Name: robust comparison of protein levels across tissues and throughout development using standardized quantitative western blotting
Uploaded: 2019-04-09T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Robust Comparison of Protein Levels Across Tissues and Throughout Development Using Standardized Quantitative Western Blotting at JoVE.com

E.J.N.G. stöds av Wellcome Trust (grant 106098/Z/14/Z). Annan finansiering har lämnats av SMA Trust (SMA UK konsortiet. T.H.G. & Y-T. H.), SMA Europa (T.H.G, D.v.D.H. & E.J.N.G.), University of Edinburgh DTP i Precision Medicine (T.H.G., L.L. & ask.) och Euan MacDonald centrum för motorneuronsjukdom Disease Research (T.H.G).

Vävnader för detta förfarande erhölls från djurstudier som godkändes av den interna etiska kommittén vid universitetet i Edinburgh och utfördes i överensstämmelse med institutionella och UK Home Office föreskrifter under ledning av relevanta personliga och projektet licenser.
Obs: Detta protokoll har optimerats med hjälp av standardiserade, kommersiellt tillgängliga kit och reagenser för att öka reproducerbarhet (se Tabell för material).
<p class="jove_titl...

<ol>
	<li>Bertoni, T. A., Perenha-Viana, M. C., Patussi, E. V., Cardoso, R. F., Svidzinski, T. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Western+blotting+is+an+efficient+tool+for+differential+diagnosis+of+paracoccidioidomycosis+and+pulmonary+tuberculosis.">Western blotting is an efficient tool for differential diagnosis of paracoccidioidomycosis and pulmonary tuberculosis.</a> Clinical and Vaccine Immunology. 19 (11), 1887-1888 (2012).</li><li>Hutchinson, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Costs+and+outcomes+of+laboratory+diagnostic+algorithms+for+the+detection+of+HIV.">Costs and outcomes of laboratory diagnostic algorithms for the detection of HIV.</a> Journal of Clinical Virology. 58 Suppl 1, (2013).</li><li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets:+procedure+and+some+applications.">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li><li>Eaton, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+protein+analysis+as+a+reliable+loading+control+for+quantitative+fluorescent+Western+blotting.">Total protein analysis as a reliable loading control for quantitative fluorescent Western blotting.</a> PloS One. 8 (8), e72457 (2013).</li><li>Ghosh, R., Gilda, J. E., Gomes, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+necessity+of+and+strategies+for+improving+confidence+in+the+accuracy+of+western+blots.">The necessity of and strategies for improving confidence in the accuracy of western blots.</a> Expert Rev Proteomics. 11 (5), 549-560 (2014).</li><li>Jensen, B. C., Swigart, P. M., Simpson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ten+commercial+antibodies+for+alpha-1-adrenergic+receptor+subtypes+are+nonspecific.">Ten commercial antibodies for alpha-1-adrenergic receptor subtypes are nonspecific.</a> Naunyn-Schmiedebergs Archives of Pharmacology. 379 (4), 409-412 (2009).</li><li>Jositsch, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suitability+of+muscarinic+acetylcholine+receptor+antibodies+for+immunohistochemistry+evaluated+on+tissue+sections+of+receptor+gene-deficient+mice.">Suitability of muscarinic acetylcholine receptor antibodies for immunohistochemistry evaluated on tissue sections of receptor gene-deficient mice.</a> Naunyn-Schmiedebergs Archives of Pharmacology. 379 (4), 389-395 (2009).</li><li>Smejkal, G., Gallagher, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+semidry+protein+transfer+efficiency+with+transverse+gradient+gel+electrophoresis.">Determination of semidry protein transfer efficiency with transverse gradient gel electrophoresis.</a> Biotechniques. 16 (2), (1994).</li><li>Eaton, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+modern+quantitative+fluorescent+western+blotting+with+troubleshooting+strategies.">A guide to modern quantitative fluorescent western blotting with troubleshooting strategies.</a> Journal of Visualized Experiments. (93), e52099 (2014).</li><li>Hunter, G., Roche, S. L., Somers, E., Fuller, H. R., Gillingwater, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+storage+parameters+on+measurement+of+survival+motor+neuron+(SMN)+protein+levels:+implications+for+pre-clinical+studies+and+clinical+trials+for+spinal+muscular+atrophy.">The influence of storage parameters on measurement of survival motor neuron (SMN) protein levels: implications for pre-clinical studies and clinical trials for spinal muscular atrophy.</a> Neuromuscular Disorders. 24 (11), 973-977 (2014).</li><li>Fosang, A. J., Colbran, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transparency+Is+the+Key+to+Quality.">Transparency Is the Key to Quality.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (50), 29692-29694 (2015).</li><li>Taylor, S. C., Berkelman, T., Yadav, G., Hammond, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+defined+methodology+for+reliable+quantification+of+Western+blot+data.">A defined methodology for reliable quantification of Western blot data.</a> Molecular Biotechnology. 55 (3), 217-226 (2013).</li><li>Goasdoue, K., Awabdy, D., Bjorkman, S. T., Miller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standard+loading+controls+are+not+reliable+for+Western+blot+quantification+across+brain+development+or+in+pathological+conditions.">Standard loading controls are not reliable for Western blot quantification across brain development or in pathological conditions.</a> Electrophoresis. 37 (4), 630-634 (2016).</li><li>Rocha-Martins, M., Njaine, B., Silveira, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avoiding+pitfalls+of+internal+controls:+validation+of+reference+genes+for+analysis+by+qRT-PCR+and+Western+blot+throughout+rat+retinal+development.">Avoiding pitfalls of internal controls: validation of reference genes for analysis by qRT-PCR and Western blot throughout rat retinal development.</a> PloS One. 7 (8), e43028 (2012).</li><li>Aghamaleky Sarvestany, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+quantitative+proteomic+profiling+identifies+disruption+of+ubiquitin+homeostasis+as+a+key+driver+of+Schwann+cell+defects+in+spinal+muscular+atrophy.">Label-free quantitative proteomic profiling identifies disruption of ubiquitin homeostasis as a key driver of Schwann cell defects in spinal muscular atrophy.</a> Journal of Proteome Research. 13 (11), 4546-4557 (2014).</li><li>Fuller, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+Muscular+Atrophy+Patient+iPSC-Derived+Motor+Neurons+Have+Reduced+Expression+of+Proteins+Important+in+Neuronal+Development.">Spinal Muscular Atrophy Patient iPSC-Derived Motor Neurons Have Reduced Expression of Proteins Important in Neuronal Development.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 506 (2015).</li><li>Liu, N. K., Xu, X. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=beta-tubulin+is+a+more+suitable+internal+control+than+beta-actin+in+western+blot+analysis+of+spinal+cord+tissues+after+traumatic+injury.">beta-tubulin is a more suitable internal control than beta-actin in western blot analysis of spinal cord tissues after traumatic injury.</a> Journal of Neurotrauma. 23 (12), 1794-1801 (2006).</li><li>Moritz, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tubulin+or+Not+Tubulin:+Heading+Toward+Total+Protein+Staining+as+Loading+Control+in+Western+Blots.">Tubulin or Not Tubulin: Heading Toward Total Protein Staining as Loading Control in Western Blots.</a> Proteomics. 17 (20), (2017).</li><li>Groen, E. J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+and+tissue-specific+variability+of+SMN+protein+levels+in+mouse+models+of+spinal+muscular+atrophy.">Temporal and tissue-specific variability of SMN protein levels in mouse models of spinal muscular atrophy.</a> Human Molecular Genetics. 27 (16), 2851-2862 (2018).</li><li>Chaytow, H., Huang, Y. T., Gillingwater, T. H., Faller, K. M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+survival+motor+neuron+protein+(SMN)+in+protein+homeostasis.">The role of survival motor neuron protein (SMN) in protein homeostasis.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. , (2018).</li><li>Groen, E. J. N., Talbot, K., Gillingwater, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+therapy+for+spinal+muscular+atrophy:+promises+and+challenges.">Advances in therapy for spinal muscular atrophy: promises and challenges.</a> Nature Reviews: Neurology. 14 (4), 214-224 (2018).</li><li>Fitzmaurice, G. M., Laird, N. M., Ware, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Applied longitudinal analysis. , (2004).</li><li>Jordan, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Population+sampling+affects+pseudoreplication.">Population sampling affects pseudoreplication.</a> PLoS Biology. 16 (10), e2007054 (2018).</li><li>LaFauci, G., Adayev, T., Kascsak, R., Brown, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+Quantification+of+the+Fragile+X+Mental+Retardation+Protein+1+(FMRP).">Detection and Quantification of the Fragile X Mental Retardation Protein 1 (FMRP).</a> Genes (Basel). 7 (12), (2016).</li></ol>

Med lämplig experimentell design, kontrollåtgärder och statistisk analys, kan western blotting användas för att göra tillförlitliga kvantitativa uppskattningar av proteinuttryck inom och mellan ett varierat utbud av biologiska prover. Det protokoll som vi beskriver i det nuvarande manuskriptet syftar till att tjäna som riktlinje för forskare som vill använda Western blotting för att genomföra kvantitativ analys över större och mer komplexa grupper av prover, med hjälp av en kombination av fluorescens-baser...

Western blotting är en teknik som ofta används för att påvisa och kvantifiera proteinuttryck, inklusive i vävnad homogenates eller extrakt. Under åren, har denna teknik lett till många framsteg inom både grundforskning och klinisk forskning, där det kan användas som ett diagnostiskt verktyg för att identifiera förekomst av sjukdom1,2. Western blotting beskrevs första gången 1979 som en metod att överföra proteiner från polyakrylamidgeler till nitrocellulosa ark och därefter visualisera proteiner med hjälp av sekundära antikroppar som antingen radioaktivt märkta eller konjugerat med fluorescein eller peroxidas3. Genom utveckling av kommersiellt tillgängliga kit och utrustning, har Western blotting metoder alltmer standardiseras och förenklas genom åren. Tekniken utförs faktiskt nu lätt av forskare med varierande bakgrunder och nivåer av erfarenhet. Men som med många liknande experimentella tekniker, påverkas resultatet av Western blot analyser lätt av val som gjorts i utformning och utförande av experimentet. Det är därför viktigt att tillgängligheten till standardiserade Western blotting metoder inte skymma behovet av noggrann experimentell planering och design. Experimentell överväganden inkluderar, men är inte begränsat till, prov förberedelse och hantering, urval och validering av antikroppar för protein upptäckt och gel-till-membran överföring effektivitet av särskilt små eller stora (< 10 eller > 140 kDa) proteiner4,5,6,7,8,9. Protein kvaliteten på det ursprungliga provet spelar en betydande roll för resultatet av den efterföljande Western blot-analysen. Som protein kan extraheras från en mängd olika prover och källor, inklusive cellinjer, vävnader från djurmodeller och post mortem mänskliga vävnader, krävs konsekvens i hantering och bearbetning för att erhålla reproducerbara resultat. Till exempel när långsiktig lagring av prover för protein utvinning krävs, är det viktigt att inse att, även om protein är generellt stabil vid-80 ° C, skillnader i protein stabilitet mellan extraherade proteiner och intakta vävnader vid-80 ° C har varit rapporterade10. Dessutom för att erhålla reproducerbara uppskattningar av kvantiteter som protein, är konsekvent homogenisering av prov avgörande. Optimera olika lysis buffertar och homogenisering metoder (t.ex. manuell homogenisering jämfört med automatiserade metoder) kan krävas innan ett storskaligt kvantitativa experiment.
Normalisering-strategier för att korrigera för protein lastning och kvantifiering variabilitet är viktiga att få robust, kvantitativa resultat av proteinuttryck. Städning proteiner som β-aktin, har α-tubulin, β-tubulin och glyceraldehyd-3-fosfat dehydrogenas (GAPDH) traditionellt använts till att normalisera proteinnivåer för kvantifiering. Normalisering till specifika städning proteiner för kvantifiering ändamål har dock kritiserats alltmer under de senaste par år11,12. Till exempel kan uttrycket av städning proteiner ändra över olika utvecklingsstadier13,14, över vävnader från samma djur4, och enligt olika sjukdom villkor4,15 ,16,17. Därför, användningen av specifika städning proteiner begränsar möjligheterna att göra mer komplexa jämförelser mellan proteinuttryck från olika vävnader, vid olika tidpunkter och under varierande försöksbetingelser. Ett alternativ till städning proteiner till kontroll för protein lastning variation är användningen av en totalt protein fläck (TPS) som etiketter och visualiserar alla proteiner i en provet. TPS tillåter signal normalisering baserat på totalprotein belastning i stället för att nivåerna av ett specifikt protein och därför kvantifiering av TPS signal bör vara jämförbara och reproducerbara oavsett experimentella villkor, Provtyp eller utvecklingsmässiga tidpunkt . Ponceau S, fläck-fri geler, Coomassie R-350, Sypro-Ruby, Epicocconone, Amydo Black och Cy5 (ses i ref. 18) är exempel på totalt proteinfläckar. Dessa metoder har särskilda fördelar och begränsningar och val av metod beror på tiden och verktygen samt de experiment4,18.
Förutom att använda en TPS för att korrigera för inom-membran lastning och kvantifiering variabilitet, kan det vara nödvändigt att jämföra prover mellan olika membran, särskilt när du utför storskaliga proteinanalys uttryck. Variabilitet i faktorer såsom antikropp bindande effektivitet och totalt protein fläcken intensitet kan dock införa ytterligare variabilitet mellan protein prover som analyseras på separata geler och membran. För robust kvantifiering i denna situation är det därför nödvändigt att införa ett ytterligare normalisering steg för mellan-membran variabilitet. Detta kan uppnås genom en intern lastning standard på varje separat analyserade membran som hålls konstant över experiment. Denna standard kan ta form av något protein lysat som kan erhållas i tillräckliga mängder för att användas över alla membran ingår i experimentet. Här använder vi en lysate av mus hjärnan (erhålls från 5 dagar gamla kontroll möss), som hjärnan är lätt homogeniseras och proteinet erhållna lysate innehåller en betydande mängd protein på en hög koncentration. Laddar en intern standard i tre exemplar kan prover på separata membran ska normaliseras och jämförs direkt.
Här beskriver vi ett detaljerat protokoll som vi har utvecklats för att tillåta oss att genomföra komplexa jämförelser av protein uttryck variation mellan olika vävnader, mus-modeller (inklusive sjukdomsmodeller) och utvecklingsmässiga tidpunkter19. Genom att kombinera en fluorescerande TPS med användning av en intern lastning standard, kunde vi övervinna befintliga begränsningar i antalet prover och experimentella förhållanden som kan jämföras inom ett enda experiment. Detta tillvägagångssätt utökar användningen av traditionella Western blot teknik, vilket innebär att forskare att utforska proteinuttryck i olika vävnader och prover.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fine Tipped Gel Loading Tips</td>
			<td>Alpha Laboratories</td>
			<td>GL20057SNTL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halt Protease Inhibitor Cocktail, EDTA-free 100x 5mL</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>78437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Handheld homogeniser&#160;</td>
			<td>VWR Collection</td>
			<td>431-0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iBlot 2 Gel Transfer Device</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>IB21001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iBlot Transfer Stack, PVDF, regular size</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>IB401031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Studio Lite</td>
			<td>Licor</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Free download from https://www.licor.com/bio/products/software/image_studio_lite/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 800CW secondary antibodies</td>
			<td>Licor</td>
			<td>--</td>
			<td>Select appropriate secondary antibody that is specific against host of primary antibody.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Novex Sharp Pre-stained Protein Standard</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>LC5800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15-well</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>NP0323BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE LDS Sample Buffer (4X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>NP0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE MOPS SDS Running Buffer (20X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>NP0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey Blocking Buffer</td>
			<td>Licor</td>
			<td>927-40000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Mouse anti-SMN (survival motor neuron) monoclonal antibody</td>
			<td>BD Transduction Laboratories</td>
			<td>610646</td>
			<td>Is used extensively in the SMN/SMA literature and gives consistent results regardsless of lot number</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REVERT Total Protein Stain, 250 mL&#160;</td>
			<td>Licor</td>
			<td>926-11021&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>REVERT Wash Solution&#160;</td>
			<td>Licor</td>
			<td>926-11012&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA Lysis and Extraction Buffer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>89900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XCell&#160;SureLock Mini-Cell</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>EI0001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

robust comparison of protein levels across tissues and throughout development using standardized quantitative western blotting

Western blotting är en teknik som ofta används för att påvisa och kvantifiera proteinuttryck. Under åren, har denna teknik lett till många framsteg inom både grundforskning och klinisk forskning. Men som med många liknande experimentella tekniker, påverkas resultatet av Western blot analyser lätt av val som gjorts i utformning och utförande av experimentet. Specifika städning proteiner har traditionellt använts till att normalisera proteinnivåer för kvantifiering, men dessa har ett antal begränsningar och har därför kritiserats alltmer de senaste åren. Här beskriver vi ett detaljerat protokoll som vi har utvecklats för att tillåta oss att genomföra komplexa jämförelser av protein uttryck variation mellan olika vävnader, mus-modeller (inklusive sjukdomsmodeller) och utvecklingsmässiga tidpunkter. Med hjälp av en fluorescerande totalprotein fläck och införa användning av en intern lastning standard, är det möjligt att övervinna befintliga begränsningar i antalet prover som kan jämföras inom experiment och systematiskt jämföra proteinnivåer över en en rad experimentella förhållanden. Detta tillvägagångssätt utökar användningen av traditionella western blot teknik, vilket innebär att forskare att utforska proteinuttryck i olika vävnader och prover.

Vi har exempel på användning av TPS och intern standard för att underlätta jämförelser av proteinnivåer över vävnader och tidpunkter. Figur 1 visar resultat från Western blotting på protein som utvinns ur vävnaderna från neonatal (postnatal dag 5) jämfört med vuxna möss (10 - vecka gammal). TPS och Smn immunoblot visas i figur 1A, C. Kvantifiering av fluorescensintensiteten hos TPS uppnåddes geno...

Watch this Scientific Journal Video about Robust Comparison of Protein Levels Across Tissues and Throughout Development Using Standardized Quantitative Western Blotting at JoVE.com

Robust Comparison of Protein Levels Across Tissues and Throughout Development Using Standardized Quantitative Western Blotting

Denna metod beskriver en robust och reproducerbar metod för jämförelse av proteinnivåer i olika vävnader och vid olika utvecklande tidpunkter med hjälp av standardiserade kvantitativa western blotting tillvägagångssättet.

Robust jämförelse av proteinnivåer över vävnader och hela utveckling med hjälp av standardiserade kvantitativa Western Blotting

Western blotting is a technique that is commonly used to detect and quantify protein expression. Over the years, this technique has led to many advances ...

Detta protokoll kan användas för att ta itu med viktiga frågor i grundläggande och klinisk forskning genom att titta på proteinuttryck över olika vävnader och tidspunkter. För att utföra pålitlig kvantitativ Västerländsk blotting kombinerar vi en fluorescerande total proteinfläck med en intern lastningskontroll. Detta övervinner begränsningar som uppstår när man jämför olika vävnader över experimentella förhållanden.För att extrahera proteiner från snapinfrysta cell- eller vävnadsprover tina minus-80-gradersproven på is innan man tvättar proverna i förekommande fall, enligt tabellen. Med hjälp av en handhållen elektrisk homogenisator med en polypropylen mortelstöt, homogenisera de tvättade proverna, skölja mortelstöten i dubbeldestillerat vatten och torkning med en ren vävnad mellan proverna. Låt proverna vara kvar på is i 10 minuter, följt av centrifugering.Sedan överför du protein-provhaltig supernatant till ett nytt rör på is utan att störa pelleten. För kvantifiering av proteinkoncentrationen, inrätta bovint serumalbumin standarder vid ökande koncentrationer i tre exemplar, och tillsätt en mikroliter av varje proteinprov i duplikat till lämpliga brunnar av en 96-väl optisk platta. Inkubera proteinet på ett 60-graders-Celsius-värmeblock i 10 minuter eller längre om proteinkoncentrationen förväntas vara låg och mäta absorptionen vid 560 nanometer på en tallriksläsare.Exportera plattläsarmätningarna och beräkna proteinkoncentrationen genom att jämföra de genomsnittliga absorbansvärdena för varje prov med en standardkurva som erhålls med hjälp av proteinstandarden. För att normalisera mängden protein, förbered spädningar av proteinproverna i provbuffert och ultrarent vatten och inkubera proverna i ett 70-graders-Celsius-värmeblock i 10 minuter. Placera sedan proverna på is innan du virvlar och kort centrifugerar.För elektrofores, inrätta en precast fyra till 12%Bis-Tris gradient gel i gelen elektrofores kammare systemet och ladda 3,5 mikroliter av ett protein standard i brunnen. Vid användning av en intern standard för mellan-membrannormalisering, ladda en mängd som är lika med de andra proverna i de tre första brunnarna bredvid proteinstegen och ladda 30 mikrogram av varje prov i de återstående brunnarna. Kör sedan proverna genom staplingsgelen på 80 volt i 10 minuter följt av 150 volt i ytterligare 45 till 60 minuter.I slutet av elektrofores, för att montera överföring stacken, placera protein gel på botten stacken innehåller polyvinyliden difluorid membran följt av filterpapper. Använd blottingrullen för att ta bort eventuella luftbubblor och placera den övre bunten på ovansidan av filterpapperet innan du rullar bunten igen för att ta bort luftbubblor. Överför hela stacken i överföringsanordningen med elektroden på enhetens vänstra sida och placera gelsvampen ovanpå bunten så att svampen är i linje med motsvarande elektriska kontakter på enheten.Efter stängning av locket, välj och starta lämpligt program. I slutet av programmet, skär membranet till gelstorleken och tvätta skärmembranet snabbt med dubbeldestillerat vatten innan du fortsätter med den totala proteinfläcken. För total proteinfärgning rullar du in membranet i ett 50-milliliterrör med proteinsidan vänd inåt och märker membranet med fem milliliter proteinfläckslösning på en rulle i fem minuter vid rumstemperatur i en rökhuva.I slutet av inkubationen, tvätta membranet snabbt med fem milliliter av tvättlösning, återföra röret kort till rullen mellan tvättarna, följt av en kort sköljning med ultrarent vatten. Tillsätt tre milliliter blockerande buffert till membranet och återföra membranet till valsen i 30 minuter vid rumstemperatur. Ersätt den blockerande bufferten med den primära antikroppen av intresse vid lämplig optimerad koncentration och inkubera membranet på valsen över natten vid fyra grader Celsius.Nästa dag, tvätta membranet sex gånger i fem minuter med fem milliliter färsk PBS per tvätt på rullen vid rumstemperatur. Efter den sista tvätten inkuberas membranet med lämplig sekundär antikroppslösning på rullen under en timme vid rumstemperatur följt av tre tvättar i 30 minuter per tvätt. Efter den sista tvätten, torka membranet och använd aluminiumfolie för att hålla membranet skyddat från ljus.För bildanskaffning, placera membranet på skannern med proteinsidan vänd nedåt och välj skanningsområdet i programvaran. Sedan, skaffa bilder i båda kanalerna och exportera bilderna till en lämplig bild analysprogram. Visa 700-nanometerkanalen för att visa det totala proteinfärgningsresultatet och Välj analys och Rita rektangel för att definiera området av intresse för normalisering.Sedan kopierar och klistrar du in det första rektangelområdet på varje enskilt prov för att säkerställa att den definierade regionen har samma storlek för alla de analyserade körfälten. För att kvantifiera proteinkoncentrationen i varje körfält kopierar du resultaten från både den totala proteinfläcken och proteinet av intresse för ett kalkylprogram och bestämmer den högsta totala proteinfläckssignalen. Sedan, dela varje totalt protein fläck signal värde med detta värde för att erhålla det normaliserade proteinet lastning värde och dela upp 800-nanometer signalvärdet från varje enskilt prov genom dess motsvarande normaliserade protein värde för att beräkna det relativa proteinet uttryck förhållandet i olika prover.I dessa representativa västerländska blots jämförs proteiner som utvinns ur vävnader som erhållits från postnatal dag fem möss med proteiner som utvinns från 10 veckor gamla vuxna möss. Kvantifiering av fluorescensintensiteten hos den totala proteinfläcken uppnåddes genom att fluorescensintensiteten mättes inuti rektangelrutan på varje körfält. När hela körfält analyseras förblir fluorescensintensiteten relativt lik mellan prover, vilket indikerar att det är lämpligt för detta ändamål att använda den totala proteinfläcken för normalisering.Den fluorescerande totala proteinfläcken kan också användas för att jämföra proteinnivåer vid olika utvecklingstidspunkter. Till exempel, även om överlevnad motor neuron proteinnivåer klart minska med åldern hos möss, det totala proteinet färgade kvantifiering förblir konstant. Användningen av interna standarder, fluorescensbaserad normalisering och adekvat statistik ökar robustheten hos komplex proteinuttrycksanalys över olika förhållanden.Detta protokoll lägger till traditionella västerländska blot tekniker, övervinna frågorna om lämpliga lastning kontroller och jämförelser över experimentella partier, och ger flexibilitet för protein uttryck analys. Detta tillvägagångssätt kan utvidgas till att jämföra proteinuttryck under andra experimentella förhållanden.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Använda Scaffold Liposomer att återskapa Lipid-proximala protein-proteininteraktioner<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

SorLA and CLC:CLF-1-dependent Downregulation of CNTFR&#945; as Demonstrated by Western Blotting, Inhibition of Lysosomal Enzymes, and Immunocytochemistry

SorLA and CLC:CLF-1-dependent Downregulation of CNTFRÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â± as Demonstrated by Western Blotting, Inhibition of Lysosomal Enzymes, and Immunocytochemistry

SorLA och CLC: CLF-1-beroende nedreglering av CNTFRa som framgår av Western blotting, Hämning av lysosomala enzymer och Immunocytochemistry

The heterodimeric cytokine Cardiotrophin-like Cytokine:Cytokine-like Factor-1 (CLC:CLF-1) targets the glycosylphosphatidylinositol (GPI)-anchored ...

Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging (cPILOT)

Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging cPILOT

Förbättrad Prov Multiplexing av vävnader med användning Kombinerade Prekursor isotopmärkning och Isobaric Tagging (cPILOT)

There is an increasing demand to analyze many biological samples for disease understanding and biomarker discovery. Quantitative proteomics strategies ...

A Western Blotting Protocol for Small Numbers of Hematopoietic Stem Cells

En Western Blotting protokoll för litet numrerar av hematopoetiska stamceller

Hematopoietic stem cells (HSCs) are rare cells, with the mouse bone marrow containing only ~25,000 phenotypic long term repopulating HSCs. A Western ...

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis (QDB)

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis QDB

Hög genomströmning, absolut bestämning av halten av ett Protein som är valda på vävnad nivåer med hjälp av kvantitativa Dot Blot analys (QDB)

Lacking a convenient, quantitative, high throughput immunoblot method for absolute determination of the content of a specific protein at cellular and ...

A11-positive &#946;-amyloid Oligomer Preparation and Assessment Using Dot Blotting Analysis

A11-positive ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-amyloid Oligomer Preparation and Assessment Using Dot Blotting Analysis

A11-positiv β-amyloid oligomerer beredning och bedömning med hjälp av Dot Blotting analys

&#946;-amyloid (A&#946;) is a hydrophobic peptide with an intrinsic tendency to self-assemble into aggregates. Among various aggregates, A&#946; oligomer ...

Identification of Functional Protein Regions Through Chimeric Protein Construction

Identifiering av funktionellt Protein regioner genom chimära Protein konstruktion

The goal of this protocol encompasses the design of chimeric proteins in which distinct regions of a protein are replaced by their corresponding sequences ...

Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein

Karakterisering på molekylär nivå med hjälp av robusta biokemiska metoder för ett nytt Kinas protein

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important ...