Name: robust comparison of protein levels across tissues and throughout development using standardized quantitative western blotting
Uploaded: 2019-04-09T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Robust Comparison of Protein Levels Across Tissues and Throughout Development Using Standardized Quantitative Western Blotting at JoVE.com

E.J.N.G. støttes av Wellcome Trust (grant 106098/Z/14/Z). Annen finansiering er levert av SMA Trust (SMA UK Consortium; T.H.G. & Y-T. H.) SMA Europa (T.H.G, D.v.D.H. og E.J.N.G.), University of Edinburgh DTP i presisjon medisin (T.H.G., ll og A.M.M.) og Euan MacDonald Centre for Motor neuron sykdom Research (T.H.G).

Vev for denne prosedyren ble innhentet fra dyrestudier som ble godkjent av den interne etiske komiteen ved University of Edinburgh og ble utført i samsvar med institusjonelle og UK Home Office forskrifter under myndighet av relevante personlig og lisenser.
Merk: Denne protokollen er optimalisert ved hjelp av standardiserte, kommersielt tilgjengelig kits og reagenser for å øke reproduserbarhet (se Tabell for materiale).
1. forberedelse av prøver</p...

<ol>
	<li>Bertoni, T. A., Perenha-Viana, M. C., Patussi, E. V., Cardoso, R. F., Svidzinski, T. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western+blotting+is+an+efficient+tool+for+differential+diagnosis+of+paracoccidioidomycosis+and+pulmonary+tuberculosis.">Western blotting is an efficient tool for differential diagnosis of paracoccidioidomycosis and pulmonary tuberculosis.</a> Clinical and Vaccine Immunology. 19 (11), 1887-1888 (2012).</li><li>Hutchinson, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Costs+and+outcomes+of+laboratory+diagnostic+algorithms+for+the+detection+of+HIV.">Costs and outcomes of laboratory diagnostic algorithms for the detection of HIV.</a> Journal of Clinical Virology. 58 Suppl 1, (2013).</li><li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets:+procedure+and+some+applications.">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li><li>Eaton, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+protein+analysis+as+a+reliable+loading+control+for+quantitative+fluorescent+Western+blotting.">Total protein analysis as a reliable loading control for quantitative fluorescent Western blotting.</a> PloS One. 8 (8), e72457 (2013).</li><li>Ghosh, R., Gilda, J. E., Gomes, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+necessity+of+and+strategies+for+improving+confidence+in+the+accuracy+of+western+blots.">The necessity of and strategies for improving confidence in the accuracy of western blots.</a> Expert Rev Proteomics. 11 (5), 549-560 (2014).</li><li>Jensen, B. C., Swigart, P. M., Simpson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ten+commercial+antibodies+for+alpha-1-adrenergic+receptor+subtypes+are+nonspecific.">Ten commercial antibodies for alpha-1-adrenergic receptor subtypes are nonspecific.</a> Naunyn-Schmiedebergs Archives of Pharmacology. 379 (4), 409-412 (2009).</li><li>Jositsch, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suitability+of+muscarinic+acetylcholine+receptor+antibodies+for+immunohistochemistry+evaluated+on+tissue+sections+of+receptor+gene-deficient+mice.">Suitability of muscarinic acetylcholine receptor antibodies for immunohistochemistry evaluated on tissue sections of receptor gene-deficient mice.</a> Naunyn-Schmiedebergs Archives of Pharmacology. 379 (4), 389-395 (2009).</li><li>Smejkal, G., Gallagher, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+semidry+protein+transfer+efficiency+with+transverse+gradient+gel+electrophoresis.">Determination of semidry protein transfer efficiency with transverse gradient gel electrophoresis.</a> Biotechniques. 16 (2), (1994).</li><li>Eaton, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+modern+quantitative+fluorescent+western+blotting+with+troubleshooting+strategies.">A guide to modern quantitative fluorescent western blotting with troubleshooting strategies.</a> Journal of Visualized Experiments. (93), e52099 (2014).</li><li>Hunter, G., Roche, S. L., Somers, E., Fuller, H. R., Gillingwater, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+storage+parameters+on+measurement+of+survival+motor+neuron+(SMN)+protein+levels:+implications+for+pre-clinical+studies+and+clinical+trials+for+spinal+muscular+atrophy.">The influence of storage parameters on measurement of survival motor neuron (SMN) protein levels: implications for pre-clinical studies and clinical trials for spinal muscular atrophy.</a> Neuromuscular Disorders. 24 (11), 973-977 (2014).</li><li>Fosang, A. J., Colbran, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transparency+Is+the+Key+to+Quality.">Transparency Is the Key to Quality.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (50), 29692-29694 (2015).</li><li>Taylor, S. C., Berkelman, T., Yadav, G., Hammond, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+defined+methodology+for+reliable+quantification+of+Western+blot+data.">A defined methodology for reliable quantification of Western blot data.</a> Molecular Biotechnology. 55 (3), 217-226 (2013).</li><li>Goasdoue, K., Awabdy, D., Bjorkman, S. T., Miller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standard+loading+controls+are+not+reliable+for+Western+blot+quantification+across+brain+development+or+in+pathological+conditions.">Standard loading controls are not reliable for Western blot quantification across brain development or in pathological conditions.</a> Electrophoresis. 37 (4), 630-634 (2016).</li><li>Rocha-Martins, M., Njaine, B., Silveira, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avoiding+pitfalls+of+internal+controls:+validation+of+reference+genes+for+analysis+by+qRT-PCR+and+Western+blot+throughout+rat+retinal+development.">Avoiding pitfalls of internal controls: validation of reference genes for analysis by qRT-PCR and Western blot throughout rat retinal development.</a> PloS One. 7 (8), e43028 (2012).</li><li>Aghamaleky Sarvestany, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+quantitative+proteomic+profiling+identifies+disruption+of+ubiquitin+homeostasis+as+a+key+driver+of+Schwann+cell+defects+in+spinal+muscular+atrophy.">Label-free quantitative proteomic profiling identifies disruption of ubiquitin homeostasis as a key driver of Schwann cell defects in spinal muscular atrophy.</a> Journal of Proteome Research. 13 (11), 4546-4557 (2014).</li><li>Fuller, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+Muscular+Atrophy+Patient+iPSC-Derived+Motor+Neurons+Have+Reduced+Expression+of+Proteins+Important+in+Neuronal+Development.">Spinal Muscular Atrophy Patient iPSC-Derived Motor Neurons Have Reduced Expression of Proteins Important in Neuronal Development.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 506 (2015).</li><li>Liu, N. K., Xu, X. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=beta-tubulin+is+a+more+suitable+internal+control+than+beta-actin+in+western+blot+analysis+of+spinal+cord+tissues+after+traumatic+injury.">beta-tubulin is a more suitable internal control than beta-actin in western blot analysis of spinal cord tissues after traumatic injury.</a> Journal of Neurotrauma. 23 (12), 1794-1801 (2006).</li><li>Moritz, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tubulin+or+Not+Tubulin:+Heading+Toward+Total+Protein+Staining+as+Loading+Control+in+Western+Blots.">Tubulin or Not Tubulin: Heading Toward Total Protein Staining as Loading Control in Western Blots.</a> Proteomics. 17 (20), (2017).</li><li>Groen, E. J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+and+tissue-specific+variability+of+SMN+protein+levels+in+mouse+models+of+spinal+muscular+atrophy.">Temporal and tissue-specific variability of SMN protein levels in mouse models of spinal muscular atrophy.</a> Human Molecular Genetics. 27 (16), 2851-2862 (2018).</li><li>Chaytow, H., Huang, Y. T., Gillingwater, T. H., Faller, K. M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+survival+motor+neuron+protein+(SMN)+in+protein+homeostasis.">The role of survival motor neuron protein (SMN) in protein homeostasis.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. , (2018).</li><li>Groen, E. J. N., Talbot, K., Gillingwater, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+therapy+for+spinal+muscular+atrophy:+promises+and+challenges.">Advances in therapy for spinal muscular atrophy: promises and challenges.</a> Nature Reviews: Neurology. 14 (4), 214-224 (2018).</li><li>Fitzmaurice, G. M., Laird, N. M., Ware, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Applied longitudinal analysis. , (2004).</li><li>Jordan, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Population+sampling+affects+pseudoreplication.">Population sampling affects pseudoreplication.</a> PLoS Biology. 16 (10), e2007054 (2018).</li><li>LaFauci, G., Adayev, T., Kascsak, R., Brown, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+Quantification+of+the+Fragile+X+Mental+Retardation+Protein+1+(FMRP).">Detection and Quantification of the Fragile X Mental Retardation Protein 1 (FMRP).</a> Genes (Basel). 7 (12), (2016).</li></ol>

Med riktig eksperimentell design, kontrolltiltak og statistisk analyse, kan vestlige blotting brukes å gjøre pålitelige kvantitative beregninger av protein uttrykk innenfor og mellom et variert utvalg av biologiske prøver. Protokollen vi beskriver i gjeldende manuskriptet skal fungere som en retningslinje for forskere som ønsker for å bruke Western blotting for å gjennomføre kvantitativ analyse over større og mer komplekse grupper av prøver, ved hjelp av en kombinasjon av fluorescens-basert oppdagingsmetoder, t...

Vestlige blotting er en teknikk som vanligvis brukes til å oppdage og kvantifisere protein uttrykk, inkludert i vev homogenates eller ekstrakter. Gjennom årene, har denne teknikken ført til mange fremskritt i både grunnleggende og klinisk forskning, der den kan brukes som et diagnostisk verktøy for å identifisere tilstedeværelsen av sykdommen1,2. Vestlige blotting ble først beskrevet i 1979 som metode for å overføre proteiner fra polyakrylamid gels nitrocellulose ark og deretter visualisere proteiner med sekundær antistoffer som er radioactively merket eller konjugert til fluorescein eller peroxidase3. Gjennom utviklingen av kommersielt tilgjengelig kits og utstyr, er vestlige blotting metoder stadig standardisert og forenklet gjennom årene. Faktisk er teknikken nå lett utført av forskere med ulik bakgrunn og nivåer av erfaring. Men som med mange lignende eksperimentelle teknikker, er utfallet av Western blot analyser lett påvirket av valg i utforming og gjennomføring av eksperimentet. Det er viktig, derfor, at tilgjengeligheten av standardiserte vestlig blotting metoder ikke skjule behovet for forsiktig eksperimentelle planlegging og utforming. Eksperimentell hensyn inkluderer, men er ikke begrenset til, eksempel forberedelse og håndtering, utvalg og validering av antistoffer for proteinet oppdagelsen og gel-til-membran overføring effektiviteten av spesielt små eller store (< 10 eller > 140 kDa) proteiner4,5,6,7,8,9. Protein kvaliteten på den opprinnelige prøven spiller en viktig rolle i å bestemme utfallet av påfølgende Western blot analysen. Som protein kan hentes fra en rekke prøver og kilder, inkludert cellelinjer, vev fra dyremodeller og evaluering av menneskelig vev, er konsistens i håndtering og behandling nødvendig for å oppnå reproduserbar resultater. For eksempel når langtidsoppbevaring av prøver for protein utvinning er nødvendig, er det viktig å innse at det er forskjeller i protein stabilitet mellom utdraget proteiner og intakt vev ved-80 ° C selv om protein er generelt stabile-80 ° c, rapporterte10. Videre for å få reproduserbar estimater av protein mengder, er konsekvent homogenisering av prøver avgjørende. Optimalisere forskjellige lysis buffere og homogenisering metoder (f.eks manuell homogenisering sammenlignet med automatiserte metoder) kan være nødvendig før du starter en storstilt kvantitative eksperiment.
Normalisering strategier for å korrigere protein lasting og kvantifisering variasjon er viktige å få robust, kvantitative resultatene av protein uttrykk. Rengjøring proteiner som β-utgangen, har α-tubulin, β-tubulin og glyceraldehyde-3-fosfat dehydrogenase (GAPDH) tradisjonelt blitt brukt til å normalisere protein nivå for kvantifisering. Imidlertid har normalisering bestemt housekeeping proteiner for kvantifisering formål blitt stadig kritisert over de siste par år11,12. For eksempel kan uttrykket av housekeeping proteiner endre over forskjellige utviklingsstadier13,14, over vev fra samme dyr4og under ulike sykdom betingelser4,15 ,16,17. Derfor begrenser bruk av bestemte housekeeping proteiner mulighetene for å lage mer komplekse sammenligninger mellom protein uttrykk fra ulike vev, på forskjellige timepoints og under varierende eksperimentelle forhold. Et alternativ til housekeeping proteiner til kontroll for protein lasting variasjon er bruken av en total protein flekk (TPS) at etiketter og visualiserer alle proteiner i et utvalg. TPS lar signal normalisering basert på total protein belastning i stedet for nivåer av en bestemt protein og derfor kvantifisering av TPS signalet skal være sammenlignbare og reproduserbar uavhengig av eksperimentelle tilstand, prøvetype utviklingsmessige timepoint . Ponceau S, stain gratis gels, Coomassie R-350, Sypro-Ruby, Epicocconone, Amydo Black og Cy5 (omtalt i ref. 18) er eksempler på totalt protein flekker. Hver av disse metodene har spesielle fordeler og begrensninger og metoden utvalg avhenger av tiden og verktøyene samt eksperimentelle oppsett4,18.
I tillegg til en TPS korrigere i membranen lasting og kvantifisering variasjon, kan det være nødvendig å sammenligne prøver mellom forskjellige membraner, spesielt når store protein uttrykk analyse. Imidlertid kan variasjon faktorer som antistoff bindende effektivitet og totalt protein flekken intensitet introdusere mer variasjon mellom protein prøver som analyseres på separate gels og membraner. For robust kvantifisering i denne situasjonen er det derfor nødvendig å innføre et normalisering steg videre til mellom membran variasjon. Dette kan oppnås ved å inkludere en intern lasting standard på hver av separat analysert membraner som holdes konstant over eksperimenter. Denne standarden kan ta form av noe protein lysate som fås i tilstrekkelige mengder til å brukes på tvers av alle membraner tas med i eksperimentet. Her bruker vi en lysate av musen hjernen (hentes fra 5 dagers gammel kontroll mus), fordi hjernen er lett homogenisert og fått protein lysate inneholder en betydelig mengde proteiner til høy konsentrasjon. Laster en intern standard i tre eksemplarer kan eksempler på separate membraner normalisert og sammenlignet direkte.
Her beskriver vi en detaljert protokoll som vi har utviklet for å tillate oss til å gjennomføre komplekse sammenligninger av protein uttrykk variasjon over forskjellige vev, musen modeller (inkludert sykdom modeller) og utviklingsmessige timepoints19. Ved å kombinere en fluorescerende TPS med bruk av en intern lasting standard, kunne vi overvinne eksisterende begrensninger i antall prøver og eksperimentelle forhold som kan sammenlignes med innenfor ett enkelt eksperiment. Dette utvider bruken av tradisjonelle Western blot teknikker, og dermed slik at forskerne å bedre utforske protein uttrykk på tvers av ulike vev og eksempler.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fine Tipped Gel Loading Tips</td>
			<td>Alpha Laboratories</td>
			<td>GL20057SNTL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halt Protease Inhibitor Cocktail, EDTA-free 100x 5mL</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>78437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Handheld homogeniser&#160;</td>
			<td>VWR Collection</td>
			<td>431-0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iBlot 2 Gel Transfer Device</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>IB21001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iBlot Transfer Stack, PVDF, regular size</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>IB401031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Studio Lite</td>
			<td>Licor</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Free download from https://www.licor.com/bio/products/software/image_studio_lite/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 800CW secondary antibodies</td>
			<td>Licor</td>
			<td>--</td>
			<td>Select appropriate secondary antibody that is specific against host of primary antibody.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Novex Sharp Pre-stained Protein Standard</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>LC5800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15-well</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>NP0323BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE LDS Sample Buffer (4X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>NP0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE MOPS SDS Running Buffer (20X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>NP0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey Blocking Buffer</td>
			<td>Licor</td>
			<td>927-40000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Mouse anti-SMN (survival motor neuron) monoclonal antibody</td>
			<td>BD Transduction Laboratories</td>
			<td>610646</td>
			<td>Is used extensively in the SMN/SMA literature and gives consistent results regardsless of lot number</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REVERT Total Protein Stain, 250 mL&#160;</td>
			<td>Licor</td>
			<td>926-11021&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REVERT Wash Solution&#160;</td>
			<td>Licor</td>
			<td>926-11012&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA Lysis and Extraction Buffer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>89900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XCell&#160;SureLock Mini-Cell</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>EI0001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

robust comparison of protein levels across tissues and throughout development using standardized quantitative western blotting

Vestlige blotting er en teknikk som vanligvis brukes til å oppdage og kvantifisere protein uttrykk. Gjennom årene, har denne teknikken ført til mange fremskritt i både grunnleggende og klinisk forskning. Men som med mange lignende eksperimentelle teknikker, er utfallet av Western blot analyser lett påvirket av valg i utforming og gjennomføring av eksperimentet. Bestemt housekeeping proteiner har tradisjonelt blitt brukt til å normalisere protein nivå for kvantifisering, men disse har flere begrensninger og har derfor blitt stadig kritisert de siste årene. Her beskriver vi en detaljert protokoll som vi har utviklet for å tillate oss til å gjennomføre komplekse sammenligninger av protein uttrykk variasjon over forskjellige vev, musen modeller (inkludert sykdom modeller) og utviklingsmessige timepoints. Ved å bruke en fluorescerende totale protein flekk og innføre bruk av en intern lasting standard, er det mulig å overvinne eksisterende begrensninger i antall eksempler som kan sammenlignes i eksperimenter og systematisk sammenligne protein nivå over en rekke eksperimentelle forhold. Dette utvider bruken av tradisjonelle western blot teknikker, og dermed slik at forskerne å bedre utforske protein uttrykk på tvers av ulike vev og eksempler.

Vi har eksempler på bruk av TPS og en intern standard, slik at sammenligninger av protein nivå over vev og tidspunkt. Figur 1 viser resultater fra vestlige blotting på protein utvunnet fra vev fra neonatal (postnatal dag 5) i forhold til voksne mus (10 - uke gamle). TPS og Smn immunoblot er vist i figur 1A, C. Kvantifisering av fluorescens intensiteten av TPS ble oppnådd ved å måle fluorescens intensiteten ...

Watch this Scientific Journal Video about Robust Comparison of Protein Levels Across Tissues and Throughout Development Using Standardized Quantitative Western Blotting at JoVE.com

Robust Comparison of Protein Levels Across Tissues and Throughout Development Using Standardized Quantitative Western Blotting

Denne metoden beskriver en robust og reproduserbar tilnærming for sammenligning av protein nivå i ulike vev og ulike utviklingsmessige timepoints med en standardisert kvantitative vestlige blotting tilnærming.

Robust sammenligning av Protein nivå over vev og gjennom utvikling med standardiserte kvantitative vestlige Blotting

Western blotting is a technique that is commonly used to detect and quantify protein expression. Over the years, this technique has led to many advances ...

Denne protokollen kan brukes til å ta opp viktige spørsmål i grunnleggende og klinisk forskning ved å se på proteinuttrykk på tvers av ulike vev og tidspunkter. For å utføre pålitelig kvantitativ vestlig blotting kombinerer vi en fluorescerende total proteinflekk med en intern lastekontroll. Dette overvinner begrensninger som oppstår når man sammenligner ulike vev på tvers av eksperimentelle forhold.For å trekke ut proteiner fra snap-frosne celle- eller vevsprøver, tin de minus-80-graders prøvene på is før du vasker prøvene etter behov, ifølge tabellen. Bruk en håndholdt elektrisk homogenisator med en polypropylen pestle, homogenisere de vasket prøvene, skylle pestle i dobbeltdestillert vann og tørking med et rent vev mellom prøvene. La prøvene stå på is i 10 minutter, etterfulgt av sentrifugering.Deretter overfører du proteinprøven som inneholder supernatant til et nytt rør på is uten å forstyrre pelleten. For kvantifisering av proteinkonsentrasjonen, sett opp storfe serumalbuminstandarder ved økende konsentrasjoner i triplikat, og legg til en mikroliter av hver proteinprøve i duplikat til de riktige brønnene til en 96-brønn optisk plate. Inkuber proteinet på en 60-graders Celsius varmeblokk i 10 minutter eller lenger hvis proteinkonsentrasjonen forventes å være lav og måle absorpsjonen ved 560 nanometer på en plateleser.Eksporter platelesermålingene og beregn proteinkonsentrasjonen ved å sammenligne gjennomsnittsabsorbansverdiene for hver prøve med en standardkurve oppnådd ved hjelp av proteinstandarden. For å normalisere mengden protein, lag fortynninger av proteinprøvene i prøvebuffer og ultra rent vann og inkuber prøvene i en 70-graders Celsius varmeblokk i 10 minutter. Deretter plasserer du prøvene på is før du virvler og kort sentrifugerer.For elektroforese, sette opp en precast fire til 12% Bis-Tris gradient gel i gel elektroforese kammer system og laste 3,5 mikroliter av en proteinstandard i brønnen. Ved bruk av en intern standard for normalisering mellom membran, last en mengde som er lik de andre prøvene i de tre første brønnene ved siden av proteinstigen og last 30 mikrogram av hver prøve inn i de resterende brønnene. Deretter kjører prøvene gjennom stablinggelen på 80 volt i 10 minutter etterfulgt av 150 volt i ytterligere 45 til 60 minutter.På slutten av elektroforesen, for å montere overføringsstakken, legg proteingelen på den nederste stabelen som inneholder polyvinyliden difluoridemembranen etterfulgt av filterpapiret. Bruk blottingvalsen til å fjerne eventuelle luftbobler og plasser den øverste stabelen på toppen av filterpapiret før du ruller stabelen igjen for å fjerne luftbobler. Overfør hele bunken til overføringsenheten med elektroden på venstre side av enheten og plasser gelsvampen på toppen av stabelen slik at svampen er på linje med de tilsvarende elektriske kontaktene på enheten.Når du har lukket lokket, velger du og starter det aktuelle programmet. På slutten av programmet, kutt membranen til gelstørrelsen og vask kuttmembranen raskt med dobbeltdestillert vann før du fortsetter med den totale proteinflekken. For total proteinfarging, rull membranen inn i et 50-milliliter rør med proteinsiden vendt innover og merk membranen med fem milliliter proteinflekkløsning på en rulle i fem minutter ved romtemperatur i en røykhette.På slutten av inkubasjonen vasker du membranen raskt med fem milliliter vaskeoppløsning, og returnerer røret kort til valsen mellom vaskene, etterfulgt av en kort skyll med ultra rent vann. Tilsett tre milliliter med blokkeringsbuffer til membranen og returner membranen til valsen i 30 minutter ved romtemperatur. Erstatt blokkeringsbufferen med det primære antistoffet av interesse ved riktig optimalisert konsentrasjon og inkuber membranen på valsen over natten ved fire grader Celsius.Neste dag vask membranen seks ganger i fem minutter med fem milliliter frisk PBS per vask på valsen ved romtemperatur. Etter siste vask, inkuber membranen med riktig sekundær antistoffløsning på valsen i en time ved romtemperatur etterfulgt av tre vasker i 30 minutter per vask. Etter siste vask tørker du membranen og bruker aluminiumsfolie for å holde membranen beskyttet mot lys.For bildeoppkjøp plasserer du membranen på skanneren med proteinsiden vendt ned og velger skanneområdet i programvaren. Deretter kan du skaffe bilder i begge kanalene og eksportere bildene til et passende bildeanalyseprogram. Vis 700 nanometerkanalen for å vise det totale proteinfargingsresultatet og Velg analyse og tegnrektangel for å definere interesseområdet for normalisering.Kopier og lim deretter inn det første rektangelområdet på hvert enkelt utvalg for å sikre at det definerte området har samme størrelse for alle de analyserte banene. For å kvantifisere proteinkonsentrasjonen i hvert kjørefelt, kopier resultatene fra både den totale proteinflekken og proteinet av interesse for et regnearkprogram og bestem det høyeste totale proteinflekksignalet. Deretter deler du hver totale proteinflekksignalverdi med denne verdien for å oppnå den normaliserte proteinbelastningsverdien og deler signalverdien på 800 nanometer fra hver enkelt prøve med tilsvarende normalisert proteinverdi for å beregne det relative proteinuttrykksforholdet i forskjellige prøver.I disse representative vestlige blots, proteiner ekstrahert fra vev hentet fra post-natal dag fem mus sammenlignes med proteiner ekstrahert fra 10 uker gamle voksne mus. Kvantifisering av fluorescensintensiteten til den totale proteinflekken ble oppnådd ved å måle fluorescensintensiteten inne i rektangelboksen på hvert kjørefelt. Når hele baner analyseres, forblir fluorescensintensiteten relativt lik på tvers av prøver, noe som indikerer at bruk av den totale proteinflekken for normalisering er egnet for dette formålet.Den fluorescerende totale proteinflekken kan også brukes til å sammenligne proteinnivåer på forskjellige utviklingstidspunkter. For eksempel, selv om overlevelsemotorneuronproteinnivåene tydelig reduseres med alderen hos mus, forblir den totale proteinfarget kvantifisering konstant. Bruken av interne standarder, fluorescensbasert normalisering og tilstrekkelig statistikk øker robustheten til kompleks proteinuttrykksanalyse på tvers av ulike forhold.Denne protokollen legger til tradisjonelle vestlige blot teknikker, overvinne problemene med passende lasting kontroller og sammenligninger på tvers av eksperimentelle partier, og gir flexibilities for protein uttrykk analyse. Denne tilnærmingen kan utvides til å sammenligne proteinuttrykk under andre eksperimentelle forhold.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Bruke Stillas liposomer for å rekonstituere Lipid-proksimale Protein-protein interaksjoner<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

SorLA and CLC:CLF-1-dependent Downregulation of CNTFR&#945; as Demonstrated by Western Blotting, Inhibition of Lysosomal Enzymes, and Immunocytochemistry

SorLA and CLC:CLF-1-dependent Downregulation of CNTFRÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â± as Demonstrated by Western Blotting, Inhibition of Lysosomal Enzymes, and Immunocytochemistry

SorLA og CLC: CLF-en-avhengige nedregulering av CNTFRα som demonstrert ved Western Blotting, Hemming av lysosomale enzymer, og Immunocytochemistry

The heterodimeric cytokine Cardiotrophin-like Cytokine:Cytokine-like Factor-1 (CLC:CLF-1) targets the glycosylphosphatidylinositol (GPI)-anchored ...

Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging (cPILOT)

Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging cPILOT

Forbedret Sample Multiplexing av vev ved hjelp Kombinert Precursor Isotop Merking og isobariske Tagging (cPILOT)

There is an increasing demand to analyze many biological samples for disease understanding and biomarker discovery. Quantitative proteomics strategies ...

A Western Blotting Protocol for Small Numbers of Hematopoietic Stem Cells

En vestlig Blotting protokollen for lite antall blodkreft stamceller

Hematopoietic stem cells (HSCs) are rare cells, with the mouse bone marrow containing only ~25,000 phenotypic long term repopulating HSCs. A Western ...

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis (QDB)

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis QDB

Høy gjennomstrømning, absolutt vilje av innholdet i et valgt Protein på vev nivåer ved hjelp av kvantitative Dot Blot analyse (QDB)

Lacking a convenient, quantitative, high throughput immunoblot method for absolute determination of the content of a specific protein at cellular and ...

A11-positive &#946;-amyloid Oligomer Preparation and Assessment Using Dot Blotting Analysis

A11-positive ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-amyloid Oligomer Preparation and Assessment Using Dot Blotting Analysis

A11-positive β-amyloid Oligomer forberedelse og vurdering ved hjelp av Dot Blotting analyse

&#946;-amyloid (A&#946;) is a hydrophobic peptide with an intrinsic tendency to self-assemble into aggregates. Among various aggregates, A&#946; oligomer ...

Identification of Functional Protein Regions Through Chimeric Protein Construction

Identifikasjon av funksjonelle Protein områder gjennom Chimeric Protein konstruksjon

The goal of this protocol encompasses the design of chimeric proteins in which distinct regions of a protein are replaced by their corresponding sequences ...

Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein

Karakterisering på Molecular Level bruker robust biokjemiske tilnærminger av en ny kinase protein

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important ...