Name: excitation-scanning hyperspectral imaging microscopy to efficiently discriminate fluorescence signals
Uploaded: 2019-08-22T12:30:00
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作者希望感谢NSF 1725937、NIH P01HL066299、NIH R01HL058506、NIH S10OD020149、NIH UL1 TR001417、NIH R01HL137030、AHA 18PRE34060163和亚伯拉罕·米切尔癌症研究基金的支持。

1. 设备设置
<ol><li>光源：选择具有高功率输出和高准直的宽带光谱光源（这些研究使用了300 W Xe弧灯）。</li>
	<li>快门（可选）：向光路径添加快门，以减少延时成像的光漂白。</li>
	<li>可调滤波器系统：采用机械调谐组件和薄膜可调滤波器 （TFTF） 设置，以实现所需的波长可调激励范围（例如，360-485 nm）。</li>
	<li>显微镜：使用倒置荧光显微镜，包括电动双色滤塔和控制器。<ol>
<li>荧光滤芯：?...

激发扫描高光谱成像设置的最佳应用始于光路径的构造。特别是，光源、滤光片（可调和二色度）、滤波器切换方法和摄像机的选择决定了可用的光谱范围、可能的扫描速度、探测器灵敏度和空间采样。汞弧灯提供许多激发波长峰值，但不提供平坦的光谱输出，并且需要在输出峰值处显著减小信号，才能将光谱图像数据校正回 NIST 可追溯响应38。替代光源，如Xe弧灯和白光超连续...

光谱成像可以以各种方式进行，并指几个术语1，2，3，4。一般来说，光谱成像是指在至少两个空间维度和一个光谱维度中获取的数据。多光谱和高光谱成像通常以波长波段数或光谱波段是否连续1来区分。对于此应用，高光谱数据被定义为通过连续波长带获得的光谱数据，其间距小于用于激发的每个带通滤波器的一半最大最大宽度 （FWHM） 的全宽度的一半（即 5 nm具有 14-20 nm 带宽的带通滤波器的中心波长间距）。数据波段的连续性质允许对数据集进行过采样，从而确保在采样光谱域时满足奈奎斯特标准。
高光谱成像是由美国宇航局在1970年代和1980年代与第一颗Landsat卫星5，6联合开发的。从多个连续的光谱波段收集数据，可以生成每个像素的辐射光谱。识别和定义单个组件的辐射光谱，不仅能够通过表面材料的特性光谱进行检测，而且还能够去除中间信号，例如信号因大气条件。1996年，Schrück等人使用五种不同的荧光管及其已知光谱的组合来区分标记的染色体，这一概念在1996年应用于生物系统。光谱卡约打字7.2000年，Tsurui等人对组织样品的荧光成像技术进行了详细阐述，使用7种荧光染料和奇异值分解，实现了每个像素的光谱分离，形成参考光谱的线性组合。库8.与遥感同类产品类似，每个已知荧光光的占位可以从高光谱图像中计算，因为每个荧光的光谱都有先验的信息。
高光谱成像还用于农业9、天文学10、生物医学11、化学成像12、环境应用13、眼保健14、食品科学15、法医科学16，17，医学科学18，矿物学19，和监测20。当前荧光显微镜高光谱成像系统的一个关键限制是，标准高光谱成像技术通过 1） 首先过滤激发光来控制样品激发，然后将窄带中的荧光信号分离出来。2） 进一步过滤发射光，将荧光发射分离成窄带，以后可以数学地分离21。过滤激发照明和发射的荧光可减少可用信号量，从而降低信噪比，并需要较长的采集时间。低信号和较长的采集时间限制了高光谱成像作为诊断工具的适用性。
已经开发出一种成像模式，利用高光谱成像，但增加可用的信号，从而减少必要的采集时间21，22。这种称为激发扫描高光谱成像的新模式通过改变激发波长和收集广泛发射的光范围来获取光谱图像数据。此前已经表明，与发射扫描技术21、22相比，这种技术使信噪比上升一个数量级。信噪比的增加主要是由于检测到的发射光的宽带通（±600 nm），而特异性是通过仅过滤激发光而不是荧光发射来提供的。这使得所有发射的光（每个激发波长）都能到达探测器21。此外，该技术还可用于区分自自荧光与外源标签。此外，由于可检测信号的增加，能够缩短采集时间，从而降低光漂白的危险，并允许以光谱视频成像可接受的采集速率进行光谱扫描。
该协议的目的是作为激发扫描高光谱成像显微镜的数据采集指南。此外，还包括有助于了解光路径和硬件的说明。还介绍了用于激发扫描高光谱成像显微镜的开源软件的实现。最后，提供了有关如何将系统校准到 NIST 可追溯标准、调整软件和硬件设置以获得准确结果以及将检测到的信号解为各个组件的贡献的说明。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:2119px;" width="2120">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Airway Smooth Muscle Cells</td>
			<td style="width:327px;">National Disease Research Interchange (NDRI)</td>
			<td style="width:360px;">Isolated from human lung tissues obtained from NDRI</td>
			<td style="width:1105px;">Highly autofluorescent, calcium sensitive cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Automated Shutter</td>
			<td style="width:327px;">Thorlabs Inc.</td>
			<td style="width:360px;">SHB1</td>
			<td>Remote-controllable shutter to minimize photobleaching</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Automated Stage</td>
			<td style="width:327px;">Prior Scientific</td>
			<td style="width:360px;">H177P1T4</td>
			<td>Remote-controllable stage for automated multiple field of view or stitched image collection.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Automated Stage Controller (XY)</td>
			<td style="width:327px;">Prior Scientific</td>
			<td style="width:360px;">Proscan III (H31XYZE-US)</td>
			<td>For interfacing automated stage with computer and joystick</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Buffer</td>
			<td style="width:327px;">Made in-house</td>
			<td style="width:360px;">Made in-house</td>
			<td>145 mM NaCl, 4 mM KCl, 20 mM HEPES, 10 mM D-glucose, 1 mM MgCl2, and 1mM CaCl2, at pH 7.3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Cell Chamber</td>
			<td style="width:327px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:360px;">Attofluor Cell Chamber, A7816</td>
			<td>Coverslip holder composed of surgical stainless steel and a rubber O-ring to seal in media and prevent sample and/or objective contamination</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Excitation Filters</td>
			<td style="width:327px;">Semrock Inc.</td>
			<td style="width:360px;">TBP01-378/16</td>
			<td>Center wavelength range (340-378 nm), Bandwidth (Minimum 16 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.88)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;"></td>
			<td style="width:327px;">Semrock Inc.</td>
			<td style="width:360px;">TBP01-402/16</td>
			<td>Center wavelength range (360-400 nm), Bandwidth (Minimum 16 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.8)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;"></td>
			<td style="width:327px;">Semrock Inc.</td>
			<td style="width:360px;">TBP01-449/15</td>
			<td>Center wavelength range (400-448.8 nm), Bandwidth (Minimum 15 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.8)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;"></td>
			<td style="width:327px;">Semrock Inc.</td>
			<td style="width:360px;">TBP01-501/15</td>
			<td>Center wavelength range (448.8-501.5 nm), Bandwidth (Minimum 15 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.84)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;"></td>
			<td style="width:327px;">Semrock Inc.</td>
			<td style="width:360px;">TBP01-561/14</td>
			<td>Center wavelength range (501.5-561 nm), Bandwidth (Minimum 14 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.83)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Fluorescence Filter Cube Dichroic Beamsplitter</td>
			<td style="width:327px;">Semrock Inc.</td>
			<td style="width:360px;">FF495-Di03</td>
			<td>Separates excitation and emission light at 495 nm (&#62;98% reflection between 350-488 nm, &#62;93% transmission between 502-950 nm), Filter effective index (1.78)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Fluorescence Filter Cube Longpass Filter</td>
			<td style="width:327px;">Semrock Inc.</td>
			<td style="width:360px;">FF01 496/LP-25</td>
			<td>Allows passage of light longer than 496 nm ( &#62;93% average transmission between 503.2-1100 nm), Refractive index (1.86)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">GCaMP Probe</td>
			<td style="width:327px;">Addgene</td>
			<td style="width:360px;">G-CaMP3; Plasmid #22692</td>
			<td>A single-wavelength GCaMP2-based genetically encoded calcium indicator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Integrating Sphere</td>
			<td style="width:327px;">Ocean Optics</td>
			<td style="width:360px;">FOIS-1</td>
			<td>Used for accurate measurement of wide-angle illumination</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Inverted Fluorescence Microscope</td>
			<td style="width:327px;">Nikon Instruments</td>
			<td style="width:360px;">TE2000</td>
			<td>Inverted microscopes allow direct excitation of sample without the need to penetrate layers of media and/or tissue.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Mitotracker Green FM</td>
			<td style="width:327px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:360px;">M7514</td>
			<td>Labels mitochondria</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">NIST-Traceable Calibration Lamp</td>
			<td style="width:327px;">Ocean Optics</td>
			<td style="width:360px;">LS-1-CAL-INT</td>
			<td>A lamp with a known spectrum for use as a standard</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">NIST-Traceable Fluorescein</td>
			<td style="width:327px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:360px;">F36915</td>
			<td>For verifying appropriate spectral response of the system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">NucBlue</td>
			<td style="width:327px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:360px;">R37605</td>
			<td>Labels cell nuclei</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Objective (10X)</td>
			<td style="width:327px;">Nikon Instruments</td>
			<td style="width:360px;">Plan Apo &#955; 10X/0.45 &#8734;/0.17 MRD00105</td>
			<td>Useful for large fields of view</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Objective (20X)</td>
			<td style="width:327px;">Nikon Instruments</td>
			<td style="width:360px;">Plan Apo &#955; 20X/0.75 &#8734;/0.17 MRD00205</td>
			<td>Most often used for tissue samples</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Objective (60X)</td>
			<td style="width:327px;">Nikon Instruments</td>
			<td>Plan Apo VC 60X/1.2 WI &#8734;/0.15-0.18 WD 0.27</td>
			<td>Most often used for cell samples</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">sCMOS Camera</td>
			<td style="width:327px;">Photometrics</td>
			<td style="width:360px;">Prime 95B (Rev A8-062802018)</td>
			<td>For acquiring high-sensitivity digital images</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Spectrometer</td>
			<td style="width:327px;">Ocean Optics</td>
			<td style="width:360px;">QE65000</td>
			<td>Used to measure spectral output of excitation-scanning spectral system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Tunable Filter Changer</td>
			<td style="width:327px;">Sutter Instrument</td>
			<td style="width:360px;">Lambda VF-5</td>
			<td>Motorized unit for automated excitation filter tuning/switching</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Xenon Arc Lamp</td>
			<td style="width:327px;">Sunoptic Technologies</td>
			<td style="width:360px;">Titan 300HP Lightsource</td>
			<td>Light source with relatively uniform spectral output</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

excitation-scanning hyperspectral imaging microscopy to efficiently discriminate fluorescence signals

几种技术依靠荧光信号的检测来识别或研究现象或阐明功能。在高光谱成像出现之前，这些荧光信号的分离被证明是很繁琐的，在高光谱成像中，荧光源可以彼此分离，也可以与背景信号和自荧光分离（只要了解它们的光谱签名）。然而，传统的发射扫描高光谱成像由于对激发光和发射光进行必要的滤波，其采集时间慢，信噪比低。此前已经表明，激发扫描高光谱成像减少了必要的采集时间，同时提高了采集数据的信号噪声比。该协议使用市售设备，描述了如何组装、校准和使用激发扫描高光谱成像显微镜系统，以分离单个样品中多个荧光源的信号。虽然该技术非常适用于细胞和组织的微小成像，但该技术对于利用荧光的任何类型的实验也很有用，在荧光中，激发波长可能发生变化，包括但不限于：化学成像、环境应用、眼部护理、食品科学、法医学、医学和矿物学。

该协议的几个重要步骤是必要的，以确保收集数据是准确和没有成像和光谱伪影。跳过这些步骤可能会导致数据看起来重要，但无法用任何其他光谱成像系统进行验证或复制，从而有效地否定了使用这些数据得出的任何结论。这些重要步骤中最主要的是适当的光谱输出校正（第 3 节）。校正系数补偿可调谐激发系统光谱输出中的波长相关变化。这是通过缩放具有高功率激?...

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Excitation-Scanning Hyperspectral Imaging Microscopy to Efficiently Discriminate Fluorescence Signals

激发-扫描高光谱成像显微镜，以有效区分荧光信号

光谱成像已成为在单个样品中识别和分离多个荧光信号的可靠解决方案，并可轻松区分感兴趣的信号和背景或自荧光。激励扫描高光谱成像通过减少必要的图像采集时间，同时提高信噪比，改进了该技术。

Several techniques rely on detection of fluorescence signals to identify or study phenomena or to elucidate functions. Separation of these fluorescence ...

该协议非常重要，因为它描述了一种可用于在单个样本中分离多个荧光信号的方法。与传统方法相比，激励扫描可以提高实验速度，提高数据的灵敏度。通过使用不同的照明源，如超级连续激光器，该方法可适用于旋转盘或激光扫描共匀显微镜系统。在执行激发扫描、光谱成像显微镜时，必须检查每个荧光标签的激发峰值是否发生在不同的波长上。首先，设置一个倒置荧光显微镜和相机，如文本协议中所述。然后在舞台上加载样品。从微管理器主窗口的下拉菜单中，选择 475 纳米进行初始样品查看。然后双击曝光旁边的框，输入 100 以将曝光时间设置为 100 毫秒。最后，单击"实时"以查看示例。现在点击自动。自动强度查看范围按钮，可将最小值和最大值引入有意义的可视范围。接下来，使用显微镜的对焦旋钮对样品进行聚焦。一旦对焦，调整样本的位置，使其边缘位于视场的中心。然后微调焦点。当图像中的边缘特征看起来锐利时，示例处于焦点。现在，打开多维采集工具。在菜单中，单击加载按钮并选择包含适当波长范围的预设设置以进行光谱采集。确认采集设置后，移动到样本的空白区域，然后单击"获取"以收集包含背景和杂色的光谱图像堆栈，以用于以后的减法。然后，在样本上移动以查找最亮的区域。样品可能具有更强烈的荧光远离样品的边缘。找到最亮区域后，请进行单个图像堆栈。将采集的图像加载到图像 J 中，并使用图像 J 的测量功能确认没有波长包含过度曝光的像素。如果由于曝光过度而需要缩短曝光时间，则还应用新的曝光时间重新使用背景图像。如果发现任何图像包含摄像机的向上检测极限，请调整光谱扫描的曝光时间，以确保整个光谱范围内的最大信号不超过摄像机的动态范围。现在确定适当的曝光时间后，将未标记的样品放置到舞台上。从未标记的样本获取光谱图像数据，以确定是否有任何潜在的自动荧光。然后，在舞台上放置一个单标记的样本。从每个单标记样本获取光谱图像数据，用作光谱控件以构建光谱库。使用相同的波长范围曝光时间和摄像机设置对每个控制样本执行扫描。接下来，在显微镜上放置一张包含实验样品的幻灯片。选择具有适当标记的单元格的视场，并使用确定的采集设置从样本获取光谱图像数据。通过从样本图像中减去背景光谱并乘以校正系数来校正图像，将图像校正到平面光谱响应。在这里，MATLAB 脚本用于快速处理图像。接下来，生成光谱库。为了获得最佳效果，通过确定哪个波长波段具有最强值并将每个波长波段的测量值除以该最大值，使每个端子段与最大强度的波长带规范化。然后将光谱数据另存为 dat 文件。完成后，取消混合光谱图像数据。取消混合步骤将生成每个荧光标签的丰度图像，其中丰度是图像中来自预期标签的相对荧光信号量。接下来，打开每个未混合的图像以直观地检查纯组件的分布。将错误图像的大小与未混合图像的大小进行比较。如果误差图像的幅度与未混合丰度图像相似，则频谱图像数据中的信号可能无法准确计算。最后，通过将错误图像与未混合图像进行比较，检查是否有未识别的残差结构。如果执行正确，光谱解混过程允许将光谱图像堆栈分离到每个荧光标签中各自的贡献中。在这里，一个未混合的光谱图像集与个别图像突出显示气道平滑肌肉细胞自荧光，GCaMP探头和线粒体标签。与细胞的核区和近核区有关的误差很高，表明光谱库中的光谱未很好地解释这些区域的测量光谱。从同样自发光的标记细胞中收集的纯光谱可能会污染纯成分的光谱轮廓。在这里，我们可以看到与受自荧光污染的纯光谱的解混与缩放减法后校正的纯光谱的区别。在成像敏感样本时，适当的数据采集至关重要，因为它们可能只能存活一次成像会话，而与可能重新成像的背景和控制不同。确保尽可能预先确定正确的硬件和采集设置。作为下一步，使用该系统采集的延时数据创建的视频可用于跟踪一段时间内隐蔽位置的荧光源，例如第二信使信号定位。使用强大的光源时小心，以避免眼睛暴露。此外，在处理生物标签时，请务必佩戴适当的手套。

Research

JoVE Journal

Engineering

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