Name: robust comparison of protein levels across tissues and throughout development using standardized quantitative western blotting
Uploaded: 2019-04-09T15:00:00
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E.J.N.G. é suportado pelo Wellcome Trust (concessão 106098/Z/14/Z). Outro financiamento foi fornecido pela Trust SMA (SMA UK consórcio; T.H.G. & Y-T. H.), Europa SMA (T.H.G, D.v.D.H. e E.J.N.G.), o DTP da Universidade de Edimburgo em medicina de precisão (T.H.G., L.L. & A.M.M.) e centro de Euan MacDonald para investigação de doença do neurônio Motor (T.H.G).

Tecidos para este procedimento foram obtidos em estudos com animais que foram aprovados pelo Comitê de ética interno da Universidade de Edimburgo e realizaram-se em concordância com os institucionais e regulamentares de UK Home Office sob a autoridade dos relevantes pessoais e as licenças do projeto.
Nota: Este protocolo foi otimizado usando padronizados, disponíveis comercialmente kits e reagentes, a fim de aumentar a reprodutibilidade (ver Tabela de materiais).
<p c...

<ol>
	<li>Bertoni, T. A., Perenha-Viana, M. C., Patussi, E. V., Cardoso, R. F., Svidzinski, T. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western+blotting+is+an+efficient+tool+for+differential+diagnosis+of+paracoccidioidomycosis+and+pulmonary+tuberculosis.">Western blotting is an efficient tool for differential diagnosis of paracoccidioidomycosis and pulmonary tuberculosis.</a> Clinical and Vaccine Immunology. 19 (11), 1887-1888 (2012).</li><li>Hutchinson, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Costs+and+outcomes+of+laboratory+diagnostic+algorithms+for+the+detection+of+HIV.">Costs and outcomes of laboratory diagnostic algorithms for the detection of HIV.</a> Journal of Clinical Virology. 58 Suppl 1, (2013).</li><li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets:+procedure+and+some+applications.">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li><li>Eaton, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+protein+analysis+as+a+reliable+loading+control+for+quantitative+fluorescent+Western+blotting.">Total protein analysis as a reliable loading control for quantitative fluorescent Western blotting.</a> PloS One. 8 (8), e72457 (2013).</li><li>Ghosh, R., Gilda, J. E., Gomes, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+necessity+of+and+strategies+for+improving+confidence+in+the+accuracy+of+western+blots.">The necessity of and strategies for improving confidence in the accuracy of western blots.</a> Expert Rev Proteomics. 11 (5), 549-560 (2014).</li><li>Jensen, B. C., Swigart, P. M., Simpson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ten+commercial+antibodies+for+alpha-1-adrenergic+receptor+subtypes+are+nonspecific.">Ten commercial antibodies for alpha-1-adrenergic receptor subtypes are nonspecific.</a> Naunyn-Schmiedebergs Archives of Pharmacology. 379 (4), 409-412 (2009).</li><li>Jositsch, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suitability+of+muscarinic+acetylcholine+receptor+antibodies+for+immunohistochemistry+evaluated+on+tissue+sections+of+receptor+gene-deficient+mice.">Suitability of muscarinic acetylcholine receptor antibodies for immunohistochemistry evaluated on tissue sections of receptor gene-deficient mice.</a> Naunyn-Schmiedebergs Archives of Pharmacology. 379 (4), 389-395 (2009).</li><li>Smejkal, G., Gallagher, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+semidry+protein+transfer+efficiency+with+transverse+gradient+gel+electrophoresis.">Determination of semidry protein transfer efficiency with transverse gradient gel electrophoresis.</a> Biotechniques. 16 (2), (1994).</li><li>Eaton, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+modern+quantitative+fluorescent+western+blotting+with+troubleshooting+strategies.">A guide to modern quantitative fluorescent western blotting with troubleshooting strategies.</a> Journal of Visualized Experiments. (93), e52099 (2014).</li><li>Hunter, G., Roche, S. L., Somers, E., Fuller, H. R., Gillingwater, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+storage+parameters+on+measurement+of+survival+motor+neuron+(SMN)+protein+levels:+implications+for+pre-clinical+studies+and+clinical+trials+for+spinal+muscular+atrophy.">The influence of storage parameters on measurement of survival motor neuron (SMN) protein levels: implications for pre-clinical studies and clinical trials for spinal muscular atrophy.</a> Neuromuscular Disorders. 24 (11), 973-977 (2014).</li><li>Fosang, A. J., Colbran, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transparency+Is+the+Key+to+Quality.">Transparency Is the Key to Quality.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (50), 29692-29694 (2015).</li><li>Taylor, S. C., Berkelman, T., Yadav, G., Hammond, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+defined+methodology+for+reliable+quantification+of+Western+blot+data.">A defined methodology for reliable quantification of Western blot data.</a> Molecular Biotechnology. 55 (3), 217-226 (2013).</li><li>Goasdoue, K., Awabdy, D., Bjorkman, S. T., Miller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standard+loading+controls+are+not+reliable+for+Western+blot+quantification+across+brain+development+or+in+pathological+conditions.">Standard loading controls are not reliable for Western blot quantification across brain development or in pathological conditions.</a> Electrophoresis. 37 (4), 630-634 (2016).</li><li>Rocha-Martins, M., Njaine, B., Silveira, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avoiding+pitfalls+of+internal+controls:+validation+of+reference+genes+for+analysis+by+qRT-PCR+and+Western+blot+throughout+rat+retinal+development.">Avoiding pitfalls of internal controls: validation of reference genes for analysis by qRT-PCR and Western blot throughout rat retinal development.</a> PloS One. 7 (8), e43028 (2012).</li><li>Aghamaleky Sarvestany, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+quantitative+proteomic+profiling+identifies+disruption+of+ubiquitin+homeostasis+as+a+key+driver+of+Schwann+cell+defects+in+spinal+muscular+atrophy.">Label-free quantitative proteomic profiling identifies disruption of ubiquitin homeostasis as a key driver of Schwann cell defects in spinal muscular atrophy.</a> Journal of Proteome Research. 13 (11), 4546-4557 (2014).</li><li>Fuller, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+Muscular+Atrophy+Patient+iPSC-Derived+Motor+Neurons+Have+Reduced+Expression+of+Proteins+Important+in+Neuronal+Development.">Spinal Muscular Atrophy Patient iPSC-Derived Motor Neurons Have Reduced Expression of Proteins Important in Neuronal Development.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 506 (2015).</li><li>Liu, N. K., Xu, X. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=beta-tubulin+is+a+more+suitable+internal+control+than+beta-actin+in+western+blot+analysis+of+spinal+cord+tissues+after+traumatic+injury.">beta-tubulin is a more suitable internal control than beta-actin in western blot analysis of spinal cord tissues after traumatic injury.</a> Journal of Neurotrauma. 23 (12), 1794-1801 (2006).</li><li>Moritz, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tubulin+or+Not+Tubulin:+Heading+Toward+Total+Protein+Staining+as+Loading+Control+in+Western+Blots.">Tubulin or Not Tubulin: Heading Toward Total Protein Staining as Loading Control in Western Blots.</a> Proteomics. 17 (20), (2017).</li><li>Groen, E. J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+and+tissue-specific+variability+of+SMN+protein+levels+in+mouse+models+of+spinal+muscular+atrophy.">Temporal and tissue-specific variability of SMN protein levels in mouse models of spinal muscular atrophy.</a> Human Molecular Genetics. 27 (16), 2851-2862 (2018).</li><li>Chaytow, H., Huang, Y. T., Gillingwater, T. H., Faller, K. M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+survival+motor+neuron+protein+(SMN)+in+protein+homeostasis.">The role of survival motor neuron protein (SMN) in protein homeostasis.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. , (2018).</li><li>Groen, E. J. N., Talbot, K., Gillingwater, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+therapy+for+spinal+muscular+atrophy:+promises+and+challenges.">Advances in therapy for spinal muscular atrophy: promises and challenges.</a> Nature Reviews: Neurology. 14 (4), 214-224 (2018).</li><li>Fitzmaurice, G. M., Laird, N. M., Ware, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Applied longitudinal analysis. , (2004).</li><li>Jordan, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Population+sampling+affects+pseudoreplication.">Population sampling affects pseudoreplication.</a> PLoS Biology. 16 (10), e2007054 (2018).</li><li>LaFauci, G., Adayev, T., Kascsak, R., Brown, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+Quantification+of+the+Fragile+X+Mental+Retardation+Protein+1+(FMRP).">Detection and Quantification of the Fragile X Mental Retardation Protein 1 (FMRP).</a> Genes (Basel). 7 (12), (2016).</li></ol>

Com o delineamento experimental adequado, medidas de controle e análise estatística, a mancha ocidental pode ser usado para fazer estimativas quantitativas fiáveis da expressão da proteína dentro e entre uma variada gama de amostras biológicas. O protocolo que descrevemos no manuscrito atual pretende servir como uma orientação para os investigadores procuram para usar mancha para realizar a análise quantitativa em grupos maiores e mais complexos de amostras, usando uma combinação de baseada em fluorescência o...

Mancha ocidental é uma técnica que é comumente usada para detectar e quantificar a expressão da proteína, inclusive em tecido homogenates ou extratos. Ao longo dos anos, esta técnica tem levado a muitos avanços na pesquisa básica e clínica, onde ele pode ser usado como uma ferramenta de diagnóstico para identificar a presença de doença1,2. Mancha ocidental foi descrita primeiramente em 1979 como um método de transferência de proteínas de géis de poliacrilamida para folhas de nitrocelulose e posteriormente Visualizar proteínas usando anticorpos secundários que foram radioactivamente rotulados ou conjugados com fluoresceína ou peroxidase3. Através do desenvolvimento de kits comercialmente disponíveis e equipamentos, métodos de mancha ocidentais foram cada vez mais padronizados e simplificados ao longo dos anos. Com efeito, a técnica agora é facilmente realizada por cientistas de diferentes origens e níveis de experiência. No entanto, tal como acontece com muitas técnicas experimentais semelhantes, o resultado das análises de Western blot é facilmente influenciado por escolhas feitas na concepção e execução do experimento. É importante, portanto, que a acessibilidade dos métodos padronizados de mancha ocidentais não obscurecer a necessidade de planejamento experimental e design. Considerações experimentais incluem, mas não limitada a, amostra de preparação e manipulação, seleção e validação de anticorpos para a deteção de proteína e eficiência de transferência de gel-para-membrana de particularmente pequenas ou grandes (< 10 ou > 140 kDa) proteínas4,5,6,7,8,9. Qualidade de proteína da amostra original desempenha um papel significativo na determinação do resultado da análise subsequente borrão ocidental. Como a proteína pode ser extraída de uma grande variedade de fontes, incluindo linhas de células, os tecidos de modelos animais e tecidos humanos post-mortem e amostras de consistência na manipulação e processamento é necessário para obter resultados reprodutíveis. Por exemplo, quando é necessário o armazenamento a longo prazo das amostras para a extração da proteína, é importante perceber que, embora a proteína é geralmente estável a-80 ° C, as diferenças na estabilidade da proteína entre proteínas extraídas e tecidos intactos a-80 ° C têm sido relatado em10. Além disso, para obter estimativas reprodutíveis das quantidades de proteína, consistente homogeneização das amostras é crucial. Otimização de buffers de Lise diferentes e métodos de homogeneização (por exemplo, manual homogeneização em comparação com métodos automatizados) pode ser necessária antes de iniciar um experimento em grande escala quantitativo.
Estratégias de normalização para corrigir a variação de carga e quantificação de proteína são essenciais para obter resultados quantitativos, robustos da expressão da proteína. Limpeza de proteínas tais como β-actina, α-tubulina e β-tubulina gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH) tem sido tradicionalmente usados para normalizar os níveis de proteína para quantificação. No entanto, normalização para proteínas de limpeza específico para fins de quantificação tem sido cada vez mais criticada sobre o passado poucos anos11,12. Por exemplo, a expressão de proteínas de limpeza pode alterar entre diferentes estádios de desenvolvimento13,14, através de tecidos do mesmo animal4e sob vários doença condições4,15 ,16,17. Portanto, a utilização de proteínas específicas de limpeza limita as possibilidades de fazer comparações mais complexas entre a expressão da proteína de diferentes tecidos, em diferentes momentos e sob diferentes condições experimentais. Uma alternativa às proteínas de limpeza para controle para variação de carga de proteína é o uso de uma mancha de proteína total (TPS) que rotula e visualiza todas as proteínas presentes em uma amostra. TPS permite a normalização do sinal com base na carga de proteína total, ao invés de níveis de uma proteína específica e, portanto, a quantificação do sinal TPS devem ser comparáveis e reprodutíveis, independentemente da condição experimental, tipo de amostra ou Commit do desenvolvimento . Ponceau S, géis mancha-livre, R-350 de Coomassie, Ruby-Sypro, Epicocconone, Amydo Black e Cy5 (revisto em ref. 18) são exemplos de manchas de proteínas totais. Cada um desses métodos tem limitações e vantagens específicas e seleção do método depende do tempo e ferramentas disponíveis, bem como a instalação experimental4,18.
Além de usar um TPS para corrigir a carga dentro da membrana e variabilidade de quantificação, pode ser necessário comparar amostras entre diferentes membranas, particularmente ao realizar a análise de expressão de proteínas em larga escala. No entanto, a variabilidade em fatores como eficiência e total intensidade de coloracao de proteína de ligação de anticorpos pode introduzir mais variabilidade entre amostras de proteínas que são analisadas em separado geles e membranas. Para quantificação robusta nesta situação, portanto, é necessário introduzir um novo passo de normalização para levar em conta a variabilidade between-membrana. Isto pode ser conseguido, incluindo um padrão de carregamento interno em cada uma das membranas que é mantida constante através de experiências analisadas separadamente. Esta norma pode assumir a forma de qualquer proteína lisada que podem ser obtidos em quantidades suficientes para ser usado em todas as membranas incluídas no experimento. Aqui, usamos um lisado de cérebro de rato (obtido de ratos do controle 5 dias de idade), como o cérebro é prontamente homogeneizado e a lisado de proteína obtida contém uma quantidade significativa de proteína em uma concentração elevada. Carregar um padrão interno em triplicado permite amostras em membranas diferentes para ser normalizado e comparado diretamente.
Aqui, descrevemos um protocolo detalhado que desenvolvemos para permitir-nos realizar comparações complexas de variação de expressão de proteínas em tecidos diferentes, modelos de rato (incluindo modelos de doença) e momentos do desenvolvimento19. Combinando um fluorescente TPS com o uso de um padrão de carregamento interno, conseguimos superar as limitações existentes no número de amostras e condições experimentais que podem ser comparadas dentro de uma única experiência. Esta abordagem expande o uso de técnicas de borrão ocidental tradicional, permitindo assim que os investigadores para melhor explorar a expressão da proteína através de amostras e tecidos diferentes.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fine Tipped Gel Loading Tips</td>
			<td>Alpha Laboratories</td>
			<td>GL20057SNTL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halt Protease Inhibitor Cocktail, EDTA-free 100x 5mL</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>78437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Handheld homogeniser&#160;</td>
			<td>VWR Collection</td>
			<td>431-0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iBlot 2 Gel Transfer Device</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>IB21001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iBlot Transfer Stack, PVDF, regular size</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>IB401031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Studio Lite</td>
			<td>Licor</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Free download from https://www.licor.com/bio/products/software/image_studio_lite/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 800CW secondary antibodies</td>
			<td>Licor</td>
			<td>--</td>
			<td>Select appropriate secondary antibody that is specific against host of primary antibody.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Novex Sharp Pre-stained Protein Standard</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>LC5800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15-well</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>NP0323BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE LDS Sample Buffer (4X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>NP0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE MOPS SDS Running Buffer (20X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>NP0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey Blocking Buffer</td>
			<td>Licor</td>
			<td>927-40000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Mouse anti-SMN (survival motor neuron) monoclonal antibody</td>
			<td>BD Transduction Laboratories</td>
			<td>610646</td>
			<td>Is used extensively in the SMN/SMA literature and gives consistent results regardsless of lot number</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REVERT Total Protein Stain, 250 mL&#160;</td>
			<td>Licor</td>
			<td>926-11021&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REVERT Wash Solution&#160;</td>
			<td>Licor</td>
			<td>926-11012&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA Lysis and Extraction Buffer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>89900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XCell&#160;SureLock Mini-Cell</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>EI0001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

robust comparison of protein levels across tissues and throughout development using standardized quantitative western blotting

Mancha ocidental é uma técnica que é comumente usada para detectar e quantificar a expressão da proteína. Ao longo dos anos, esta técnica tem levado a muitos avanços na pesquisa básica e clínica. No entanto, tal como acontece com muitas técnicas experimentais semelhantes, o resultado das análises de Western blot é facilmente influenciado por escolhas feitas na concepção e execução do experimento. As proteínas específicas das tarefas domésticas tem sido tradicionalmente usadas para normalizar os níveis de proteína para quantificação, no entanto, estes têm um número de limitações e, portanto, têm sido cada vez mais criticadas durante os últimos anos. Aqui, descrevemos um protocolo detalhado que desenvolvemos para permitir-nos realizar comparações complexas de variação de expressão de proteínas em tecidos diferentes, modelos de rato (incluindo modelos de doença) e momentos do desenvolvimento. Usando uma mancha de proteína total fluorescente e introduzindo o uso de um padrão de carregamento interno, é possível superar as limitações existentes no número de amostras que podem ser comparadas dentro de experiências e comparar sistematicamente os níveis de proteína através de um gama de condições experimentais. Esta abordagem expande o uso de técnicas de borrão ocidental tradicional, permitindo assim que os investigadores para melhor explorar a expressão da proteína através de amostras e tecidos diferentes.

Nós incluímos exemplos do uso da TPS e um padrão interno para facilitar comparações dos níveis de proteína através de tecidos e pontos de tempo. A Figura 1 mostra os resultados da mancha ocidental na proteína extraída de tecidos obtidos de neonatal (pós-parto dia 5) em comparação com ratos adultos (10 - semanas de idade). TPS e Smn immunoblot são mostrados na figura 1A, C. Quantificação da intensi...

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Robust Comparison of Protein Levels Across Tissues and Throughout Development Using Standardized Quantitative Western Blotting

Este método descreve uma abordagem robusta e reprodutível para a comparação dos níveis de proteína nos tecidos diferentes e em diferentes momentos do desenvolvimento, utilizando uma abordagem de mancha ocidental quantitativa padronizada.

Robusta comparação dos níveis de proteína através de tecidos e durante todo o desenvolvimento usando mancha ocidental quantitativa padronizada

Western blotting is a technique that is commonly used to detect and quantify protein expression. Over the years, this technique has led to many advances ...

Este protocolo pode ser usado para abordar questões importantes em pesquisas fundamentais e clínicas, olhando para a expressão proteica em diferentes tecidos e pontos de tempo. Para realizar uma mancha ocidental quantitativa confiável, combinamos uma mancha de proteína total fluorescente com um controle interno de carregamento. Isso supera limitações que surgem ao comparar vários tecidos em condições experimentais.Para extrair proteínas de amostras de células ou tecidos congelados, descongele as amostras de menos 80 graus no gelo antes de lavar as amostras conforme apropriado, de acordo com a tabela. Utilizando um homogeneizador elétrico portátil com um pilão de polipropileno, homogeneize as amostras lavadas, enxaguando o pilão em água duplamente destilada e secando com um tecido limpo entre as amostras. Deixe as amostras no gelo por 10 minutos, seguidas de centrifugação.Em seguida, transfira o supernanato contendo proteínas para um novo tubo no gelo sem perturbar a pelota. Para quantificação da concentração proteica, configure padrões de albumina de soro bovino no aumento das concentrações em triplicado, e adicione um microliter de cada amostra de proteína em duplicação aos poços apropriados de uma placa óptica de 96 poços. Incubar a proteína em um bloco de calor de 60 graus Celsius por 10 minutos ou mais se a concentração de proteína for esperada para ser baixa e medir a absorção em 560 nanômetros em um leitor de placas.Exporte as medidas do leitor de placas e calcule a concentração de proteína comparando os valores médios de absorção de cada amostra a uma curva padrão obtida utilizando o padrão proteico. Para normalizar a quantidade de proteína, prepare as diluições das amostras de proteína em tampão de amostras e água ultra-pura e incuba as amostras em um bloco de calor de 70 graus Celsius por 10 minutos. Em seguida, coloque as amostras no gelo antes de vórtices e centrifugando brevemente.Para eletroforese, configure um gel de gradiente pré-moldado de quatro a 12% Bis-Tris no sistema de câmara de eletroforese gel e carregue 3,5 microlitres de um padrão de proteína no poço. Ao utilizar um padrão interno para normalização entre membranas, carregue uma quantidade igual às outras amostras nos três primeiros poços próximos à escada proteica e carregue 30 microgramas de cada amostra nos poços restantes. Em seguida, passe as amostras através do gel de empilhamento a 80 volts por 10 minutos seguido de 150 volts por um adicional de 45 a 60 minutos.No final da eletroforese, para montar a pilha de transferência, coloque o gel de proteína na pilha inferior contendo a membrana de difluoreto polivinilidene seguida pelo papel filtro. Use o rolo de manchas para remover quaisquer bolhas de ar e coloque a pilha superior na parte superior do papel do filtro antes de rolar a pilha novamente para remover bolhas de ar. Transfira toda a pilha para o dispositivo de transferência com o eletrodo no lado esquerdo do dispositivo e coloque a esponja de gel na parte superior da pilha para que a esponja esteja alinhada com os contatos elétricos correspondentes no dispositivo.Depois de fechar a tampa, selecione e inicie o programa apropriado. No final do programa, corte a membrana ao tamanho do gel e lave a membrana de corte rapidamente com água duplamente destilada antes de continuar com a mancha de proteína total. Para coloração total da proteína, enrole a membrana em um tubo de 50 mililitros com o lado da proteína voltado para dentro e rotule a membrana com cinco mililitros de solução de mancha de proteína em um rolo por cinco minutos à temperatura ambiente em uma capa de fumaça.No final da incubação, lave a membrana rapidamente com cinco mililitros de solução de lavagem, devolvendo o tubo brevemente ao rolo entre as lavagens, seguido de uma breve lavagem com água ultra-pura. Adicione três mililitros de tampão de bloqueio à membrana e devolva a membrana ao rolo por 30 minutos à temperatura ambiente. Substitua o tampão de bloqueio pelo anticorpo primário de interesse na concentração otimizada apropriada e incubar a membrana no rolo durante a noite a quatro graus Celsius.No dia seguinte, lave a membrana seis vezes por cinco minutos com cinco mililitros de PBS fresco por lavagem no rolo à temperatura ambiente. Após a última lavagem, incubar a membrana com a solução de anticorpos secundários apropriada no rolo durante uma hora em temperatura ambiente, seguida de três lavagens por 30 minutos por lavagem. Após a última lavagem, seque a membrana e use papel alumínio para manter a membrana protegida da luz.Para aquisição de imagens, coloque a membrana no scanner com o lado da proteína voltado para baixo e selecione a área de digitalização no software. Em seguida, adquira imagens em ambos os canais e exporte as imagens para um programa de análise de imagem adequado. Exibir o canal de 700 nanômetros para mostrar o resultado total da coloração da proteína e Selecionar análise e desenhar retângulo para definir a área de interesse para a normalização.Em seguida, copie e cole a primeira área de retângulo em cada amostra individual para garantir que a região definida seja do mesmo tamanho para todas as faixas analisadas. Para quantificar a concentração de proteínas em cada pista, copie os resultados tanto da mancha de proteína total quanto da proteína de interesse para um programa de planilha e determine o maior sinal total de mancha de proteína. Em seguida, divida o valor total do sinal de mancha de proteína por esse valor para obter o valor de carga de proteína normalizado e divida o valor do sinal de 800 nanômetros de cada amostra individual pelo seu valor proteico normalizado correspondente para calcular a razão relativa de expressão proteica em diferentes amostras.Nestas manchas ocidentais representativas, as proteínas extraídas de tecidos obtidos no pós-natal cinco camundongos são comparadas com proteínas extraídas de camundongos adultos de 10 semanas. A quantificação da intensidade de fluorescência da mancha de proteína total foi alcançada medindo a intensidade da fluorescência dentro da caixa de retângulo em cada pista. Quando são analisadas pistas inteiras, a intensidade da fluorescência permanece relativamente semelhante entre as amostras, indicando que o uso da mancha de proteína total para normalização é adequado para este fim.A mancha de proteína total fluorescente também pode ser usada para comparar níveis de proteína em diferentes pontos de tempo de desenvolvimento. Por exemplo, embora os níveis de proteína do neurônio motor de sobrevivência diminuam claramente com a idade em camundongos, a quantificação total manchada de proteína permanece constante. O uso de normas internas, normalização baseada em fluorescência e estatísticas adequadas aumenta a robustez da análise complexa da expressão proteica em diferentes condições.Este protocolo se soma às técnicas tradicionais de manchas ocidentais, superando as questões dos controles e comparações de carregamento adequados em lotes experimentais e fornecendo flexibilidades para análise de expressão proteica. Essa abordagem pode ser estendida à comparação da expressão proteica em outras condições experimentais.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Usando andaime lipossomas para reconstituir interações proteína-proteína Lipid-proximal<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Bioquímica

SorLA and CLC:CLF-1-dependent Downregulation of CNTFR&#945; as Demonstrated by Western Blotting, Inhibition of Lysosomal Enzymes, and Immunocytochemistry

SorLA and CLC:CLF-1-dependent Downregulation of CNTFRÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â± as Demonstrated by Western Blotting, Inhibition of Lysosomal Enzymes, and Immunocytochemistry

SorLA e CLC: Downregulation CLF-1 dependente de CNTFRa como demonstrado por Western Blotting, inibição da Lisossomal Enzimas e Imunocitoquï¿½ica

The heterodimeric cytokine Cardiotrophin-like Cytokine:Cytokine-like Factor-1 (CLC:CLF-1) targets the glycosylphosphatidylinositol (GPI)-anchored ...

Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging (cPILOT)

Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging cPILOT

Reforçada Amostra Multiplexagem de tecidos utilizando Combinada Precursor isotópica Rotulagem e Isobaric Marcação (cPILOT)

There is an increasing demand to analyze many biological samples for disease understanding and biomarker discovery. Quantitative proteomics strategies ...

A Western Blotting Protocol for Small Numbers of Hematopoietic Stem Cells

Um Western que mancha o protocolo para o pequeno número de células-tronco hematopoiéticas

Hematopoietic stem cells (HSCs) are rare cells, with the mouse bone marrow containing only ~25,000 phenotypic long term repopulating HSCs. A Western ...

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis (QDB)

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis QDB

Alto Throughput, absoluta determinação do conteúdo de uma proteína selecionada em níveis de tecido usando quantitativa Dot Blot Analysis (QDB)

Lacking a convenient, quantitative, high throughput immunoblot method for absolute determination of the content of a specific protein at cellular and ...

A11-positive &#946;-amyloid Oligomer Preparation and Assessment Using Dot Blotting Analysis

A11-positive ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-amyloid Oligomer Preparation and Assessment Using Dot Blotting Analysis

A11-positivo β-amiloide Oligomer preparação e avaliação utilizando Dot mancha análise

&#946;-amyloid (A&#946;) is a hydrophobic peptide with an intrinsic tendency to self-assemble into aggregates. Among various aggregates, A&#946; oligomer ...

Identification of Functional Protein Regions Through Chimeric Protein Construction

Identificação de regiões de proteína funcional através de construção de proteínas quiméricas

The goal of this protocol encompasses the design of chimeric proteins in which distinct regions of a protein are replaced by their corresponding sequences ...

Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein

Caracterização no nível molecular usando abordagens bioquímicas robustas de uma nova proteína quinase

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important ...