Name: excitation-scanning hyperspectral imaging microscopy to efficiently discriminate fluorescence signals
Uploaded: 2019-08-22T12:30:00
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Die Autoren möchten die Unterstützung von NSF 1725937, NIH P01HL066299, NIH R01HL058506, NIH S10OD020149, NIH UL1 TR001417, NIH R01HL137030, AHA 18PRE34060163 und dem Abraham Mitchell Cancer Research Fund würdigen.

1. Geräteeinrichtung
<ol><li>Lichtquelle: Wählen Sie eine Breitband-Spektrallichtquelle mit hoher Leistung und hoher Kollimation (für diese Studien wurde eine 300 W Xe Lichtbogenlampe verwendet).</li>
	<li>Shutter (optional): Fügen Sie einen Verschluss zum optischen Pfad hinzu, um die Photobleichung für die Zeitraffer-Bildgebung zu reduzieren.</li>
	<li>Tunable Filtersystem: verfügen über eine mechanische Tuning-Baugruppe und einen Dünnschicht-Tunable-Filter (TFTF), um den gewünschten wellenlängenverstellbare...

Die optimale Nutzung einer hyperspektralen Bildgebung scannt mit der Konstruktion des Lichtweges. Insbesondere die Wahl der Lichtquelle, Filter (tunable und dichroic), Filter-Switching-Methode und Kamera bestimmen den verfügbaren Spektralbereich, mögliche Scangeschwindigkeit, Detektorempfindlichkeit und räumliche Probenahme. Quecksilberlichtbogenlampen bieten viele Anregungswellenlängenspitzen, bieten jedoch keinen flachen Spektralausgang und erfordern eine signifikante Signalreduktion an den Ausgangsspitzen, um die ...

Spektrale Bildgebung kann auf verschiedene Weise durchgeführt werden und wird durch mehrere Begriffe1,2,3,4bezeichnet. Im Allgemeinen bezieht sich die Spektralbildgebung auf Daten, die in mindestens zwei räumlichen Dimensionen und einer Spektraldimension erfasst wurden. Multispektrale und hyperspektrale Bildgebung unterscheiden sich am häufigsten durch die Anzahl der Wellenlängenbänder oder ob die Spektralbänder zusammenhängend sind1. Für diese Anwendung werden hyperspektrale Daten definiert als Spektraldaten, die mit zusammenhängenden Wellenlängenbändern erfasst werden, die durch den Abstand der mittleren Wellenlängen erreicht werden, nicht weniger als die Hälfte der vollen Breite bei halbmaximaler Breite (FWHM) jedes Bandpassfilters, der für die Anregung verwendet wird (d. h. 5 nm Wellenlängenabstand für Bandpassfilter mit 14-20 nm Bandbreiten). Die Kontinuität der Datenbänder ermöglicht ein Oversampling des Datensatzes, wodurch sichergestellt wird, dass die Nyquist-Kriterien beim Sampling der Spektraldomäne erfüllt sind.
Hyperspektrale Bildgebung wurde von der NASA in den 1970er und 1980er Jahren in Verbindung mit dem ersten Landsat-Satelliten5,6entwickelt. Das Sammeln von Daten aus mehreren zusammenhängenden Spektralbändern ermöglichte die Erzeugung eines Strahlungsspektrums jedes Pixels. Die Identifizierung und Definition des Strahlungsspektrums einzelner Komponenten ermöglichte es, Oberflächenmaterialien nicht nur anhand ihrer charakteristischen Spektren zu erkennen, sondern auch intervenierende Signale, wie z.B. Schwankungen des Signals durch atmosphärischen Bedingungen. Das Konzept der Detektion von Materialien anhand ihrer charakteristischen Spektren wurde 1996 auf biologische Systeme angewandt, als Schröck et al. Kombinationen von fünf verschiedenen Fluorophoren und ihren bekannten Spektren verwendeten, um markierte Chromosomen in einem Prozess zu unterscheiden, der als spektrale Karyotypisierung7. Diese Technik wurde im Jahr 2000 von Tsurui et al. für die Fluoreszenzbildgebung von Gewebeproben ausgearbeitet, wobei sieben fluoreszierende Farbstoffe und Singularwertzersetzung verwendet wurden, um eine spektrale Trennung jedes Pixels in lineare Kombinationen von Spektren in der Referenzzuteilung zu erreichen. Bibliothek8. Ähnlich wie ihre Fernerkundungs-Gegenstücke kann der Beitrag jedes bekannten Fluorophors aus dem hyperspektralen Bild berechnet werden, wobei a priori Informationen über das Spektrum jedes Fluorophors gegeben sind.
Hyperspektrale Bildgebung wurde auch in den Bereichen Landwirtschaft9, Astronomie10, Biomedizin11, chemische Bildgebung12, Umweltanwendungen13, Augenpflege14, Lebensmittelwissenschaft15, Forensische Wissenschaft16,17, medizinische Wissenschaft18, Mineralogie19, und Überwachung20. Eine wesentliche Einschränkung der aktuellen hyperspektralen Bildgebungssysteme des Fluoreszenzmikroskops besteht darin, dass die standardmäßige hyperspektrale Bildgebungstechnologie Fluoreszenzsignale in schmalen Bändern isoliert, indem sie zuerst das Anregungslicht filtert, um die Anregung der Probe zu steuern, 2) weitere Filterung emittiertes Licht, um die Fluoreszenzemission in schmale Bänder zu trennen, die später mathematisch getrennt werden können21. Durch das Filtern sowohl der Anregungsbeleuchtung als auch der emittierten Fluoreszenz wird die Menge des verfügbaren Signals reduziert, was das Signal-Rausch-Verhältnis senkt und lange Erfassungszeiten erfordert. Das niedrige Signal und die langen Erfassungszeiten begrenzen die Anwendbarkeit der hyperspektralen Bildgebung als Diagnostisches Werkzeug.
Es wurde eine bildgebende Modalität entwickelt, die hyperspektrale Bildgebung nutzt, aber das verfügbare Signal steigert und dadurch die erforderliche Erfassungszeit21,22reduziert. Diese neue Modalität, die hyperspektrale Bildgebung beim Anregungsscannen genannt wird, erfasst spektrale Bilddaten, indem sie die Anregungswellenlänge variiert und ein breites Spektrum emittierten Lichts sammelt. Es wurde bereits gezeigt, dass diese Technik im Vergleich zu Emissionsscantechniken21,22Größenordnungen im Signal-Rausch-Verhältnis erhöht. Die Erhöhung des Signal-Rausch-Verhältnisses ist weitgehend auf den weiträumigen (ca. 600 nm) von Emissionslicht, der erkannt wird, während spezifität durch Filterung nur des Anregungslichts anstelle der Fluoreszenzemission gewährleistet wird. Dadurch erreicht das gesamte emittierte Licht (für jede Anregungswellenlänge) den Detektor21. Darüber hinaus kann diese Technik verwendet werden, um Autofluoreszenz von exogenen Etiketten zu unterscheiden. Darüber hinaus reduziert die Möglichkeit, die Erfassungszeit durch erhöhtes nachweisbares Signal zu reduzieren, die Gefahr von Photobleichungen und ermöglicht Spektralscans mit einer Erfassungsrate, die für die spektrale Video-Bildgebung akzeptabel ist.
Ziel dieses Protokolls ist es, als Datenerfassungsleitfaden für die anregend-scannende hyperspektrale Bildgebungsmikroskopie zu dienen. Darüber hinaus sind Beschreibungen enthalten, die helfen, den Lichtpfad und die Hardware zu verstehen. Ebenfalls beschrieben ist die Implementierung von Open-Source-Software für ein anregendes hyperspektrales Bildgebungsmikroskop. Schließlich werden Beschreibungen bereitgestellt, wie das System auf einen NIST-nachverfolgbaren Standard kalibriert, Software- und Hardwareeinstellungen für genaue Ergebnisse angepasst und das erkannte Signal in Beiträge einzelner Komponenten entgemischt werden kann.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:2119px;" width="2120">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Airway Smooth Muscle Cells</td>
			<td style="width:327px;">National Disease Research Interchange (NDRI)</td>
			<td style="width:360px;">Isolated from human lung tissues obtained from NDRI</td>
			<td style="width:1105px;">Highly autofluorescent, calcium sensitive cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Automated Shutter</td>
			<td style="width:327px;">Thorlabs Inc.</td>
			<td style="width:360px;">SHB1</td>
			<td>Remote-controllable shutter to minimize photobleaching</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Automated Stage</td>
			<td style="width:327px;">Prior Scientific</td>
			<td style="width:360px;">H177P1T4</td>
			<td>Remote-controllable stage for automated multiple field of view or stitched image collection.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Automated Stage Controller (XY)</td>
			<td style="width:327px;">Prior Scientific</td>
			<td style="width:360px;">Proscan III (H31XYZE-US)</td>
			<td>For interfacing automated stage with computer and joystick</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Buffer</td>
			<td style="width:327px;">Made in-house</td>
			<td style="width:360px;">Made in-house</td>
			<td>145 mM NaCl, 4 mM KCl, 20 mM HEPES, 10 mM D-glucose, 1 mM MgCl2, and 1mM CaCl2, at pH 7.3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Cell Chamber</td>
			<td style="width:327px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:360px;">Attofluor Cell Chamber, A7816</td>
			<td>Coverslip holder composed of surgical stainless steel and a rubber O-ring to seal in media and prevent sample and/or objective contamination</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Excitation Filters</td>
			<td style="width:327px;">Semrock Inc.</td>
			<td style="width:360px;">TBP01-378/16</td>
			<td>Center wavelength range (340-378 nm), Bandwidth (Minimum 16 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.88)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;"></td>
			<td style="width:327px;">Semrock Inc.</td>
			<td style="width:360px;">TBP01-402/16</td>
			<td>Center wavelength range (360-400 nm), Bandwidth (Minimum 16 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.8)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;"></td>
			<td style="width:327px;">Semrock Inc.</td>
			<td style="width:360px;">TBP01-449/15</td>
			<td>Center wavelength range (400-448.8 nm), Bandwidth (Minimum 15 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.8)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;"></td>
			<td style="width:327px;">Semrock Inc.</td>
			<td style="width:360px;">TBP01-501/15</td>
			<td>Center wavelength range (448.8-501.5 nm), Bandwidth (Minimum 15 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.84)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;"></td>
			<td style="width:327px;">Semrock Inc.</td>
			<td style="width:360px;">TBP01-561/14</td>
			<td>Center wavelength range (501.5-561 nm), Bandwidth (Minimum 14 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.83)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Fluorescence Filter Cube Dichroic Beamsplitter</td>
			<td style="width:327px;">Semrock Inc.</td>
			<td style="width:360px;">FF495-Di03</td>
			<td>Separates excitation and emission light at 495 nm (&#62;98% reflection between 350-488 nm, &#62;93% transmission between 502-950 nm), Filter effective index (1.78)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Fluorescence Filter Cube Longpass Filter</td>
			<td style="width:327px;">Semrock Inc.</td>
			<td style="width:360px;">FF01 496/LP-25</td>
			<td>Allows passage of light longer than 496 nm ( &#62;93% average transmission between 503.2-1100 nm), Refractive index (1.86)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">GCaMP Probe</td>
			<td style="width:327px;">Addgene</td>
			<td style="width:360px;">G-CaMP3; Plasmid #22692</td>
			<td>A single-wavelength GCaMP2-based genetically encoded calcium indicator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Integrating Sphere</td>
			<td style="width:327px;">Ocean Optics</td>
			<td style="width:360px;">FOIS-1</td>
			<td>Used for accurate measurement of wide-angle illumination</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Inverted Fluorescence Microscope</td>
			<td style="width:327px;">Nikon Instruments</td>
			<td style="width:360px;">TE2000</td>
			<td>Inverted microscopes allow direct excitation of sample without the need to penetrate layers of media and/or tissue.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Mitotracker Green FM</td>
			<td style="width:327px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:360px;">M7514</td>
			<td>Labels mitochondria</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">NIST-Traceable Calibration Lamp</td>
			<td style="width:327px;">Ocean Optics</td>
			<td style="width:360px;">LS-1-CAL-INT</td>
			<td>A lamp with a known spectrum for use as a standard</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">NIST-Traceable Fluorescein</td>
			<td style="width:327px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:360px;">F36915</td>
			<td>For verifying appropriate spectral response of the system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">NucBlue</td>
			<td style="width:327px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:360px;">R37605</td>
			<td>Labels cell nuclei</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Objective (10X)</td>
			<td style="width:327px;">Nikon Instruments</td>
			<td style="width:360px;">Plan Apo &#955; 10X/0.45 &#8734;/0.17 MRD00105</td>
			<td>Useful for large fields of view</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Objective (20X)</td>
			<td style="width:327px;">Nikon Instruments</td>
			<td style="width:360px;">Plan Apo &#955; 20X/0.75 &#8734;/0.17 MRD00205</td>
			<td>Most often used for tissue samples</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Objective (60X)</td>
			<td style="width:327px;">Nikon Instruments</td>
			<td>Plan Apo VC 60X/1.2 WI &#8734;/0.15-0.18 WD 0.27</td>
			<td>Most often used for cell samples</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">sCMOS Camera</td>
			<td style="width:327px;">Photometrics</td>
			<td style="width:360px;">Prime 95B (Rev A8-062802018)</td>
			<td>For acquiring high-sensitivity digital images</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Spectrometer</td>
			<td style="width:327px;">Ocean Optics</td>
			<td style="width:360px;">QE65000</td>
			<td>Used to measure spectral output of excitation-scanning spectral system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Tunable Filter Changer</td>
			<td style="width:327px;">Sutter Instrument</td>
			<td style="width:360px;">Lambda VF-5</td>
			<td>Motorized unit for automated excitation filter tuning/switching</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Xenon Arc Lamp</td>
			<td style="width:327px;">Sunoptic Technologies</td>
			<td style="width:360px;">Titan 300HP Lightsource</td>
			<td>Light source with relatively uniform spectral output</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

excitation-scanning hyperspectral imaging microscopy to efficiently discriminate fluorescence signals

Mehrere Techniken basieren auf dem Nachweis von Fluoreszenzsignalen, um Phänomene zu identifizieren oder zu untersuchen oder Funktionen aufzuklären. Die Trennung dieser Fluoreszenzsignale erwies sich bis zum Aufkommen der hyperspektralen Bildgebung als umständlich, bei der Fluoreszenzquellen voneinander sowie von Hintergrundsignalen und Autofluoreszenz getrennt werden können (angesichts der Kenntnis ihrer spektralen Unterschriften). Die traditionelle hyperspektrale Bildgebung beim Emissionsscannen leidet jedoch unter langsamen Erfassungszeiten und niedrigen Signal-Rausch-Verhältnissen aufgrund der notwendigen Filterung sowohl von Anregungs- als auch von Emissionslicht. Es wurde bereits gezeigt, dass die hyperspektrale Bildgebung beim Anregungsscannen die erforderliche Erfassungszeit reduziert und gleichzeitig das Signal-Rausch-Verhältnis der erfassten Daten erhöht. Mit kommerziell erhältlichen Geräten beschreibt dieses Protokoll, wie ein hyperspektrales Mikroskopkopiesystem für die Anregung, das Scannen von Hyperspektralbildern zusammenbaut, kalibriert und verwendet wird, um Signale von mehreren Fluoreszenzquellen in einer einzigen Probe zu trennen. Obwohl diese Technik für die mikroskopische Bildgebung von Zellen und Geweben sehr anwendbar ist, kann sie auch für jede Art von Experiment mit Fluoreszenz nützlich sein, bei dem es möglich ist, Anregungswellenlängen zu variieren, einschließlich, aber nicht beschränkt auf: chemische Bildgebung, Umweltanwendungen, Augenpflege, Lebensmittelwissenschaft, Forensik, Medizin und Mineralogie.

Mehrere wichtige Schritte aus diesem Protokoll sind notwendig, um die Sammlung von Daten sicherzustellen, die sowohl genau als auch ohne Bildgebung und spektrale Artefakte sind. Das Überspringen dieser Schritte kann dazu führen, dass Daten signifikant erscheinen, aber nicht mit einem anderen spektralen Bildgebungssystem überprüft oder reproduziert werden können, wodurch alle Schlussfolgerungen, die mit diesen Daten gemacht wurden, effektiv zunichte gemacht werden. Zu diesen wichtigen...

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Excitation-Scanning Hyperspectral Imaging Microscopy to Efficiently Discriminate Fluorescence Signals

Excitation-Scanning Hyperspektrale Bildgebungsmikroskopie zur effizienten Unterscheidung von Fluoreszenzsignalen

Spektrale Bildgebung hat sich zu einer zuverlässigen Lösung für die Identifizierung und Trennung mehrerer Fluoreszenzsignale in einer einzigen Probe und kann Signale von Interesse leicht von Hintergrund- oder Autofluoreszenz unterscheiden. Die hyperspektrale Bildgebung beim Erregungsscannen verbessert diese Technik, indem die erforderliche Bildaufnahmezeit verringert und gleichzeitig das Signal-Rausch-Verhältnis erhöht wird.

Several techniques rely on detection of fluorescence signals to identify or study phenomena or to elucidate functions. Separation of these fluorescence ...

Dieses Protokoll ist von Bedeutung, da es eine Methode beschreibt, die verwendet werden kann, um mehrere fluoreszierende Signale in einer einzigen Probe zu trennen. Im Vergleich zu herkömmlichen Methoden kann das Anregungsscannen die Geschwindigkeit des Experiments erhöhen und die Empfindlichkeit der Daten verbessern. Durch die Verwendung verschiedener Beleuchtungsquellen, wie z. B. eines Superkontinuumlasers, kann diese Methode auf Spinnscheiben- oder Laserscanning-Konfokalmikroskopsysteme anwendbar sein.Bei der Durchführung von Anregungsscans, der spektralen Bildgebungsmikroskopie, ist es wichtig zu überprüfen, ob der Anregungsspitzenwert jedes fluoreszierenden Etiketts bei einer anderen Wellenlänge auftritt. Richten Sie zunächst ein invertiertes Fluoreszenzmikroskop und eine Kamera ein, wie im Textprotokoll beschrieben. Dann laden Sie die Probe auf die Bühne.Wählen Sie im Dropdown-Menü des Mikromanager-Hauptfensters 475 Nanometer für die erstmalige Probenanzeige aus. Doppelklicken Sie dann auf das Feld neben der Belichtung und geben Sie 100 ein, um die Belichtungszeit auf 100 Millisekunden einzustellen. Klicken Sie schließlich auf Live, um das Beispiel anzuzeigen.Klicken Sie nun auf Auto. Die Schaltfläche für den automatischen Intensitätsbereich, um die minimalen und maximalen Werte in aussagekräftige visuelle Bereiche zu bringen. Verwenden Sie als Nächstes die Fokusknöpfe des Mikroskops, um die Probe zu fokussieren.Passen Sie nach dem Fokus die Position des Beispiels so an, dass sich die Kante in der Mitte des Sichtfelds befindet. Dann feinabstimmen den Fokus. Das Beispiel steht im Fokus, wenn die Kanten-Features im Bild scharf erscheinen.Öffnen Sie nun das mehrdimensionale Erfassungstool. Klicken Sie im Menü auf die Ladetaste, und wählen Sie eine voreingestellte Einstellung aus, die einen geeigneten Wellenlängenbereich für die Spektralerfassung enthält. Nachdem die Erfassungseinstellungen bestätigt wurden, wechseln Sie zu einem leeren Bereich der Probe, und klicken Sie auf Abrufen, um einen Spektralbildstapel zu sammeln, der Hintergrund und Rauschen enthält, der später für die Subtraktion verwendet werden soll.Bewegen Sie sich dann in der Stichprobe, um die hellsten Bereiche zu finden. Proben haben wahrscheinlich eine intensivere Fluoreszenz afern vom Rand der Probe. Sobald sich der hellste Bereich befindet, nehmen Sie einen einzelnen Bildstapel.Laden Sie das aufgenommene Bild in Bild J, und verwenden Sie die Messfunktion von Bild J, um zu bestätigen, dass keine Wellenlängen überbelichtete Pixel enthalten. Wenn eine reduzierte Belichtungszeit aufgrund einer Überbelichtung erforderlich ist, sollte das Hintergrundbild auch mit einer neuen Belichtungszeit zurückgenommen werden. Wenn eines der Bilder die Aufwärtserkennungsgrenze der Kamera enthält, passen Sie die Belichtungszeit des Spektralscans an, um sicherzustellen, dass das maximale Signal im gesamten Spektralbereich den Dynamikbereich der Kamera nicht überschreitet.Wenn nun eine angemessene Belichtungszeit ermittelt wird, legen Sie eine unbeschriftete Probe auf die Bühne. Erfassen Sie spektrale Bilddaten aus der nicht beschrifteten Probe, um festzustellen, ob eine zugrunde liegende Autofluoresenz vorhanden ist. Legen Sie dann eine einbeschriftete Probe auf die Bühne.Erfassen Sie spektrale Bilddaten aus jedem der einzeln beschrifteten Samples, um sie als Spektralsteuerelemente zum Erstellen einer Spektralbibliothek zu verwenden. Führen Sie den Scan für jede Kontrollprobe mit einer identischen Belichtungszeit des Wellenlängenbereichs und Kameraeinstellungen durch. Legen Sie als Nächstes ein Dia mit der experimentellen Probe auf das Mikroskop.Wählen Sie ein Sichtfeld aus, das zellenentsprechend beschriftet hat, und erfassen Sie die Spektralbilddaten aus der Stichprobe mithilfe der ermittelten Erfassungseinstellungen. Korrigieren Sie Bilder auf eine flache spektrale Reaktion, indem Sie das Hintergrundspektrum vom Beispielbild subtrahieren und das Bild mit dem Korrekturkoeffizienten multiplizieren. Hier wird ein MATLAB-Skript verwendet, um die Bilder schnell zu verarbeiten.Generieren Sie als Nächstes die Spektralbibliothek. Um optimale Ergebnisse zu erzielen, normalisieren Sie jedes Endelement auf das Wellenlängenband der größten Intensität, indem Sie bestimmen, welches Wellenlängenband den intensivsten Wert hat, und die Messung bei jedem Wellenlängenband durch diesen Maximalwert dividieren. Speichern Sie dann die Spektraldaten als dat-Datei.Wenn sie abgeschlossen sind, entvermischen Sie die Spektralbilddaten. Der Unmixing-Schritt erzeugt ein Häufigkeitsbild für jedes fluoreszierende Etikett, wobei Die Häufigkeit die Menge des relativen Fluoreszenzsignals im Bild vom prospektiven Etikett ist. Öffnen Sie anschließend jedes ungemischte Bild, um die Verteilung reiner Komponenten visuell zu überprüfen.Vergleichen Sie die Größe des Fehlerbildes mit der Größe der nicht gemischten Bilder. Wenn die Größe des Fehlerbildes den ungemischten Häufigkeitsbildern ähnelt, werden Signale in den Spektralbilddaten möglicherweise nicht genau berücksichtigt. Überprüfen Sie schließlich, ob keine nicht identifizierten Residuenstrukturen vorhanden sind, indem Sie das Fehlerbild mit den nicht gemischten Bildern vergleichen.Bei korrekter Verarbeitung ermöglicht der spektrale Unmixprozess die Trennung eines Spektralbildstapels in die jeweiligen Beiträge von jedem Fluoreszenzetikett. Hier ein ungemischter Spektralbildmitmittmit, der auf die glatte Muskelzellautofluoreszenz der Atemwege hinweist, eine GCaMP-Sonde und ein mitochondriales Etikett. Es gibt einen hohen Fehler, der mit den kerntechnischen und perinuklearen Regionen der Zellen verbunden ist, was darauf hindeutet, dass die gemessenen Spektren dieser Regionen nicht gut durch die Spektren in der Spektralbibliothek berücksichtigt werden.Reine Spektren, die aus beschrifteten Zellen gesammelt werden, die auch autofluoreszierend sind, werden wahrscheinlich das Spektralprofil für die reine Komponente kontaminieren. Hier kann man den Unterschied der Unmischung mit reinen Spektren sehen, die mit Autofluoreszenz kontaminiert sind, im Vergleich zu den korrigierten reinen Spektren nach skalierter Subtraktion. Die richtige Datenerfassung ist bei der Abbildung empfindlicher Proben unerlässlich, da sie im Gegensatz zum Hintergrund und den Steuerelementen, die möglicherweise neu abgebildet werden, nur eine einzelne Bildgebungssitzung überstehen.Stellen Sie sicher, dass die richtigen Hardware- und Erfassungseinstellungen so weit wie möglich vorgegeben sind. Als nächster Schritt können Videos, die aus Zeitrafferdaten erstellt wurden, die mit diesem System erfasst wurden, verwendet werden, um fluoreszierende Quellen an diskreten Orten im Laufe der Zeit zu verfolgen, z. B. durch die Lokalisierung des zweiten Messenger-Signals. Achten Sie darauf, wenn Sie leistungsstarke Lichtquellen verwenden, um Augeneinwirkung zu vermeiden.Achten Sie auch darauf, beim Umgang mit biologischen Etiketten die richtigen Handschuhe zu tragen.

Research

JoVE Journal

Engineering

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