Name: robust comparison of protein levels across tissues and throughout development using standardized quantitative western blotting
Uploaded: 2019-04-09T15:00:00
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E.J.N.G. es apoyado por el Wellcome Trust (grant 106098/Z/14/Z). Otros fondos han sido facilitados por el SMA Trust (Consorcio de Reino Unido de SMA; T.H.G. & Y-T. H.), Europa de SMA (T.H.G, D.v.D.H. y E.J.N.G.), el DTP de la Universidad de Edimburgo en medicina precisión (T.H.G., L.L. & a.m.m.) y el centro de Euan MacDonald para la investigación de la enfermedad de neurona motora (T.H.G).

Los tejidos para este procedimiento se obtuvieron de los estudios en animales que fueron aprobados por el Comité de ética interna en la Universidad de Edimburgo y fueron realizados en concordancia con institucionales y regulaciones UK Home Office bajo la autoridad de las personal y licencias del proyecto.
Nota: Este protocolo se ha optimizado con reactivos y kits estandarizados, disponibles en el mercado con el fin de aumentar la reproducibilidad (véase Tabla de materiales)...

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	<li>Bertoni, T. A., Perenha-Viana, M. C., Patussi, E. V., Cardoso, R. F., Svidzinski, T. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western+blotting+is+an+efficient+tool+for+differential+diagnosis+of+paracoccidioidomycosis+and+pulmonary+tuberculosis.">Western blotting is an efficient tool for differential diagnosis of paracoccidioidomycosis and pulmonary tuberculosis.</a> Clinical and Vaccine Immunology. 19 (11), 1887-1888 (2012).</li><li>Hutchinson, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Costs+and+outcomes+of+laboratory+diagnostic+algorithms+for+the+detection+of+HIV.">Costs and outcomes of laboratory diagnostic algorithms for the detection of HIV.</a> Journal of Clinical Virology. 58 Suppl 1, (2013).</li><li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets:+procedure+and+some+applications.">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li><li>Eaton, S. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ten+commercial+antibodies+for+alpha-1-adrenergic+receptor+subtypes+are+nonspecific.">Ten commercial antibodies for alpha-1-adrenergic receptor subtypes are nonspecific.</a> Naunyn-Schmiedebergs Archives of Pharmacology. 379 (4), 409-412 (2009).</li><li>Jositsch, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suitability+of+muscarinic+acetylcholine+receptor+antibodies+for+immunohistochemistry+evaluated+on+tissue+sections+of+receptor+gene-deficient+mice.">Suitability of muscarinic acetylcholine receptor antibodies for immunohistochemistry evaluated on tissue sections of receptor gene-deficient mice.</a> Naunyn-Schmiedebergs Archives of Pharmacology. 379 (4), 389-395 (2009).</li><li>Smejkal, G., Gallagher, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+semidry+protein+transfer+efficiency+with+transverse+gradient+gel+electrophoresis.">Determination of semidry protein transfer efficiency with transverse gradient gel electrophoresis.</a> Biotechniques. 16 (2), (1994).</li><li>Eaton, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+modern+quantitative+fluorescent+western+blotting+with+troubleshooting+strategies.">A guide to modern quantitative fluorescent western blotting with troubleshooting strategies.</a> Journal of Visualized Experiments. (93), e52099 (2014).</li><li>Hunter, G., Roche, S. L., Somers, E., Fuller, H. R., Gillingwater, T. 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C., Berkelman, T., Yadav, G., Hammond, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+defined+methodology+for+reliable+quantification+of+Western+blot+data.">A defined methodology for reliable quantification of Western blot data.</a> Molecular Biotechnology. 55 (3), 217-226 (2013).</li><li>Goasdoue, K., Awabdy, D., Bjorkman, S. T., Miller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standard+loading+controls+are+not+reliable+for+Western+blot+quantification+across+brain+development+or+in+pathological+conditions.">Standard loading controls are not reliable for Western blot quantification across brain development or in pathological conditions.</a> Electrophoresis. 37 (4), 630-634 (2016).</li><li>Rocha-Martins, M., Njaine, B., Silveira, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avoiding+pitfalls+of+internal+controls:+validation+of+reference+genes+for+analysis+by+qRT-PCR+and+Western+blot+throughout+rat+retinal+development.">Avoiding pitfalls of internal controls: validation of reference genes for analysis by qRT-PCR and Western blot throughout rat retinal development.</a> PloS One. 7 (8), e43028 (2012).</li><li>Aghamaleky Sarvestany, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+quantitative+proteomic+profiling+identifies+disruption+of+ubiquitin+homeostasis+as+a+key+driver+of+Schwann+cell+defects+in+spinal+muscular+atrophy.">Label-free quantitative proteomic profiling identifies disruption of ubiquitin homeostasis as a key driver of Schwann cell defects in spinal muscular atrophy.</a> Journal of Proteome Research. 13 (11), 4546-4557 (2014).</li><li>Fuller, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+Muscular+Atrophy+Patient+iPSC-Derived+Motor+Neurons+Have+Reduced+Expression+of+Proteins+Important+in+Neuronal+Development.">Spinal Muscular Atrophy Patient iPSC-Derived Motor Neurons Have Reduced Expression of Proteins Important in Neuronal Development.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 506 (2015).</li><li>Liu, N. K., Xu, X. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=beta-tubulin+is+a+more+suitable+internal+control+than+beta-actin+in+western+blot+analysis+of+spinal+cord+tissues+after+traumatic+injury.">beta-tubulin is a more suitable internal control than beta-actin in western blot analysis of spinal cord tissues after traumatic injury.</a> Journal of Neurotrauma. 23 (12), 1794-1801 (2006).</li><li>Moritz, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tubulin+or+Not+Tubulin:+Heading+Toward+Total+Protein+Staining+as+Loading+Control+in+Western+Blots.">Tubulin or Not Tubulin: Heading Toward Total Protein Staining as Loading Control in Western Blots.</a> Proteomics. 17 (20), (2017).</li><li>Groen, E. J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+and+tissue-specific+variability+of+SMN+protein+levels+in+mouse+models+of+spinal+muscular+atrophy.">Temporal and tissue-specific variability of SMN protein levels in mouse models of spinal muscular atrophy.</a> Human Molecular Genetics. 27 (16), 2851-2862 (2018).</li><li>Chaytow, H., Huang, Y. T., Gillingwater, T. H., Faller, K. M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+survival+motor+neuron+protein+(SMN)+in+protein+homeostasis.">The role of survival motor neuron protein (SMN) in protein homeostasis.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. , (2018).</li><li>Groen, E. J. N., Talbot, K., Gillingwater, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+therapy+for+spinal+muscular+atrophy:+promises+and+challenges.">Advances in therapy for spinal muscular atrophy: promises and challenges.</a> Nature Reviews: Neurology. 14 (4), 214-224 (2018).</li><li>Fitzmaurice, G. M., Laird, N. M., Ware, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Applied longitudinal analysis. , (2004).</li><li>Jordan, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Population+sampling+affects+pseudoreplication.">Population sampling affects pseudoreplication.</a> PLoS Biology. 16 (10), e2007054 (2018).</li><li>LaFauci, G., Adayev, T., Kascsak, R., Brown, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+Quantification+of+the+Fragile+X+Mental+Retardation+Protein+1+(FMRP).">Detection and Quantification of the Fragile X Mental Retardation Protein 1 (FMRP).</a> Genes (Basel). 7 (12), (2016).</li></ol>

Con el diseño experimental adecuado, medidas de control y análisis estadístico, el borrar occidental puede utilizarse para hacer estimaciones cuantitativas fiables de expresión de la proteína dentro de y entre una gran variedad de muestras biológicas. El protocolo que se describe en el manuscrito actual pretende servir de guía para los investigadores que buscan para utilizar el Western blot para llevar a cabo análisis cuantitativo a través de grupos más grandes y más complejos de muestras, usando una combinaci...

Western Blot es una técnica que se utiliza comúnmente para detectar y cuantificar la expresión de la proteína, incluyendo en homogenados de tejido o extractos. Con los años, esta técnica ha conducido a muchos avances en la investigación básica y clínica, donde puede ser utilizado como una herramienta de diagnóstico para identificar la presencia de enfermedad1,2. Primero borrar occidental fue descrito en 1979 como un método para transferir proteínas de geles de poliacrilamida a hojas de nitrocelulosa y posteriormente visualizar las proteínas usando los anticuerpos secundarios que fueron radiactivo etiquetados o conjugados con fluoresceína o peroxidasa3. Mediante el desarrollo de kits disponibles en el mercado y el equipo, Western Blot métodos han sido cada vez más estandarizados y simplificadas sobre los años. De hecho, la técnica ahora es fácilmente realizada por científicos con diferentes orígenes y niveles de experiencia. Sin embargo, como con muchas técnicas experimentales similares, los resultados de los análisis de Western blot es fácilmente influenciado por decisiones en el diseño y ejecución del experimento. Es importante, por lo tanto, que la accesibilidad de métodos estandarizados de Blot Western no obscurecer la necesidad de una cuidadosa planificación experimental y diseño. Consideraciones experimentales incluyen, pero no limitada a, muestra la preparación y manipulación, selección y validación de anticuerpos para la detección de la proteína y la eficiencia de transferencia de gel a la membrana de particularmente grande o pequeño (< 10 o > 140 kDa) proteínas4,5,6,7,8,9. Calidad de la proteína de la muestra original juega un papel importante en la determinación de los resultados de los análisis de Western blot posterior. Como proteína puede ser extraída de una gran variedad de muestras y de fuentes, incluyendo líneas celulares, tejidos de modelos animales y tejidos humanos post mortem, consistencia en el manejo y procesamiento es necesaria para obtener resultados reproducibles. Por ejemplo, cuando se requiere almacenamiento a largo plazo de muestras para la extracción de proteínas, es importante tener en cuenta que, aunque la proteína es generalmente estable a-80 º C, diferencias en la estabilidad de la proteína extraída de las proteínas y los tejidos intactos a-80 ° C han sido reportado10. Además, para obtener estimaciones reproducibles de cantidades de proteína, consecuente homogeneización de las muestras es crucial. Optimización de métodos de homogeneización (p. ej., homogeneización manual en comparación con métodos automatizados) y almacenadores intermediarios de la lisis diferentes puede ser necesario antes de comenzar un experimento a gran escala cuantitativo.
Estrategias de normalización para corregir la variabilidad de carga y la cuantificación de proteína son esenciales para obtener resultados robustos, cuantitativos de la expresión de la proteína. Servicio de limpieza tales como β-actina, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH), α-tubulina y β-tubulina han tradicionalmente utilizados para normalizar los niveles de proteína para la cuantificación. Sin embargo, normalización a las proteínas de limpieza específico para propósitos de cuantificación ha sido criticado cada vez más en el pasado pocos años11,12. Por ejemplo, puede cambiar la expresión de proteínas de limpieza a través de diferentes etapas de desarrollo13,14, a través de los tejidos del animal mismo4y bajo diversas enfermedades condiciones4,15 ,16,17. Por lo tanto, el uso de proteínas específicas de limpieza limita las posibilidades de realizar comparaciones más complejas entre la expresión de proteínas de diversos tejidos, en diferentes puntos de tiempo y bajo diferentes condiciones experimentales. Una alternativa a las proteínas de la limpieza a control para variación de la carga de la proteína es el uso de un colorante de proteínas totales (TPS) que las etiquetas y visualiza todas las proteínas presentes en una muestra. TPS permite la normalización de la señal en base a proteína total carga en lugar de niveles de una proteína específica y por lo tanto la cuantificación de la señal TPS deben ser comparables y reproducibles independientemente de la condición experimental, tipo de muestra o punto de tiempo del desarrollo . Ejemplos de manchas de proteína total incluyen Ponceau S, geles mancha-libre, Coomassie R-350, Sypro Ruby, Epicocconone, Amydo Black y Cy5 (revisado en Ref. 18). Cada uno de estos métodos tiene limitaciones y ventajas específicas y selección del método depende del tiempo y las herramientas disponibles así como la disposición experimental4,18.
Además de utilizar un TPS para corregir para la carga dentro de la membrana y variabilidad de cuantificación, puede ser necesario comparar muestras entre diferentes membranas, particularmente cuando se realiza el análisis de expresión de proteínas a gran escala. Sin embargo, variabilidad en los factores tales como eficiencia y total intensidad de tinción de proteínas de unión del anticuerpo puede introducir mayor variabilidad entre las muestras de proteína que se analizan en diferentes geles y membranas. Para la cuantificación sólida en esta situación, por lo tanto es necesario introducir un nuevo paso de normalización para tener en cuenta la variabilidad entre la membrana. Esto puede lograrse mediante la inclusión de una norma interna de la carga en cada una de las membranas analizadas por separado que se mantiene constante a través de experimentos. Esta norma puede tomar la forma de cualquier proteína lisada que puede obtenerse en cantidad suficiente para usarse en todas las membranas en el experimento. Aquí, utilizamos un lisado de cerebro de ratón (Obtenido de los ratones de control 5 días de edad), como cerebro fácilmente está homogeneizado y la proteína obtenida lisada contiene una cantidad significativa de proteína en alta concentración. Carga estándar interno por triplicado permite muestras en separar las membranas a ser normalizado y comparadas directamente.
Aquí, describimos un protocolo detallado que hemos desarrollado para que podamos llevar a cabo complejas comparaciones de la variación de expresión de la proteína a través de diferentes tejidos, modelos de ratón (incluyendo modelos de la enfermedad) y los puntos de tiempo del desarrollo19. Combinando un TPS fluorescente con el uso de un estándar interno de la carga, hemos sido capaces de superar las limitaciones existentes en el número de muestras y condiciones experimentales que pueden compararse en un solo experimento. Este enfoque amplía el uso de técnicas tradicionales de Western blot, lo que permite a los investigadores explorar mejor expresión de la proteína a través de muestras y diferentes tejidos.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Fine Tipped Gel Loading Tips</td>
			<td>Alpha Laboratories</td>
			<td>GL20057SNTL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halt Protease Inhibitor Cocktail, EDTA-free 100x 5mL</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>78437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Handheld homogeniser&#160;</td>
			<td>VWR Collection</td>
			<td>431-0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iBlot 2 Gel Transfer Device</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>IB21001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iBlot Transfer Stack, PVDF, regular size</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>IB401031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Studio Lite</td>
			<td>Licor</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Free download from https://www.licor.com/bio/products/software/image_studio_lite/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 800CW secondary antibodies</td>
			<td>Licor</td>
			<td>--</td>
			<td>Select appropriate secondary antibody that is specific against host of primary antibody.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Novex Sharp Pre-stained Protein Standard</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>LC5800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15-well</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>NP0323BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE LDS Sample Buffer (4X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>NP0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE MOPS SDS Running Buffer (20X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>NP0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey Blocking Buffer</td>
			<td>Licor</td>
			<td>927-40000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Mouse anti-SMN (survival motor neuron) monoclonal antibody</td>
			<td>BD Transduction Laboratories</td>
			<td>610646</td>
			<td>Is used extensively in the SMN/SMA literature and gives consistent results regardsless of lot number</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REVERT Total Protein Stain, 250 mL&#160;</td>
			<td>Licor</td>
			<td>926-11021&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REVERT Wash Solution&#160;</td>
			<td>Licor</td>
			<td>926-11012&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA Lysis and Extraction Buffer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>89900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XCell&#160;SureLock Mini-Cell</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>EI0001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

robust comparison of protein levels across tissues and throughout development using standardized quantitative western blotting

Western Blot es una técnica que se utiliza comúnmente para detectar y cuantificar la expresión de la proteína. Con los años, esta técnica ha conducido a muchos avances en investigación básica y clínica. Sin embargo, como con muchas técnicas experimentales similares, los resultados de los análisis de Western blot es fácilmente influenciado por decisiones en el diseño y ejecución del experimento. Proteínas específicas de limpieza se han utilizado tradicionalmente para normalizar los niveles de proteína para la cuantificación, sin embargo, éstos tienen una serie de limitaciones y por lo tanto han sido cada vez más criticados en los últimos años. Aquí, describimos un protocolo detallado que hemos desarrollado para que podamos llevar a cabo complejas comparaciones de la variación de expresión de proteínas en diferentes tejidos, modelos de ratón (incluyendo modelos de la enfermedad) y los puntos de tiempo del desarrollo. Mediante una tinción fluorescente proteína total e introduciendo el uso de un estándar interno de la carga, es posible superar las limitaciones existentes en el número de muestras que pueden compararse en experimentos y comparar sistemáticamente los niveles de la proteína a través de un rango de condiciones experimentales. Este enfoque amplía el uso de técnicas de inmunoblot tradicional, lo que permite a los investigadores explorar mejor expresión de la proteína a través de muestras y diferentes tejidos.

Incluyen ejemplos del uso de la TPS y el estándar interno para facilitar las comparaciones de niveles de proteína en los tejidos y puntos del tiempo. La figura 1 muestra los resultados de Western Blot en proteína extraída de tejidos obtenidos de neonatal (día postnatal 5) en comparación con ratones adultos (10 - semana de edad). TPS y Smn immunoblot se muestran en la figura 1A, C. Cuantificación de la inte...

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Robust Comparison of Protein Levels Across Tissues and Throughout Development Using Standardized Quantitative Western Blotting

Este método describe un enfoque robusto y reproducible para la comparación de los niveles de proteína en distintos tejidos y en diferentes puntos de tiempo del desarrollo usando un enfoque Blot western cuantitativo estandarizado.

Robusta comparación de niveles de proteína en los tejidos y a lo largo de desarrollo estandarizados cuantitativos Western Blotting

Western blotting is a technique that is commonly used to detect and quantify protein expression. Over the years, this technique has led to many advances ...

Este protocolo se puede utilizar para abordar cuestiones importantes en la investigación fundamental y clínica mirando la expresión de proteínas a través de diferentes tejidos y puntos de tiempo. Para realizar una hinchazón occidental cuantitativa fiable, combinamos una mancha de proteína total fluorescente con un control de carga interno. Esto supera las limitaciones que surgen al comparar varios tejidos a través de condiciones experimentales.Para extraer proteínas de muestras de células o tejidos congelados, descongele las muestras de menos 80 grados sobre hielo antes de lavar las muestras según corresponda, según la tabla. Usando un homogeneizador eléctrico de mano con un pestillo de polipropileno, homogeneizar las muestras lavadas, enjuagando el pestle en agua de doble destilación y secándose con un tejido limpio entre las muestras. Deje las muestras sobre hielo durante 10 minutos, seguidas de centrifugación.A continuación, transfiera el sobrenadante que contiene la muestra de proteína a un nuevo tubo sobre hielo sin alterar el pellet. Para la cuantificación de la concentración de proteínas, establezca estándares de albúmina sérica bovina en concentraciones crecientes en triplicado y agregue un microlitro de cada muestra de proteína por duplicado a los pozos apropiados de una placa óptica de 96 pozos. Incubar la proteína en un bloque de calor de 60 grados Celsius durante 10 minutos o más si se espera que la concentración de proteína sea baja y mida la absorción a 560 nanómetros en un lector de placas.Exporte las mediciones del lector de placas y calcule la concentración de proteínas comparando los valores medios de absorbancia de cada muestra con una curva estándar obtenida utilizando el estándar de proteínas. Para normalizar la cantidad de proteína, prepare diluciones de las muestras de proteínas en el tampón de la muestra y agua ultrapura e incubar las muestras en un bloque de calor de 70 grados Celsius durante 10 minutos. A continuación, coloque las muestras sobre hielo antes de vórtices y centrifugar brevemente.Para la electroforesis, configure un gel prefabricado de cuatro a 12%Bis-Tris en el sistema de cámara de electroforesis de gel y cargue 3,5 microlitros de un estándar de proteína en el pozo. Cuando utilice un estándar interno para la normalización entre membranas, cargue una cantidad que sea igual a las otras muestras en los tres primeros pozos junto a la escalera de proteínas y cargue 30 microgramos de cada muestra en los pozos restantes. A continuación, ejecute las muestras a través del gel de apilamiento a 80 voltios durante 10 minutos seguido de 150 voltios durante 45 a 60 minutos adicionales.Al final de la electroforesis, para ensamblar la pila de transferencia, coloque el gel proteico en la pila inferior que contiene la membrana de difluoruro de polivinilideno seguida del papel de filtro. Utilice el rodillo de hinchazón para eliminar cualquier burbuja de aire y coloque la pila superior en la parte superior del papel del filtro antes de enrollar la pila de nuevo para eliminar las burbujas de aire. Transfiera toda la pila al dispositivo de transferencia con el electrodo en el lado izquierdo del dispositivo y coloque la esponja de gel en la parte superior de la pila para que la esponja esté alineada con los contactos eléctricos correspondientes en el dispositivo.Después de cerrar la tapa, seleccione e inicie el programa adecuado. Al final del programa, corte la membrana al tamaño del gel y lave la membrana cortada rápidamente con agua doble destilada antes de continuar con la mancha total de proteínas. Para la tinción total de proteínas, enrolle la membrana en un tubo de 50 mililitros con el lado de la proteína orientado hacia adentro y etiquete la membrana con cinco mililitros de solución de manchas de proteína en un rodillo durante cinco minutos a temperatura ambiente en una campana de humo.Al final de la incubación, lavar la membrana rápidamente con cinco mililitros de solución de lavado, devolviendo el tubo brevemente al rodillo entre lavados, seguido de un breve enjuague con agua ultrapura. Añadir tres mililitros de tampón de bloqueo a la membrana y devolver la membrana al rodillo durante 30 minutos a temperatura ambiente. Sustituya el tampón de bloqueo por el anticuerpo primario de interés en la concentración optimizada adecuada e incubar la membrana en el rodillo durante la noche a cuatro grados centígrados.Al día siguiente, lave la membrana seis veces durante cinco minutos con cinco mililitros de PBS fresco por lavado en el rodillo a temperatura ambiente. Después del último lavado, incubar la membrana con la solución de anticuerpos secundaria adecuada en el rodillo durante una hora a temperatura ambiente seguida de tres lavados durante 30 minutos por lavado. Después del último lavado, seque la membrana y utilice papel de aluminio para mantener la membrana protegida de la luz.Para la adquisición de imágenes, coloque la membrana en el escáner con el lado de la proteína hacia abajo y seleccione el área de escaneo en el software. A continuación, adquiera imágenes en ambos canales y exporte las imágenes a un programa de análisis de imágenes adecuado. Muestre el canal de 700 nanómetros para mostrar el resultado total de la tinción de proteínas y Seleccione Análisis y Dibujar rectángulo para definir el área de interés para la normalización.A continuación, copie y pegue el primer área del rectángulo en cada muestra individual para asegurarse de que la región definida tiene el mismo tamaño para todos los carriles analizados. Para cuantificar la concentración de proteínas en cada carril, copie los resultados tanto de la mancha total de proteínas como de la proteína de interés en un programa de hoja de cálculo y determine la señal de tinción de proteína total más alta. A continuación, divida cada valor total de la señal de tinción de proteína por este valor para obtener el valor de carga de proteínas normalizada y divida el valor de señal de 800 nanómetros de cada muestra individual por su valor de proteína normalizado correspondiente para calcular la relación de expresión de proteína relativa en diferentes muestras.En estas manchas occidentales representativas, las proteínas extraídas de los tejidos obtenidos del día postnatal cinco ratones se comparan con las proteínas extraídas de ratones adultos de 10 semanas de edad. La cuantificación de la intensidad de fluorescencia de la mancha de proteína total se logró midiendo la intensidad de fluorescencia dentro de la caja rectangular en cada carril. Cuando se analizan carriles enteros, la intensidad de fluorescencia permanece relativamente similar en todas las muestras, lo que indica que el uso de la mancha de proteína total para la normalización es adecuado para este propósito.La mancha de proteína total fluorescente también se puede utilizar para comparar los niveles de proteína en diferentes puntos de tiempo de desarrollo. Por ejemplo, aunque los niveles de proteína de neurona motora de supervivencia disminuyen claramente con la edad en ratones, la cuantificación total de la mancha de proteína permanece constante. El uso de normas internas, normalización basada en fluorescencia y estadísticas adecuadas aumenta la robustez del análisis complejo de la expresión de proteínas en diferentes condiciones.Este protocolo se suma a las técnicas tradicionales de Western blot, superando los problemas de los controles de carga y comparaciones adecuados entre lotes experimentales, y proporcionando flexibilidades para el análisis de la expresión de proteínas. Este enfoque se puede ampliar a la comparación de la expresión de proteínas en otras condiciones experimentales.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

El uso de andamios liposomas para reconstituir las interacciones proteína-proteína-lípidos proximal<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Investigación

Bioquímica

SorLA and CLC:CLF-1-dependent Downregulation of CNTFR&#945; as Demonstrated by Western Blotting, Inhibition of Lysosomal Enzymes, and Immunocytochemistry

SorLA and CLC:CLF-1-dependent Downregulation of CNTFRÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â± as Demonstrated by Western Blotting, Inhibition of Lysosomal Enzymes, and Immunocytochemistry

SorLA y CLC: regulación a la baja de CLF-1 dependiente de CNTFRα como se ha demostrado a través de Western Blot, la inhibición de enzimas lisosomales, y inmunocitoquímica

The heterodimeric cytokine Cardiotrophin-like Cytokine:Cytokine-like Factor-1 (CLC:CLF-1) targets the glycosylphosphatidylinositol (GPI)-anchored ...

Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging (cPILOT)

Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging cPILOT

Muestra mejorada Multiplexing de tejidos usando combinada Precursor isotópico etiquetado y isobárico Tagging (cPILOT)

There is an increasing demand to analyze many biological samples for disease understanding and biomarker discovery. Quantitative proteomics strategies ...

A Western Blotting Protocol for Small Numbers of Hematopoietic Stem Cells

Un Western Blot protocolo para una pequeña cantidad de células madre hematopoyéticas

Hematopoietic stem cells (HSCs) are rare cells, with the mouse bone marrow containing only ~25,000 phenotypic long term repopulating HSCs. A Western ...

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis (QDB)

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis QDB

Alto rendimiento, la absoluta determinación del contenido de una proteína seleccionada a nivel de tejido con punto cuantitativo Blot análisis (QDB)

Lacking a convenient, quantitative, high throughput immunoblot method for absolute determination of the content of a specific protein at cellular and ...

A11-positive &#946;-amyloid Oligomer Preparation and Assessment Using Dot Blotting Analysis

A11-positive ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-amyloid Oligomer Preparation and Assessment Using Dot Blotting Analysis

A11-positivo β-amiloide oligómero preparación y evaluación mediante Dot blot análisis

&#946;-amyloid (A&#946;) is a hydrophobic peptide with an intrinsic tendency to self-assemble into aggregates. Among various aggregates, A&#946; oligomer ...

Identification of Functional Protein Regions Through Chimeric Protein Construction

Identificación de regiones de la proteína funcional a través de la construcción de la proteína quimérica

The goal of this protocol encompasses the design of chimeric proteins in which distinct regions of a protein are replaced by their corresponding sequences ...

Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein

Caracterización a nivel molecular utilizando enfoques bioquímicos robustos de una nueva proteína kinasa

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important ...