Comparison of Protein Levels Across Tissues and Throughout Development Using Standardized Quantitative Western Blotting

이 방법은 단백질 레벨과 다른 조직에서 표준화 된 양적 서쪽 더 럽 히 접근을 사용 하 여 다른 발달 timepoints에서의 비교에 대 한 강력 하 고 재현 가능한 방식을 설명 합니다.

단백질 수준 및 개발 표준화 양적 부 럽을 사용 하 여 전체 조직에 걸쳐 강력한 비교

Western blotting is a technique that is commonly used to detect and quantify protein expression. Over the years, this technique has led to many advances ...

이 프로토콜은 다른 조직 및 시간 점에 걸쳐 단백질 발현을 보고 근본적인 임상 연구에서 중요한 질문을 해결하는 데 사용할 수 있습니다. 신뢰할 수 있는 정량적 서양 얼룩을 수행하기 위해 형광 총 단백질 얼룩과 내부 적재 제어를 결합합니다. 이것은 실험 조건에 걸쳐 각종 조직을 비교할 때 생기는 한계를 극복합니다.스냅 냉동 세포 또는 조직 샘플에서 단백질을 추출하려면 표에 따라 샘플을 적절하게 세척하기 전에 얼음에 마이너스-80도 샘플을 해동하십시오. 폴리프로필렌 유봉이 있는 핸드헬드 전기 균질화제를 사용하여 세척된 샘플을 균질화하고, 이중 증류수로 유봉을 헹구고, 샘플 사이에 깨끗한 조직으로 건조시. 샘플을 얼음 위에 10분 간 두고 원심분리가 뒤따릅니다.그런 다음, 펠릿을 방해하지 않고 얼음에 새로운 튜브에 단백질 샘플 함유 슈퍼상체를 전송. 단백질 농도의 정량화를 위해, 트리플리케이트의 농도증가에 소 혈청 알부민 기준을 설정하고, 각 단백질 샘플의 마이크로리터 1개를 96웰 광학 플레이트의 적절한 우물에 중복하여 첨가한다. 단백질 농도가 낮을 것으로 예상되는 경우 60도 섭씨 열 블록에 단백질을 10분 이상 배양하고 플레이트 판독기에서 560 나노미터에서 흡수를 측정합니다.플레이트 판독기 측정을 내보내고 각 샘플의 평균 흡광도 값을 단백질 표준을 사용하여 얻은 표준 곡선과 비교하여 단백질 농도를 계산합니다. 단백질의 양을 정상화하기 위해, 샘플 버퍼및 초순수수에서 단백질 샘플의 희석을 준비하고 10분 동안 70도 섭씨 열 블록에서 시료를 배양한다. 그런 다음 샘플을 얼음 위에 놓고 소용돌이를 가하고 잠시 원심분리합니다.전기 포거의 경우, 젤 전기 전광 챔버 시스템에 4 ~ 12 %의 비스 트리스 그라데이션 젤을 설정하고 단백질 표준의 3.5 마이크로 리터를 우물에 로드합니다. 멤브레인 정상화를 위해 내부 표준을 사용하는 경우 단백질 사다리 옆에 있는 처음 세 개의 우물에 다른 샘플과 동일한 양을 적재하고 각 샘플의 30 마이크로그램을 나머지 우물에 적재합니다. 이어서, 스태킹 젤을 통해 샘플을 10분 동안 80볼트로 실행하고 45~60분 동안 150볼트를 추가로 실행한다.전기포광의 끝에서, 전달 스택을 조립하기 위해, 단백질 젤을 폴리비닐리덴 디플루오라이드 멤브레인을 포함하는 바닥 스택에 놓는 다음 필터 종이를 한다. 블로팅 롤러를 사용하여 기포를 제거하고 필터 용지 상단에 상단 스택을 놓은 다음 스택을 다시 롤링하여 기포를 제거합니다. 장치의 왼쪽에 전극을 가진 전체 스택을 전달 장치로 옮기고 스폰지가 장치의 해당 전기 접촉과 정렬되도록 스택 위에 젤 스폰지를 놓습니다.뚜껑을 닫은 후 적절한 프로그램을 선택하고 시작합니다. 프로그램이 끝나면 멤브레인을 젤 크기로 자르고 절단 막을 이중 증류수로 신속하게 세척한 후 총 단백질 얼룩을 계속 합니다. 총 단백질 염색을 위해, 단백질 측이 안쪽을 향하고 있는 50 밀리리터 튜브로 막을 굴려 연기 후드의 실온에서 5 분 동안 롤러에 단백질 얼룩 용액의 5 밀리리터로 막을 라벨.인큐베이션이 끝나면 5밀리리터의 워시 용액으로 멤브레인을 신속하게 세척하고 튜브를 세척 사이에 롤러로 간단히 되돌리고 초순수물로 짧은 헹구는 것입니다. 멤브레인에 블로킹 버퍼 3밀리리터를 추가하고 실온에서 30분 동안 멤브레인을 롤러로 되돌려 보입니다. 블로킹 버퍼를 적절한 최적화된 농도에서 관심 있는 1차 항체로 교체하고 밤새 4도에서 롤러의 멤브레인을 배양한다.다음 날, 실온에서 롤러에 신선한 PBS의 5 밀리리터와 5 분 동안 멤브레인을 6 번 세척합니다. 마지막 세척 후, 실온에서 1 시간 동안 롤러에 적절한 이차 항체 용액으로 멤브레인을 인큐베이션한 다음 세척당 30 분 동안 3 개의 세척을 합니다. 마지막 세척 후 멤브레인을 건조하고 알루미늄 호일을 사용하여 멤브레인을 빛으로부터 보호합니다.이미지 수집을 위해 단백질 측이 아래로 향하여 스캐너에 멤브레인을 배치하고 소프트웨어의 스캔 영역을 선택합니다. 그런 다음 두 채널모두에서 이미지를 획득하고 이미지를 적절한 이미지 분석 프로그램으로 내보냅니다. 700나노미터 채널을 표시하여 총 단백질 염색 결과를 표시하고 해석 및 그리기 사각형을 선택하여 정상화에 대한 관심 영역을 정의합니다.그런 다음 정의된 영역이 분석된 모든 레인에 대해 동일한 크기인지 확인하기 위해 첫 번째 사각형 영역을 각 개별 샘플에 복사하여 붙여 넣습니다. 각 차선의 단백질 농도를 정량화하기 위해 총 단백질 얼룩과 관심 있는 단백질모두에서 결과를 스프레드시트 프로그램에 복사하고 가장 높은 총 단백질 얼룩 신호를 결정합니다. 이어서, 각 총 단백질 얼룩 신호 값을 이 값별로 나누어 정규화된 단백질 적재값을 얻고 각 개별 샘플로부터 800나노미터 신호 값을 상응하는 정규화된 단백질 값으로 나누어 상이한 시료에서 상대단백질 발현비를 계산한다.이러한 대표적인 서양 얼룩에서, 산후 5마리의 마우스로부터 얻은 조직에서 추출된 단백질은 10주된 성인 마우스에서 추출한 단백질과 비교된다. 총 단백질 얼룩의 형광 강도의 정량화는 각 차선의 사각형 상자 내부의 형광 강도를 측정함으로써 달성되었다. 전체 차선을 분석할 때, 형광 강도는 시료 전반에 걸쳐 상대적으로 유사하게 유지되며, 이는 정규화를 위해 총 단백질 얼룩을 사용하는 것이 이러한 목적에 적합하다는 것을 나타냅니다.형광 총 단백질 얼룩은 또한 다른 발달 시간 지점에서 단백질 수준을 비교하기 위하여 이용될 수 있습니다. 예를 들어, 생존 운동 뉴런 단백질 수치가 마우스의 나이에 따라 명확하게 감소하지만, 총 단백질 염색 정량화는 일정하게 유지됩니다. 내부 표준, 형광 기반 정규화 및 적절한 통계를 사용하면 다양한 조건에서 복잡한 단백질 발현 분석의 견고성을 증가시킵니다.이 프로토콜은 전통적인 서양 얼룩 기술에 추가, 실험 배치에 걸쳐 적절한 로딩 제어 및 비교의 문제를 극복하고, 단백질 발현 분석을위한 유연성을 제공. 이 접근법은 그밖 실험 조건의 밑에 단백질 발현을 비교하기 위하여 확장될 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

비계 리포좀을 사용하여 근위 지질 단백질 - 단백질 상호 작용을 재구성<em&gt; 체외</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

연구

생화학

SorLA and CLC:CLF-1-dependent Downregulation of CNTFR&#945; as Demonstrated by Western Blotting, Inhibition of Lysosomal Enzymes, and Immunocytochemistry

SorLA and CLC:CLF-1-dependent Downregulation of CNTFRÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â± as Demonstrated by Western Blotting, Inhibition of Lysosomal Enzymes, and Immunocytochemistry

SorLA 및 CLC : 웨스턴 블로 팅, 리소좀 효소의 억제 및 면역 세포에 의해 입증으로 CNTFRα의 CLF-1에 의존 하향 조절

The heterodimeric cytokine Cardiotrophin-like Cytokine:Cytokine-like Factor-1 (CLC:CLF-1) targets the glycosylphosphatidylinositol (GPI)-anchored ...

Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging (cPILOT)

Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging cPILOT

향상된 샘플 복합 전구체 동위 원소 표지 및 동중 태그를 사용하여 조직의 다중 (cPILOT)

There is an increasing demand to analyze many biological samples for disease understanding and biomarker discovery. Quantitative proteomics strategies ...

A Western Blotting Protocol for Small Numbers of Hematopoietic Stem Cells

조 혈 줄기 세포의 작은 숫자에 대 한 프로토콜을 더럽혀 서 부

Hematopoietic stem cells (HSCs) are rare cells, with the mouse bone marrow containing only ~25,000 phenotypic long term repopulating HSCs. A Western ...

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis (QDB)

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis QDB

높은 처리량, 양적 도트를 사용 하 여 조직 수준에서 선택 된 단백질의 내용의 절대 결정 오 점 분석 (QDB)

Lacking a convenient, quantitative, high throughput immunoblot method for absolute determination of the content of a specific protein at cellular and ...

A11-positive &#946;-amyloid Oligomer Preparation and Assessment Using Dot Blotting Analysis

A11-positive ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-amyloid Oligomer Preparation and Assessment Using Dot Blotting Analysis

A11-긍정적인 β 아 밀 로이드 올리고 머 준비 및 평가 분석 Blotting 도트를 사용 하 여

&#946;-amyloid (A&#946;) is a hydrophobic peptide with an intrinsic tendency to self-assemble into aggregates. Among various aggregates, A&#946; oligomer ...

Identification of Functional Protein Regions Through Chimeric Protein Construction

공상 단백질 구축을 통한 기능성 단백질 영역 식별

The goal of this protocol encompasses the design of chimeric proteins in which distinct regions of a protein are replaced by their corresponding sequences ...

Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein

새로운 키나제 단백질의 강력한 생화학 적 접근법을 사용하여 분자 수준에서특성화

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important ...