Name: real-time in vitro monitoring of odorant receptor activation by an odorant in the vapor phase
Uploaded: 2019-04-23T14:00:00
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这项工作得到了国家卫生研究院 (DC014423 和 DC016224) 和国防高级研究项目机构现实鼻子项目的赠款。YF 留在杜克大学, 得到 JPS 推进战略国际网络以加快人才培养人员流通的财政支持 (R2801)。我们感谢萨哈尔·卡莱姆编辑的手稿。

1. Hana3A 细胞培养
<ol><li>制备 M10 (最小必需培养基 (MEM) 加 10% v/v 胎儿牛血清 (FBS)) 和 M10PSF (M10 + 100μgml penicilin 链霉素和1.25μgml 两性霉素 B)。</li>
	<li>在37°c 和5% 二氧化碳 (CO 2) 的孵化器中, 在100毫米细胞培养盘中培养 M10PSF 10 毫升中的细胞.</li>
	<li>每2天以20% 的比例分割细胞: 当在相对照显微镜下观察到100% 的细胞融合 (约 1.1 x 10 7 细胞) 时, 渴望培养基, 并用10毫升磷酸盐缓冲盐水 (pb...

气味的感知从根本上取决于 ORs 的激活。因此, 需要了解它们的功能, 以破解大脑用来感知其挥发性化学环境的复杂机制。然而, 由于难以建立一个可靠的方法来筛选 OR 曲目的功能, 以防止在体外的气味, 这阻碍了对这一过程的理解.通过创建标记受体13、19以及发现和优化 osn22中表达的受体-运输蛋白 (rtp), 部分解决了 or 的细胞表面?...

嗅觉使陆地动物能够与它们易挥发的化学环境相互作用, 从而激发行为和情绪。从根本上说, 气味检测过程始于气味分子与嗅觉系统的第一次相互作用, 达到气味受体 (ORs)的水平1。在哺乳动物中, Or 在位于嗅觉上皮2中的嗅觉感觉神经元 (Osn) 中单独表达.它们属于 g 蛋白偶联受体 (GPCR) 家族, 更精确地属于罗多普素类亚家族 (也称为 a 类)。ORs 与刺激 g 蛋白 G f结合, 其激活导致 camp 产生, 然后打开循环核苷酸门控通道和动作电位的产生。人们承认, 气味感知依赖于激活 ors3, 4 的特定模式, 因此气味识别遵循组合编码方案, 其中一个 or 可以被一组气味激活, 一个气味可以激活运算。通过这种组合编码, 人们假设生物体可以检测并区分无数挥发性气味分子。了解气味是如何被感知的关键之一是了解如何以及哪些 ORs 是由给定的气味激活的。
为了阐明气味或相互作用, 体外功能检测发挥了至关重要的作用。通过使用各种体外、体外和体内功能检测 5, 6, 7, 鉴定孤儿的激动剂气味配体 (or 去孤儿) 是一个非常活跃的领域. , 8,9,10,11,12, 13,14, 15,16, 17岁
体外检测系统最适合于 Or 的详细功能表征, 包括识别 Or 的功能域和关键残基, 以及潜在的工程应用。然而, 进一步开发有价值的 ORs 体外系统一直是一个挑战, 部分原因是难以培养 Osn 和在异源细胞中的 ORs 的功能表达。第一个挑战是建立协议, 允许在气味或相互作用的映射中表达功能 Or 的细胞表面。一些独立小组采用了各种办法5、6、7、8、9、10、11、12、 14,18,19,20。K拿特沃斯特等人在标记为 ors n 端的结果中, 用缩短的视紫红质 (rhor 标记) 序列, 观察到人类胚胎肾 (HEK) 细胞13的表面表达得到改善。对附加到 or 序列的标记所做的更改仍然是为改进 or 表达式和功能19、21 而探索的路径。Saito 等人随后确定了促进或贩运的受体转运蛋白 1 (rtp1) 和 RTP2。22一个较短的 RTP1 版本, 称为 RTP1S, 也被证明比原来的蛋白质23更有效。稳定表达 g f、reep1、RTP1 和 RTP2 24的细胞系 (Hana3A) 的发展, 再加上使用环状单磷酸腺苷 (camp) 记者, 可以识别气味或相互作用.RTP 系列蛋白质促进 ors 细胞表面表达的机制仍有待确定。
这些既定的方法之一是, 他们依靠在液相气味刺激, 这意味着气味是预先溶解到刺激介质, 并通过取代培养基刺激细胞。这与气味分子在气相到达嗅觉上皮并通过溶解到鼻黏膜中激活 Or 的生理条件有很大的不同。为了更接近生理相关的刺激暴露, Sanz 等人20 提出了一种基于蒸汽刺激的方法, 应用一滴气味溶液挂在放置在细胞井顶部的塑料薄膜的内脸下。他们通过监测荧光强度记录钙的反应。这种方法是首次使用气相气味刺激, 但它不允许大的筛选 OR 激活。
在这里, 我们开发了一种新的方法, 通过光泽度分析, 可以通过气相气味刺激实时监测体外或体外激活 (图 1)。这种检测方法以前曾用于液体气味刺激18,19,25,26, 27,28, 29,30,31. 在平板读数之前, 发光计的监测室首先与蒸发气味平衡 (图 1a)。然后将气味分子溶解到缓冲液中, 沐浴表示有兴趣的 Or、RTP1S 和光泽细胞蛋白的 Hana3A 细胞 (图 1b)。如果气味剂是 OR 的激动剂, OR 将切换到激活的构象并绑定 Gf,激活腺苷环化酶 (ac), 并最终导致 camp 水平上升。这种上升的 cAMP 将结合和激活光泽蛋白, 产生发光催化荧光素。然后, 该发光被测光仪记录, 并启用或激活监测。这种方法在 OR 脱非的背景下引起了极大的兴趣, 因为它使体外系统更接近于气味的自然感知。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:867px;" width="866">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:205px;">0.05 % trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:93px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">25300-054</td>
			<td style="width:449px;">0.05% Trypsin - EDTA (1x), phenol red - store at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100 mm cell culture dish&#160;</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353003</td>
			<td>100 mm x 20 mm cell culture dish&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">15 mL tube</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352099</td>
			<td style="width:449px;">17 mm x 120 mm conical tubes</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:205px;">96-well plate</td>
			<td style="width:93px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">3843</td>
			<td style="width:449px;">96 well, with LE lid white with clear bottom Poly-D-lysine coated Polystyrene</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">Amphotericin</td>
			<td style="width:93px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15290-018</td>
			<td style="width:449px;">Amphotericin B 250 &#181;g/mL - store at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">centrifuge machine</td>
			<td>Jouan</td>
			<td>C312</td>
			<td style="width:449px;">Centrifuge machine with swinging bucket rotor for 15 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Class II Type A/B3 fumehood</td>
			<td>NUAIRE</td>
			<td>NU-407-500</td>
			<td style="width:449px;">fumehood for cell culturing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:205px;">FBS</td>
			<td style="width:93px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">16000-044</td>
			<td style="width:449px;">Fetal Bovine Serum - store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:205px;">GloSensor cAMP Reagent</td>
			<td style="width:93px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">E1290</td>
			<td style="width:449px;">GloSensor cAMP Reagent luminescent protein substrate - store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Incubator 37 &#176;C; 5 % CO2</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-676-604</td>
			<td style="width:449px;">Incubator for cell culturing</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Lipofectamine 2000 reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668-019</td>
			<td style="width:449px;">Lipofectamine 2000 Reagent 1mg/ml transfection reagent - store at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Luminometer POLARstar OPTIMA</td>
			<td>BMG LABTECH</td>
			<td>discontinued</td>
			<td style="width:449px;">96 well plate reader for luminescence</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:205px;">Mineral oil</td>
			<td style="width:93px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M8410</td>
			<td style="width:449px;">Solvent for odorants - store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:205px;">Minimum Essential Medium (MEM)</td>
			<td style="width:93px;">Corning cellgro</td>
			<td style="width:119px;">10-010-CV</td>
			<td style="width:449px;">Minimum Essential Medium Eagle with Earle&#8217;s salts &#38; L-glutamine - store at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:205px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P4333</td>
			<td style="width:449px;">Penicillin-Streptomycin solution stabilized with 10,000 U of penicillin and 10 mg streptomycin - store at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:205px;">pGlosensor</td>
			<td style="width:93px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">E2301</td>
			<td style="width:449px;">pGloSensor-22F cAMP luminescent protein plasmid - store at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">phase contrast microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>090-131.001</td>
			<td style="width:449px;">phase contrast microscope with x4, x10, x20 objectives</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:205px;">RTP1S</td>
			<td style="width:93px;">H. Matsunami lab</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td style="width:449px;">100 ng/&#181;L plasmid - store at 4&#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time in vitro monitoring of odorant receptor activation by an odorant in the vapor phase

嗅觉感知始于气味与嗅觉感觉神经元 (OSN) 表达的气味受体 (OR) 的相互作用。气味识别遵循组合编码方案, 其中一个 OR 可以由一组气味激活, 一个气味可以激活 Or 的组合。通过这种组合编码, 生物体可以检测和区分无数的挥发性气味分子。因此, 在给定浓度下的气味可以用 Or 的激活模式来描述, 这是指每个气味所特有的。从这个意义上说, 破解大脑用来感知气味的机制需要理解气味或相互作用。这就是为什么嗅觉社区致力于 "去孤儿" 这些受体。传统的体外系统用于识别气味或相互作用, 使用了与气味的培养细胞介质, 这与自然检测气味的自然检测通过蒸汽气味溶解到鼻黏膜之前与 ORs。在这里, 我们描述了一种新的方法, 允许实时监测或激活通过气相气味。我们的方法依赖于使用光泽度测定的发光方法来测量 cAMP 释放。它弥合了目前体内和体外方法之间的差距, 并为仿生挥发性化学传感器提供了基础。

我们用肉桂醛蒸汽刺激筛选了三个小鼠 ORs 的反应, Olfr746、Olfr124 和 Olfr746 (图 3)。同时, 我们使用空矢量控制 (Rho-pCI) 来确保被测试的 Or 的气味诱导的活动是特定的 (图 3a)。在20个测量周期中监测了蒸汽气味刺激下的 ORs 实时激活情况。每个井的数据首先被归一化为每个周期的空矢量控制平均值 (图 3b)。需?...

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Real-time In Vitro Monitoring of Odorant Receptor Activation by an Odorant in the Vapor Phase

从生理上讲, 气味受体是由在气相中吸入的气味分子激活的。然而, 大多数体外系统使用液相气味刺激。在这里, 我们提出了一种方法, 允许实时体外监测气味受体激活对气味刺激在气相。

气相臭受体活化的实时体外监测

Olfactory perception begins with the interaction of odorants with odorant receptors (OR) expressed by olfactory sensory neurons (OSN). Odor recognition ...

我们的协议能够测量和通过气味受体面板的挥发性气味的检测和歧视。这种方法为开发基于气味受体的生物传感器开辟了可能性。该技术允许实时体外监测气味受体在蒸汽相中气味分子的激活。它填补了体外和体内方法之间的空白。此方法可用于了解导致气味感知的事件的动力学，包括粘膜代谢酶的作用。首先，根据手稿准备 M10 和 M10 PSF。细胞在37摄氏度和5%的二氧化碳下在10毫升M10PSF中培养。在相对比显微镜下观察培养皿。当它达到100%汇合时，通过吸气介质和用10毫升PBS轻轻清洗细胞，将细胞分裂到较低的浓度。然后吸气PBS，并添加三毫升的尝试素-EDTA。让它反应大约一分钟，直到细胞与盘子分离。加入五毫升的M10来灭活三辛，并上下移液器分离连接到盘子的细胞。将8毫升的细胞悬浮液从培养皿转移到15毫升的管子中，并在200次-G下离心管5分钟。吸升液，通过上下移液，将细胞重新注入M10 PSF的5毫升，以分解任何细胞质量。避免在管子中产生气泡。为了获得20%的细胞汇合，在1000毫米新的细胞培养盘中加入9毫升M10PSF，并转移1毫升的再增细胞溶液。在37摄氏度和5%的二氧化碳下孵育。这道菜，坐20%汇合，将在48小时内达到100%汇合。将盘子放在相对比显微镜下观察。服用1/10的100%细胞汇合培养皿。吸气介质，用 10 毫升 PBS 轻轻清洗细胞。然后用 trypsin-EDTA 和 M10 离心机处理细胞，然后像以前一样使用 M10 PSF 再次治疗。要实现一个96井板，从5毫升的再增电池中加入500微升至5.5毫升的新鲜M10PSF。使用多通道移液器将稀释悬浮细胞的移液器 50 微升放入 96 井板的每个井中。在37摄氏度和5%的二氧化碳下孵育过夜。首先，将96井板在相位对比显微镜下进行过夜培养，观察细胞汇合，并确保其在30%至50%之间，在1.5毫升的管中准备第一个转染混合物，该管包含整个板中常见的质粒。Rho-pCi 是一种空向量阴性对照，Olfr1377 是已知对测试的醋酸酯反应的阳性对照。将混合物分成两个包含控制质粒的转染混合物。准备含有500微升 MEM 和 20 微升脂氨胺 2000 试剂的第二个转染混合物。将第二个混合物的一半添加到每个储液罐中，然后通过上下移液轻轻混合。在室温下孵育管子15分钟。为一个96井板添加5毫升M10。在每个储液罐中加入2.5毫升，轻轻混合。用最终转染介质的 50 微升替换以前镀 96 井板中的 M10 PSF。在37摄氏度和5%的二氧化碳下孵育过夜。然后打开发光计的门，插入连接到真空泵的管子。将发光计的室真空一夜。转染后，在相对比显微镜下观察96井板，确保细胞汇合60%至100%，准备汉克平衡盐溶液的刺激溶液，其中含有10毫摩尔的海、5毫摩尔的D-葡萄糖。从96井板中去除转染介质，通过向每井添加50微升新鲜刺激溶液来清洗细胞。稀释GloSensor cAMP试剂溶液，将刺激溶液的移液器2.75毫升放入5毫升管中，并加入75微升的CAMP试剂溶液。从油井中去除刺激溶液，并在每口井中加入25微升稀释的CAMP试剂溶液。在室温下孵育96井板，在无异味的环境中孵育两小时。首先，将异味醋酸酯稀释至10毫升矿物油，并盖住管。在CAMP试剂孵育时间结束之前，在一个新的96井板中，将25微升的臭味溶液添加到每一个井中。然后将这种气味板放在发光仪室中五分钟，使室与挥发性气味分子平衡。设置亮度计以在 90 秒板测量的 20 个周期中以零秒的延迟记录亮度，周期间隔为 0.7 秒。在阅读板之前，从腔室中取下异味板。在含有转染细胞的96孔板中，在孔之间的空间中加入25微升气味，并迅速将该板放回腔室。在 30 分钟内开始所有油井的发光测量 20 个周期。在发光测量后，通过广泛吸尘读室内的除臭剂，清除发光仪内剩余的气味至少两个小时。在孵育下一个气味剂之前，先将压缩空气送五分钟，以替代新鲜空气，以避免异味挥发物的交叉污染。要开始数据分析，请从亮度计软件导出数据。平均每个录制时间相同 OR 的复制。要计算对任何最终控件的规范化 OR 响应，请将空矢量平均值除以每次记录时 OR 平均值。通过将平均 OR 响应以零秒划分到每个记录时间响应，使每个 OR 响应标准化其基底活动。要获取每个 OR 曲线的单个 OR 响应值，请求和每个 OR 的每个记录时间的所有发光值，以便获取曲线下的区域。在这个实验中，对20个测量周期的蒸汽气味刺激对小鼠的ORs进行实时激活。使用空病媒控制来确保被测试的 ORs 的异味引起的活动是具体的。每一井的数据首先归一化为每个周期的空矢量控制平均值。然后，为了比较不同的 OR 响应，数据被规范化为此测定中基底活动的 OR 级别。通过计算每个 OR 的曲线下面积，通过求和所有测量周期的发射值来计算每个 OR 的单激活值。此外，剂量依赖性反应可以通过增加的异味剂量来衡量。Olfr1377对五浓度的乙酰苯酮刺激的反应被记录下来。只有三个浓度较高的能激活Olfr1377。纯化合物刺激显示随着时间的推移，OR反应呈下降趋势，可能是由于细胞毒性。在步骤中，您应该在井之间添加稀释的异味，并准备快速开始记录板。应尽量减少添加异味与监测之间的时间，并缩短两个实验之间的时间。在阿片细胞是生物危害物质，所以提醒在适当的药房处置细胞。

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Odorant-induced Responses Recorded from Olfactory Receptor Neurons using the Suction Pipette Technique

从使用吸吸液管技术的嗅觉受体神经元的气味引起的反应记录

Animals sample the odorous environment around them through the chemosensory systems located in the nasal cavity. Chemosensory signals affect complex ...

科研

神经科学

Monitoring Changes in the Intracellular Calcium Concentration and Synaptic Efficacy in the Mollusc Aplysia

Monitoring Changes in the Intracellular Calcium Concentration and Synaptic Efficacy in the Mollusc Aplysia

监测变化的细胞内钙离子浓度和突触效能的软体动物<em&gt;海兔</em

It has been suggested that changes in intracellular calcium mediate the induction of a number of important forms of synaptic plasticity (e.g., ...

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

一个<em&gt;离体</em&gt;激光诱导脊髓损伤模型，以评估轴索变性的机制在实时

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal ...

Perforated Patch-clamp Recording of Mouse Olfactory Sensory Neurons in Intact Neuroepithelium: Functional Analysis of Neurons Expressing an Identified Odorant Receptor

鼠标嗅觉感官神经元的完整神经上皮穿孔膜片钳记录：神经元表达鉴定的气味受体功能分析

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of ...

A Protocol for the Administration of Real-Time fMRI Neurofeedback Training

实时 fMRI 神经训练管理协议

Neurologic disorders are characterized by abnormal cellular-, molecular-, and circuit-level functions in the brain. New methods to induce and control ...

Assay to Measure Nucleocytoplasmic Transport in Real Time within Motor Neuron-like NSC-34 Cells

测定在运动神经元样NSC-34细胞中实时测量核细胞质运输

Nucleocytoplasmic transport refers to the import and export of large molecules from the cell nucleus. Recently, a number of studies have shown a ...

Live-cell Measurement of Odorant Receptor Activation Using a Real-time cAMP Assay

实时 cAMP 检测气味受体激活的活细胞测量

The enormous sizes of the mammalian odorant receptor (OR) families present difficulties to find their cognate ligands among numerous volatile chemicals. ...

Localization of Odorant Receptor Genes in Locust Antennae by RNA In Situ Hybridization

Localization of Odorant Receptor Genes in Locust Antennae by RNA In Situ Hybridization

通过RNA定位蝗虫天线中的气味受体基因<em&gt;原位</em&gt;杂交

Insects have evolved sophisticated olfactory reception systems to sense exogenous chemical signals. These chemical signals are transduced by Olfactory ...

Ocular Kinematics Measured by In Vitro Stimulation of the Cranial Nerves in the Turtle

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体外刺激对龟脑神经的运动测量

After animals are euthanized, their tissues begin to die. Turtles offer an advantage because of a longer survival time of their tissues, especially when ...

Identification of Dopamine D1-Alpha Receptor Within Rodent Nucleus Accumbens by an Innovative RNA In Situ Detection Technology

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创新 RNA原位检测技术在 D1-Alpha 鼠伏隔核中多巴胺受体的鉴定

In the central nervous system, the D1-alpha subtype receptor (Drd1&#945;) is the most abundant dopamine (DA) receptor, which plays a vital role in ...