Name: excitation-scanning hyperspectral imaging microscopy to efficiently discriminate fluorescence signals
Uploaded: 2019-08-22T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Excitation-Scanning Hyperspectral Imaging Microscopy to Efficiently Discriminate Fluorescence Signals at JoVE.com

De auteurs willen steun van NSF 1725937, NIH P01HL066299, NIH R01HL058506, NIH S10OD020149, NIH UL1 TR001417, NIH R01HL137030, AHA 18PRE34060163 en het Abraham Mitchell Cancer Research Fund erkennen.

1. apparaat instellen
<ol><li>Lichtbron: Selecteer een breedbandspectrale lichtbron met hoog uitgangsvermogen en hoge collimator (een 300 W XE Arc lamp werd gebruikt voor deze studies).</li>
	<li>Sluiter (optioneel): Voeg een sluiter toe aan het optische pad om photobleaching voor timelapse-beeldvorming te verminderen.</li>
	<li>Afstembare filtersysteem: Neem een mechanische tuning-assemblage en dun-film instelbare filter (TFTF) ingesteld om het gewenste golflengte instelbare excitatie bereik (bijv. 360-485 nm) mogelij...

Het optimale gebruik van een excitatie-Scanning hyperspectrale Imaging set-up begint met de bouw van het lichtpad. Met name de keuze van de lichtbron, filters (instelbaar en dichroïde), filter schakelmethode en camera bepalen het beschikbare spectrum bereik, mogelijke scansnelheid, detector gevoeligheid en ruimtelijke sampling. Mercury Arc-lampen bieden vele pieken van de excitatie golflengte, maar bieden geen platte spectrale uitgang en vereisen een aanzienlijke signaal reductie bij de uitgangen om de spectrale beeldge...

Spectrale beeldvorming kan op verschillende manieren worden uitgevoerd en wordt aangeduid met verschillende termen1,2,3,4. In het algemeen verwijst spectrale imaging naar gegevens die zijn verkregen in ten minste twee ruimtelijke dimensies en één spectrale dimensie. Multispectrale en Hyperspectrale beeldvorming worden meestal gekenmerkt door het aantal golflengte banden of de spectrumbanden aaneengesloten1. Voor deze toepassing worden hyperspectrale gegevens gedefinieerd als spectrale gegevens die zijn verkregen met aaneengesloten golflengte banden bereikt door afstand van de middelste golflengten, niet minder dan de helft van de volledige breedte bij halve maximum (FWHM) van elk band pass filter dat wordt gebruikt voor excitatie (d.w.z. 5 nm Midden golflengte afstand voor band pass filters met 14-20 nm bandbreedtes). De aaneengesloten aard van de gegevens banden maakt een oversampling van de gegevensset mogelijk, zodat Nyquist-criteria worden nageleefd bij het samplen van het spectrale domein.
Hyperspectrale beeldvorming werd ontwikkeld door NASA in de jaren zeventig en tachtig in combinatie met de eerste Landsat satelliet5,6. Het verzamelen van gegevens uit verschillende aaneengesloten spectrale banden zorgde voor het opwekken van een stralend spectrum van elke pixel. Het identificeren en definiëren van het stralings spectrum van afzonderlijke componenten maakte het mogelijk om niet alleen oppervlakte materialen te detecteren door hun karakteristieke spectra, maar het ook toegestaan om tussenliggende signalen te verwijderen, zoals variaties in het signaal als gevolg van atmosferische omstandigheden. Het concept van het opsporen van materialen met behulp van hun karakteristieke Spectra werd toegepast op biologische systemen in 1996 toen Schröck et al. gebruikte combinaties van vijf verschillende fluor Foren en hun bekende Spectra om gelabelde chromosomen te onderscheiden in een proces dat spectrale karyotypering7. Deze techniek werd uitgewerkt in 2000 door Tsurui et al. voor fluorescentie beeldvorming van weefselmonsters, met behulp van zeven fluorescerende kleurstoffen en enkelvoudige waarde ontleding om de spectrale separatie van elke pixel te bereiken in lineaire combinaties van spectra in de referentie bibliotheek8. Vergelijkbaar met hun externe sensing tegenhangers, kan de bijdrage van elke bekende de worden berekend uit het hyperspectrale beeld, gegeven a priori informatie over het spectrum van elke de.
Hyperspectrale beeldvorming is ook gebruikt op het gebied van landbouw9, astronomie10, biogeneeskunde11, chemische beeldvorming12, milieu-toepassingen13, Eye Care14, Food Science15, Forensische Wetenschappen16,17, medische wetenschap18, mineralogie19, en surveillance20. Een belangrijke beperking van de huidige fluorescentiemicroscoop hyperspectrale beeldvormingssystemen is dat de standaard hyperspectrale beeldvormingstechnologie fluorescentie signalen in smalle banden isoleert met 1) en eerst het excitatie lampje filtert om de monster excitatie te regelen, 2) verdere filtering uitgezonden licht om de fluorescentie-emissie te scheiden in smalle banden die later wiskundig gescheiden kunnen worden21. Het filteren van zowel de excitatie verlichting als de uitgezonden fluorescentie vermindert de hoeveelheid beschikbaar signaal, die de signaal-ruis verhouding verlaagt en lange aanschaf tijden vereist. Het lage signaal en de lange acquisitie tijden beperken de toepasbaarheid van Hyperspectrale beeldvorming als diagnostisch hulpmiddel.
Er is een beeldvormings modaliteit ontwikkeld die gebruik maakt van Hyperspectrale beeldvorming, maar het beschikbare signaal verhoogt, waardoor de benodigde acquisitie tijd21,22wordt verminderd. Deze nieuwe modaliteit, genaamd excitatie-Scanning Hyperspectrale beeldvorming, verwerft spectrale beeldgegevens door de excitatie golflengte te variëren en een breed scala aan uitgezonden licht te verzamelen. Er is al eerder aangetoond dat deze techniek leidt tot een verhoging van de signaal-ruis verhouding in vergelijking met de technieken voor emissie Scanning21,22. De toename van de signaal-ruis verhouding is grotendeels te wijten aan de brede band pass (~ 600 nm) van het geconstateerde emissie licht, terwijl specificiteit wordt geboden door alleen het excitatie lampje te filteren in plaats van de fluorescentie-emissie. Dit maakt het mogelijk alle uitgezonden licht (voor elke excitatie golflengte) om de detector te bereiken21. Bovendien kan deze techniek worden gebruikt om autofluorescentie van exogene etiketten te discrimineren. Bovendien vermindert de mogelijkheid om de acquisitie tijd te verkorten door een verhoogd detecteerbaar signaal het gevaar van fotobleaching en maakt het mogelijk spectrale scans tegen een acquisitie ratio die acceptabel is voor spectrale videobeelden.
Het doel van dit protocol is om te dienen als een gids voor het verzamelen van gegevens voor excitatie-Scanning hyperspectrale beeldvormings microscopie. Bovendien zijn beschrijvingen opgenomen die helpen om het lichtpad en de hardware te begrijpen. Ook beschreven is de implementatie van open-source software voor een excitatie-Scanning hyperspectrale beeld Microscoop. Ten slotte worden beschrijvingen gegeven voor het kalibreren van het systeem naar een NIST-traceerbare standaard, het aanpassen van software-en hardware-instellingen voor nauwkeurige resultaten en het opheffen van het gedetecteerde signaal in bijdragen van afzonderlijke componenten.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:2119px;" width="2120">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Airway Smooth Muscle Cells</td>
			<td style="width:327px;">National Disease Research Interchange (NDRI)</td>
			<td style="width:360px;">Isolated from human lung tissues obtained from NDRI</td>
			<td style="width:1105px;">Highly autofluorescent, calcium sensitive cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Automated Shutter</td>
			<td style="width:327px;">Thorlabs Inc.</td>
			<td style="width:360px;">SHB1</td>
			<td>Remote-controllable shutter to minimize photobleaching</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Automated Stage</td>
			<td style="width:327px;">Prior Scientific</td>
			<td style="width:360px;">H177P1T4</td>
			<td>Remote-controllable stage for automated multiple field of view or stitched image collection.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Automated Stage Controller (XY)</td>
			<td style="width:327px;">Prior Scientific</td>
			<td style="width:360px;">Proscan III (H31XYZE-US)</td>
			<td>For interfacing automated stage with computer and joystick</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Buffer</td>
			<td style="width:327px;">Made in-house</td>
			<td style="width:360px;">Made in-house</td>
			<td>145 mM NaCl, 4 mM KCl, 20 mM HEPES, 10 mM D-glucose, 1 mM MgCl2, and 1mM CaCl2, at pH 7.3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Cell Chamber</td>
			<td style="width:327px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:360px;">Attofluor Cell Chamber, A7816</td>
			<td>Coverslip holder composed of surgical stainless steel and a rubber O-ring to seal in media and prevent sample and/or objective contamination</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Excitation Filters</td>
			<td style="width:327px;">Semrock Inc.</td>
			<td style="width:360px;">TBP01-378/16</td>
			<td>Center wavelength range (340-378 nm), Bandwidth (Minimum 16 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.88)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;"></td>
			<td style="width:327px;">Semrock Inc.</td>
			<td style="width:360px;">TBP01-402/16</td>
			<td>Center wavelength range (360-400 nm), Bandwidth (Minimum 16 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.8)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;"></td>
			<td style="width:327px;">Semrock Inc.</td>
			<td style="width:360px;">TBP01-449/15</td>
			<td>Center wavelength range (400-448.8 nm), Bandwidth (Minimum 15 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.8)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;"></td>
			<td style="width:327px;">Semrock Inc.</td>
			<td style="width:360px;">TBP01-501/15</td>
			<td>Center wavelength range (448.8-501.5 nm), Bandwidth (Minimum 15 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.84)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;"></td>
			<td style="width:327px;">Semrock Inc.</td>
			<td style="width:360px;">TBP01-561/14</td>
			<td>Center wavelength range (501.5-561 nm), Bandwidth (Minimum 14 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.83)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Fluorescence Filter Cube Dichroic Beamsplitter</td>
			<td style="width:327px;">Semrock Inc.</td>
			<td style="width:360px;">FF495-Di03</td>
			<td>Separates excitation and emission light at 495 nm (&#62;98% reflection between 350-488 nm, &#62;93% transmission between 502-950 nm), Filter effective index (1.78)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Fluorescence Filter Cube Longpass Filter</td>
			<td style="width:327px;">Semrock Inc.</td>
			<td style="width:360px;">FF01 496/LP-25</td>
			<td>Allows passage of light longer than 496 nm ( &#62;93% average transmission between 503.2-1100 nm), Refractive index (1.86)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">GCaMP Probe</td>
			<td style="width:327px;">Addgene</td>
			<td style="width:360px;">G-CaMP3; Plasmid #22692</td>
			<td>A single-wavelength GCaMP2-based genetically encoded calcium indicator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Integrating Sphere</td>
			<td style="width:327px;">Ocean Optics</td>
			<td style="width:360px;">FOIS-1</td>
			<td>Used for accurate measurement of wide-angle illumination</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Inverted Fluorescence Microscope</td>
			<td style="width:327px;">Nikon Instruments</td>
			<td style="width:360px;">TE2000</td>
			<td>Inverted microscopes allow direct excitation of sample without the need to penetrate layers of media and/or tissue.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Mitotracker Green FM</td>
			<td style="width:327px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:360px;">M7514</td>
			<td>Labels mitochondria</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">NIST-Traceable Calibration Lamp</td>
			<td style="width:327px;">Ocean Optics</td>
			<td style="width:360px;">LS-1-CAL-INT</td>
			<td>A lamp with a known spectrum for use as a standard</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">NIST-Traceable Fluorescein</td>
			<td style="width:327px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:360px;">F36915</td>
			<td>For verifying appropriate spectral response of the system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">NucBlue</td>
			<td style="width:327px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:360px;">R37605</td>
			<td>Labels cell nuclei</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Objective (10X)</td>
			<td style="width:327px;">Nikon Instruments</td>
			<td style="width:360px;">Plan Apo &#955; 10X/0.45 &#8734;/0.17 MRD00105</td>
			<td>Useful for large fields of view</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Objective (20X)</td>
			<td style="width:327px;">Nikon Instruments</td>
			<td style="width:360px;">Plan Apo &#955; 20X/0.75 &#8734;/0.17 MRD00205</td>
			<td>Most often used for tissue samples</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Objective (60X)</td>
			<td style="width:327px;">Nikon Instruments</td>
			<td>Plan Apo VC 60X/1.2 WI &#8734;/0.15-0.18 WD 0.27</td>
			<td>Most often used for cell samples</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">sCMOS Camera</td>
			<td style="width:327px;">Photometrics</td>
			<td style="width:360px;">Prime 95B (Rev A8-062802018)</td>
			<td>For acquiring high-sensitivity digital images</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Spectrometer</td>
			<td style="width:327px;">Ocean Optics</td>
			<td style="width:360px;">QE65000</td>
			<td>Used to measure spectral output of excitation-scanning spectral system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Tunable Filter Changer</td>
			<td style="width:327px;">Sutter Instrument</td>
			<td style="width:360px;">Lambda VF-5</td>
			<td>Motorized unit for automated excitation filter tuning/switching</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Xenon Arc Lamp</td>
			<td style="width:327px;">Sunoptic Technologies</td>
			<td style="width:360px;">Titan 300HP Lightsource</td>
			<td>Light source with relatively uniform spectral output</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

excitation-scanning hyperspectral imaging microscopy to efficiently discriminate fluorescence signals

Verschillende technieken zijn gebaseerd op de detectie van fluorescentie signalen om verschijnselen te identificeren of te bestuderen of om functies te verheldoen. De scheiding van deze fluorescentie signalen bleek omslachtig te zijn tot de opkomst van Hyperspectrale beeldvorming, waarbij fluorescentie bronnen van elkaar kunnen worden gescheiden, evenals van achtergrond signalen en auto fluorescentie (gezien de kennis van hun spectrale handtekeningen). Traditionele Hyperspectrale beeldvorming met emissie Scanning lijdt echter aan trage acquisitie tijden en lage signaal-ruis verhoudingen vanwege de noodzakelijke filtering van zowel excitatie-als emissie licht. Eerder is aangetoond dat excitatie-Scanning Hyperspectrale beeldvorming de benodigde acquisitie tijd vermindert en tegelijkertijd de signaal-ruis verhouding van de verkregen gegevens verhoogt. Met behulp van commercieel verkrijgbare apparatuur, dit protocol beschrijft hoe te monteren, kalibreren, en het gebruik van een excitatie-Scanning hyperspectrale Imaging microscopie systeem voor scheiding van signalen van verschillende fluorescentie bronnen in een enkel monster. Hoewel deze techniek zeer toepasselijk is voor microscopische beeldvorming van cellen en weefsels, kan deze methode ook nuttig zijn voor elk type experiment waarbij fluorescentie wordt toegepast waarbij het mogelijk is om golflengten van excitatie te variëren, inclusief maar niet beperkt tot: chemische beeldvorming, milieutoepassingen, oogzorg, voedsel wetenschap, forensische wetenschappen, medische wetenschap en mineralogie.

Een aantal belangrijke stappen van dit protocol zijn nodig om te zorgen voor het verzamelen van gegevens die zowel nauwkeurig en verstoken van Imaging en spectrale artefacten. Het overslaan van deze stappen kan resulteren in gegevens die significant lijken, maar niet kunnen worden geverifieerd of gereproduceerd met een ander spectrale beeldvormings systeem, waardoor eventuele conclusies met deze gegevens effectief worden tenietgedaan. Chief onder deze belangrijke stappen is de juiste spec...

Watch this Scientific Journal Video about Excitation-Scanning Hyperspectral Imaging Microscopy to Efficiently Discriminate Fluorescence Signals at JoVE.com

Excitation-Scanning Hyperspectral Imaging Microscopy to Efficiently Discriminate Fluorescence Signals

Excitatie-Scanning hyperspectrale beeld microscopie om fluorescentie signalen efficiënt te discrimineren

Spectrale beeldvorming is uitgegroeid tot een betrouwbare oplossing voor de identificatie en scheiding van meerdere fluorescentie signalen in een enkel monster en kan gemakkelijk signalen van belang onderscheiden van achtergrond of auto fluorescentie. Excitatie-Scanning Hyperspectrale beeldvorming verbetert deze techniek door de benodigde beeldverzamelings tijd te verlagen en tegelijkertijd de signaal-ruis verhouding te verhogen.

Several techniques rely on detection of fluorescence signals to identify or study phenomena or to elucidate functions. Separation of these fluorescence ...

Dit protocol is belangrijk omdat het een methode beschrijft die kan worden gebruikt om verschillende fluorescerende signalen in één monster te scheiden. In vergelijking met traditionele methoden kan excitatiescannen de snelheid van het experiment verhogen en de gevoeligheid van de gegevens verbeteren. Door het gebruik van verschillende verlichtingsbronnen, zoals een supercontinuumlaser, kan deze methode van toepassing zijn op draaiende schijf- of laserscannende confocale microscoopsystemen.Bij het uitvoeren van excitatie-scannings, spectrale imaging microscopie, is het belangrijk om te controleren of de excitatiepiek van elk fluorescerend label optreedt op een andere golflengte. Om te beginnen, het opzetten van een omgekeerde fluorescentie microscoop en camera zoals beschreven in het tekstprotocol. Laad vervolgens het monster op het podium.Selecteer in het vervolgkeuzemenu van het hoofdvenster van micromanager 475 nanometer voor de eerste steekproefweergave. Dubbelklik vervolgens op het vak naast de belichting en voer 100 in om de belichtingstijd in te stellen op 100 milliseconden. Klik tot slot op live om het voorbeeld te bekijken.Klik nu op Auto. De knop automatisch intensiteitsweergavebereik om de minimale en maximale waarden in zinvolle, visuele bereiken te brengen. Gebruik vervolgens de focusknoppen van de microscoop om het monster scherp te stellen.Eenmaal scherp, pas de positie van het monster aan, zodat de rand zich in het midden van het gezichtsveld bevindt. Stem dan de focus af. Het voorbeeld is scherp wanneer de randfuncties in de afbeelding scherp lijken.Open nu de multidimensionale acquisitietool. Klik in het menu op de laadknop en kies een vooraf ingestelde instelling met een geschikt golflengtebereik voor spectrale acquisitie. Zodra de acquisitie-instellingen zijn bevestigd, gaat u naar een leeg gebied van het voorbeeld en klikt u op acquire om een spectrale afbeeldingsstapel te verzamelen die achtergrond en ruis bevat die later voor aftrekking kunnen worden gebruikt.Ga vervolgens over het voorbeeld om de helderste gebieden te vinden. Monsters zijn waarschijnlijk meer intense fluorescentie uit de buurt van de rand van het monster. Zodra de helderste regio zich bevindt, neemt u één afbeeldingsstapel.Laad de overgenomen afbeelding in Image J en gebruik de meetfunctie van Image J om te bevestigen dat er geen golflengten overbelichte pixels bevatten. Als een verminderde belichtingstijd nodig is als gevolg van overbelichting, moet het achtergrondbeeld ook worden heroverd met een nieuwe belichtingstijd. Als een van de beelden de opwaartse detectielimiet van de camera bevat, past u de belichtingstijd van de spectrale scan aan om ervoor te zorgen dat het maximale signaal in het gehele spectrale bereik het dynamische bereik van de camera niet overschrijdt.Met een geschikte belichtingstijd die nu wordt bepaald, plaatst u een niet-gelabeld monster op het podium. Verwerf spectrale afbeeldingsgegevens uit het niet-gelabelde voorbeeld om te bepalen of er onderliggende autofluoresence is. Plaats vervolgens een enkelgelabeld monster op het podium.Verwerf spectrale afbeeldingsgegevens van elk van de voorbeelden met één label om te gebruiken als spectrale besturingselementen om een spectrale bibliotheek te bouwen. Voer de scan uit voor elk besturingselementmonster met behulp van een identieke belichtingstijd van het golflengtebereik en camera-instellingen. Plaats vervolgens een dia met het experimentele monster op de microscoop.Selecteer een gezichtsveld dat cellen op de juiste manier heeft gelabeld en verwerf de spectrale afbeeldingsgegevens uit het voorbeeld met behulp van de bepaalde acquisitie-instellingen. Corrigeer afbeeldingen tot een vlakke spectrale respons door het achtergrondspectrum van de voorbeeldafbeelding af te trekken en de afbeelding te vermenigvuldigen met de correctiecoëfficiënt. Hier wordt een MATLAB script gebruikt om de beelden snel te verwerken.Vervolgens genereert u de spectrale bibliotheek. Voor de beste resultaten normaliseert u elk eindlid tot de golflengteband van de grootste intensiteit door te bepalen welke golflengteband de meest intense waarde heeft en de meting bij elke golflengteband te delen door die maximale waarde. Sla vervolgens de spectrale gegevens op als een datbestand.Wanneer voltooid, ontmengen de spectrale afbeeldingsgegevens. De unmixing stap zal genereren een overvloed beeld voor elk fluorescerend label, waar overvloed is de hoeveelheid relatieve fluorescerend signaal in het beeld van de prospectieve label. Open vervolgens elk ongemengd beeld om de verdeling van zuivere componenten visueel te inspecteren.Vergelijk de omvang van het foutbeeld met die van de niet-gemengde afbeeldingen. Als de omvang van het foutbeeld vergelijkbaar is met de niet-gemengde overvloedafbeeldingen, kunnen signalen in de spectrale beeldgegevens niet nauwkeurig worden verantwoord. Controleer ten slotte of er geen niet-geïdentificeerde reststructuren zijn door het foutbeeld te vergelijken met de ongemengde afbeeldingen.Wanneer correct uitgevoerd, maakt het spectrale niet-mengende proces scheiding van een spectrale beeldstapel in respectieve bijdragen van elk fluorescentieetiket mogelijk. Hier, een ongemengde spectrale beeld set met individuele beelden markeren luchtwegen gladde spiercel autofluorescentie, een GCaMP sonde en een mitochondriaal label. Er is een grote fout in verband met de nucleaire en perinucleaire gebieden van de cellen waaruit blijkt dat de gemeten spectra van deze regio's niet goed worden verantwoord door de spectra in de spectra bibliotheek.Pure spectra verzameld uit gelabelde cellen die ook autofluorescenten zal waarschijnlijk vervuilen het spectrale profiel voor de zuivere component. Hier kan men het verschil zien van het onvermengen met pure spectra besmet met autofluorescentie, versus de gecorrigeerde zuivere spectra na geschaalde aftrekking. Een goede gegevensverwerving is essentieel bij het beeldvorming van gevoelige monsters, omdat ze slechts één beeldvormingssessie kunnen overleven in tegenstelling tot de achtergrond en besturingselementen die opnieuw kunnen worden uitgebeeld.Zorg ervoor dat de juiste hardware- en acquisitie-instellingen zoveel mogelijk vooraf worden bepaald. Als volgende stap kunnen video's die zijn gemaakt van time-lapse-gegevens die met dit systeem zijn verkregen, worden gebruikt om fluorescerende bronnen in de loop van de tijd op discrete locaties bij te houden, zoals tweede messenger-signaallokalisatie. Let op bij het gebruik van krachtige lichtbronnen om blootstelling aan de ogen te voorkomen.Zorg er ook voor dat u de juiste handschoenen draagt bij het hanteren van biologische etiketten.

Research

JoVE Journal

Engineering

Use of a Multi-compartment Dynamic Single Enzyme Phantom for Studies of Hyperpolarized Magnetic Resonance Agents

Gebruik van een Multi-compartiment Dynamic enkel enzym Phantom voor Studies van gehyperpolariseerd Magnetic Resonance Agents

Imaging of hyperpolarized substrates by magnetic resonance shows great clinical promise for assessment of critical biochemical processes in real time. Due ...

Dynamic Pore-scale Reservoir-condition Imaging of Reaction in Carbonates Using Synchrotron Fast Tomography

Dynamische Pore schaal Reservoir voorwaarde beeldvorming van Reaction in carbonaten met synchrotron Fast Tomography

Underground storage permanence is a major concern for carbon capture and storage. Pumping CO2 into carbonate reservoirs has the potential to dissolve ...

Advanced Compositional Analysis of Nanoparticle-polymer Composites Using Direct Fluorescence Imaging

Uitgebreide analyse van de samenstelling van nanodeeltjes-polymeer Composites Met behulp van Direct Fluorescence Imaging

The fabrication of polymer-nanoparticle composites is extremely important in the development of many functional materials. Identifying the precise ...

Sub-nanometer Resolution Imaging with Amplitude-modulation Atomic Force Microscopy in Liquid

Sub-nanometer Resolution Imaging met amplitude-modulatie Atomic Force Microscopy in Liquid

Atomic force microscopy (AFM) has become a well-established technique for nanoscale imaging of samples in air and in liquid. Recent studies have shown ...

Microfluidic Imaging Flow Cytometry by Asymmetric-detection Time-stretch Optical Microscopy (ATOM)

Microfluidic Imaging Flow Cytometry by Asymmetric-detection Time-stretch Optical Microscopy ATOM

Microfluïdische Imaging Flow Cytometry door Asymmetrische Deteksie Time-stretch Optische Microscopie (ATOM)

Scaling the number of measurable parameters, which allows for multidimensional data analysis and thus higher-confidence statistical results, has been the ...

Novel Photoacoustic Microscopy and Optical Coherence Tomography Dual-modality Chorioretinal Imaging in Living Rabbit Eyes

Roman Photoacoustic microscopie en optische coherentie tomografie Dual-modaliteit Chorioretinal Imaging in levende konijn ogen

Photoacoustic ocular imaging is an emerging ophthalmic imaging technology that can noninvasively visualize ocular tissue by converting light energy into ...

Synchrotron X-ray Microdiffraction and Fluorescence Imaging of Mineral and Rock Samples

Synchrotron X-ray Microdiffraction en fluorescentie beeldvorming van minerale en Rock monsters

In this report, we describe a detailed procedure for acquiring and processing&#160;x-ray microfluorescence (&#956;XRF), and Laue and powder ...

Label-Free Imaging of Single Proteins Secreted from Living Cells via iSCAT Microscopy

Label-Free Imaging van één eiwitten uitgescheiden door levende cellen via iSCAT microscopie

We demonstrate interferometric scattering (iSCAT) microscopy, a method capable of detecting single unlabeled proteins secreted from individual living ...

Multiplexing Focused Ultrasound Stimulation with Fluorescence Microscopy

Multiplexing gericht echografie stimulatie met fluorescentie microscopie

By focusing low-intensity ultrasound pulses that penetrate soft tissues, LIPUS represents a promising biomedical technology to remotely and safely ...

In Situ Transmission Electron Microscopy with Biasing and Fabrication of Asymmetric Crossbars Based on Mixed-Phased a-VOx

In Situ Transmission Electron Microscopy with Biasing and Fabrication of Asymmetric Crossbars Based on Mixed-Phased a-VOx

In Situ Transmission Electron Microscopy met biasing en fabricage van asymmetrische dwarsbalken op basis van gemixte a-VOx