Name: excitation-scanning hyperspectral imaging microscopy to efficiently discriminate fluorescence signals
Uploaded: 2019-08-22T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Excitation-Scanning Hyperspectral Imaging Microscopy to Efficiently Discriminate Fluorescence Signals at JoVE.com

המחברים רוצים להכיר בתמיכה של NSF 1725937, NIH P01HL066299, NIH R01HL058506, NIH S10OD020149, NIH UL1 TR001417, NIH R01HL137030, AHA 18PRE34060163, וקרן אברהם מיטשל לחקר הסרטן.

1. הגדרת התקן
<ol><li>מקור אור: לבחור מקור רחב הלהקה אור ספקטרלי עם התפוקה הגבוהה החשמל ואת המקור גבוה (300 W Xe מנורת arc שימש למחקרים אלה).</li>
	<li>תריס (אופציונלי): להוסיף תריס על הנתיב האופטי כדי להפחית את הלבנת התמונה עבור הדמיה זמן.</li>
	<li>מערכת מסנן tunable: לשלב הרכבה כוונון מכני ו-סרט דק מסנן tunable (TFTF) ...

השימוש האופטימלי של הגדרת הדמיה היפרספקטקטרלית בסריקת עירור מתחיל בבניית הנתיב האור. בפרט, בחירה של מקור אור, מסננים (tunable ו דיקרואיק), החלפת מסנן שיטה, ומצלמה לקבוע את טווח ספקטרלי זמין, מהירות סריקה אפשרית, הרגישות גלאי, ודגימה מרחבית. מנורות מרקורי קשת מציעים רבים באורך גל הפסגות אבל לא מ?...

הדמיה ספקטרלית ניתן לבצע במגוון דרכים והוא מכונה על ידי כמה מונחים1,2,3,4. באופן כללי, הדמיה ספקטרלית מתייחסת לנתונים הנרכשים לפחות שני ממדים מרחביים ומימד ספקטרלי אחד. הדמיה רב ספקטראלית והיפרספקטקטרלית מאופיינת לרוב במספר הלהקות של אורך הגל או אם הלהקות הספקטרליות הן רציפות1. עבור יישום זה, נתונים היפרספקטקטרליים מוגדר נתונים ספקטרליים שנרכשו עם מסגרות גל רציפים שהושגו על ידי מרווח של אורכי גל מרכזי לא פחות ממחצית רוחב מלא על חצי מקסימום (FWHM) של כל מסנן בנדנה המשמש עירור (כלומר, 5 ננומטר מרווח אורך גל מרכזי עבור מסנני bandpass עם 14-20 ננומטר רוחב פס). הטבע הרציף של להקות הנתונים מאפשר דגימת יתר של ערכת המידע, ומבטיח שקריטריוני נייקוויסט יהיו מרוצים בעת דגימת התחום הספקטרלי.
הדמיה היפרספקטראלית פותחה על ידי נאס א בשנות ה-70 וה-1980 בשילוב עם לווין הראשון של landsat5,6. איסוף נתונים מכמה להקות ספקטרליות רציפות מותר לדור של ספקטרום זוהר של כל פיקסל. זיהוי והגדרה של ספקטרום הזוהר של רכיבים בודדים איפשר לא רק לזהות את חומרי השטח על ידי הספקטרום האופייני שלהם, אבל זה גם מותר להסרת אותות בהתערבות, כגון וריאציות באות בשל תנאים אטמוספריים. הרעיון של זיהוי חומרים באמצעות ספקטרום האופייני שלהם הוחל על מערכות ביולוגיות ב 1996 כאשר שרדינגר et al. בשימוש שילובים של חמישה fluorophores שונים ואת הספקטרום הידוע שלהם כדי להבדיל כרומוזומים המסומנים בתהליך כינה מקלדת ספקטרלית7. טכניקה זו פירט על ידי Tsurui ואח 2000 ' עבור הדמיה פלואורסצנטית של דגימות רקמה, באמצעות שבעה צבעי פלורסנט והתפרקות ערך יחיד כדי להשיג הפרדה ספקטרלית של כל פיקסל לתוך צירופים ליניאריים של ספקטרום בהפניה . ספריה8 בדומה עמיתיהם חישה מרחוק שלהם, את התרומה של כל fluorophore ידוע ניתן לחשב מן התמונה היפרספקטראלית, נתון מידע של הספקטרום של כל fluorophore.
הדמיה היפרקטרלית בשימוש גם בתחומי החקלאות9, אסטרונומיה10, ביודינין11, הדמיה כימית12, יישומים סביבתיים13, טיפול עיניים14, מזון מדע15, המדע המשפטי16,17, מדעי הרפואה18, מינרלוגיה19, ומעקבים20. מגבלה מרכזית של הנוכחי מיקרוסקופ היפרספקטקטרליות מערכות הדמיה היא כי טכנולוגיית ההדמיה הסטנדרטית היפרקטרלית מבודד אותות זריחה להקות צר ידי 1) סינון ראשוני של אור עירור כדי לשלוט עירור המדגם, אז 2) מסנן את האור הנפלט כדי להפריד את פליטת הזריחה ללהקות צרות שיכולות להיות מופרדות מאוחר יותר21מתמטית. סינון הן התאורה העירור והזריחה הנפלטת מפחית את כמות האות הזמינה, המורידה את היחס בין האות לרעש ומחייבת זמני רכישה ארוכים. האות הנמוך וזמני הרכישה הארוכים מגבילים את הישימות של הדמיה היפרספקטראלית ככלי אבחון.
מודאליות הדמיה פותחה שעושה שימוש בהדמיה היפרקטרלית אבל מגביר את האות הזמין, ובכך לצמצם את זמן הרכישה הדרוש21,22. זה חדש מודאליות, שנקרא עירור-סריקה היפרספקטקטרלית, רוכשת נתונים התמונה ספקטרלית על ידי שינוי אורך הגל ואיסוף מגוון רחב של אור נפלט. זה כבר הוכח כי טכניקה זו מניבה הזמנות של עליות גודל ביחס אות לרעש בהשוואה לטכניקות סריקה פליטה21,22. הגידול ביחס אות לרעש הוא במידה רבה בשל המעבר ברוחב (~ 600 nm) של אור פליטה זוהה, בעוד הספציפיות מסופק על ידי סינון רק אור עירור במקום פליטת הזריחה. זה מאפשר את כל האור הנפלט (עבור כל גל עירור) כדי להגיע לגלאי21. בנוסף, ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי להפלות את הקרינה האוטומטית מתוויות אקסוגני. יתר על כן, את היכולת להפחית את זמן הרכישה בשל האות מוגבר לגילוי מפחית את הסכנה של הלבנת, כמו גם מאפשר סריקות ספקטרליות בקצב הרכישה מקובל עבור דימות וידאו ספקטרלי.
המטרה של פרוטוקול זה היא לשמש כמדריך לרכישת נתונים עבור מיקרוסקופ הדמיה היפרספקטקטרלית סריקה. בנוסף, כלולים תיאורים המסייעים להבנת הנתיב האור והחומרה. תואר גם הוא יישום של תוכנה מקור פתוח עבור מיקרוסקופ הדמיה היפרספקטקטרלית סריקה. לבסוף, התיאורים מסופקים לאופן הכיול של המערכת לתקן הניתן למעקב נשים, להתאים הגדרות תוכנה וחומרה לקבלת תוצאות מדויקות ולבטל את הערבול של האות המזוהה לתרומות מרכיבים בודדים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:2119px;" width="2120">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Airway Smooth Muscle Cells</td>
			<td style="width:327px;">National Disease Research Interchange (NDRI)</td>
			<td style="width:360px;">Isolated from human lung tissues obtained from NDRI</td>
			<td style="width:1105px;">Highly autofluorescent, calcium sensitive cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Automated Shutter</td>
			<td style="width:327px;">Thorlabs Inc.</td>
			<td style="width:360px;">SHB1</td>
			<td>Remote-controllable shutter to minimize photobleaching</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Automated Stage</td>
			<td style="width:327px;">Prior Scientific</td>
			<td style="width:360px;">H177P1T4</td>
			<td>Remote-controllable stage for automated multiple field of view or stitched image collection.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Automated Stage Controller (XY)</td>
			<td style="width:327px;">Prior Scientific</td>
			<td style="width:360px;">Proscan III (H31XYZE-US)</td>
			<td>For interfacing automated stage with computer and joystick</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Buffer</td>
			<td style="width:327px;">Made in-house</td>
			<td style="width:360px;">Made in-house</td>
			<td>145 mM NaCl, 4 mM KCl, 20 mM HEPES, 10 mM D-glucose, 1 mM MgCl2, and 1mM CaCl2, at pH 7.3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Cell Chamber</td>
			<td style="width:327px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:360px;">Attofluor Cell Chamber, A7816</td>
			<td>Coverslip holder composed of surgical stainless steel and a rubber O-ring to seal in media and prevent sample and/or objective contamination</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Excitation Filters</td>
			<td style="width:327px;">Semrock Inc.</td>
			<td style="width:360px;">TBP01-378/16</td>
			<td>Center wavelength range (340-378 nm), Bandwidth (Minimum 16 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.88)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;"></td>
			<td style="width:327px;">Semrock Inc.</td>
			<td style="width:360px;">TBP01-402/16</td>
			<td>Center wavelength range (360-400 nm), Bandwidth (Minimum 16 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.8)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;"></td>
			<td style="width:327px;">Semrock Inc.</td>
			<td style="width:360px;">TBP01-449/15</td>
			<td>Center wavelength range (400-448.8 nm), Bandwidth (Minimum 15 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.8)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;"></td>
			<td style="width:327px;">Semrock Inc.</td>
			<td style="width:360px;">TBP01-501/15</td>
			<td>Center wavelength range (448.8-501.5 nm), Bandwidth (Minimum 15 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.84)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;"></td>
			<td style="width:327px;">Semrock Inc.</td>
			<td style="width:360px;">TBP01-561/14</td>
			<td>Center wavelength range (501.5-561 nm), Bandwidth (Minimum 14 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.83)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Fluorescence Filter Cube Dichroic Beamsplitter</td>
			<td style="width:327px;">Semrock Inc.</td>
			<td style="width:360px;">FF495-Di03</td>
			<td>Separates excitation and emission light at 495 nm (&#62;98% reflection between 350-488 nm, &#62;93% transmission between 502-950 nm), Filter effective index (1.78)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Fluorescence Filter Cube Longpass Filter</td>
			<td style="width:327px;">Semrock Inc.</td>
			<td style="width:360px;">FF01 496/LP-25</td>
			<td>Allows passage of light longer than 496 nm ( &#62;93% average transmission between 503.2-1100 nm), Refractive index (1.86)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">GCaMP Probe</td>
			<td style="width:327px;">Addgene</td>
			<td style="width:360px;">G-CaMP3; Plasmid #22692</td>
			<td>A single-wavelength GCaMP2-based genetically encoded calcium indicator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Integrating Sphere</td>
			<td style="width:327px;">Ocean Optics</td>
			<td style="width:360px;">FOIS-1</td>
			<td>Used for accurate measurement of wide-angle illumination</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Inverted Fluorescence Microscope</td>
			<td style="width:327px;">Nikon Instruments</td>
			<td style="width:360px;">TE2000</td>
			<td>Inverted microscopes allow direct excitation of sample without the need to penetrate layers of media and/or tissue.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Mitotracker Green FM</td>
			<td style="width:327px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:360px;">M7514</td>
			<td>Labels mitochondria</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">NIST-Traceable Calibration Lamp</td>
			<td style="width:327px;">Ocean Optics</td>
			<td style="width:360px;">LS-1-CAL-INT</td>
			<td>A lamp with a known spectrum for use as a standard</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">NIST-Traceable Fluorescein</td>
			<td style="width:327px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:360px;">F36915</td>
			<td>For verifying appropriate spectral response of the system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">NucBlue</td>
			<td style="width:327px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:360px;">R37605</td>
			<td>Labels cell nuclei</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Objective (10X)</td>
			<td style="width:327px;">Nikon Instruments</td>
			<td style="width:360px;">Plan Apo &#955; 10X/0.45 &#8734;/0.17 MRD00105</td>
			<td>Useful for large fields of view</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Objective (20X)</td>
			<td style="width:327px;">Nikon Instruments</td>
			<td style="width:360px;">Plan Apo &#955; 20X/0.75 &#8734;/0.17 MRD00205</td>
			<td>Most often used for tissue samples</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Objective (60X)</td>
			<td style="width:327px;">Nikon Instruments</td>
			<td>Plan Apo VC 60X/1.2 WI &#8734;/0.15-0.18 WD 0.27</td>
			<td>Most often used for cell samples</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">sCMOS Camera</td>
			<td style="width:327px;">Photometrics</td>
			<td style="width:360px;">Prime 95B (Rev A8-062802018)</td>
			<td>For acquiring high-sensitivity digital images</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Spectrometer</td>
			<td style="width:327px;">Ocean Optics</td>
			<td style="width:360px;">QE65000</td>
			<td>Used to measure spectral output of excitation-scanning spectral system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Tunable Filter Changer</td>
			<td style="width:327px;">Sutter Instrument</td>
			<td style="width:360px;">Lambda VF-5</td>
			<td>Motorized unit for automated excitation filter tuning/switching</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Xenon Arc Lamp</td>
			<td style="width:327px;">Sunoptic Technologies</td>
			<td style="width:360px;">Titan 300HP Lightsource</td>
			<td>Light source with relatively uniform spectral output</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

excitation-scanning hyperspectral imaging microscopy to efficiently discriminate fluorescence signals

טכניקות אחדות מסתמכות על גילוי אותות של קרינה פלואורסצנטית כדי לזהות או לחקור תופעות או להבהיר פונקציות. הפרדת האותות הללו בעלי קרינה פלואורסצנטית הוכחו מסורבל עד הופעתו של הדמיה היפרספקטראלית, שבו מקורות פלואורסצנטית ניתן להפריד זה מזה, כמו גם מאותות הרקע ומלא התאמה אוטומטית (נתון הידע של שלהם ספקטרלי חתימות). עם זאת, מסורתי, סריקת פליטה הדמיה hyperקטרלית סובלת מזמני רכישה איטית ויחס אות לרעש נמוך בשל הסינון הדרוש של שני עירור ואור פליטה. זה כבר הוכח כי עירור הדמיה היפרספקטקטרלית מפחית את זמן הרכישה הדרוש תוך הגברת היחס אות לרעש של נתונים שנרכשו. באמצעות ציוד מסחרי זמין, פרוטוקול זה מתאר כיצד להרכיב, לכייל ולהשתמש במערכת מיקרוסקופ הדמיה היפרספקטקטרראלית להפרדת אותות ממספר מקורות פלואורסצנטית במדגם אחד. בעוד שהיא ישימה מאוד לדימות מיקרוסקופיים של תאים ורקמות, טכניקה זו עשויה גם להיות שימושית עבור כל סוג של ניסוי ניצול הקרינה שבה ניתן לשנות את אורכי גל עירור, כולל אך לא מוגבל: הדמיה כימית, יישומים סביבתיים, טיפול בעיניים, מדעי המזון, מדע הזיהוי הפלילי, מדע הרפואה ומינרלוגיה.

מספר צעדים חשובים מפרוטוקול זה נחוצים כדי להבטיח את אוסף הנתונים שהוא גם מדויק ונטול הדמיה וחפצים ספקטרליות. דילוג על שלבים אלה עלול לגרום לנתונים הנראים משמעותיים אך לא ניתן לאמת או לשכפל עם כל מערכת הדמיה ספקטרלית אחרת, ובכך לבטל את כל המסקנות שנעשו עם הנתונים אמר. הראש...

Watch this Scientific Journal Video about Excitation-Scanning Hyperspectral Imaging Microscopy to Efficiently Discriminate Fluorescence Signals at JoVE.com

Excitation-Scanning Hyperspectral Imaging Microscopy to Efficiently Discriminate Fluorescence Signals

עירור-סריקת מיקרוסקופ היפרספקטקטרלי ביעילות אותות זריחה להפלות

הדמיה ספקטרלית הפך פתרון אמין לזיהוי והפרדה של אותות מרובים של זריחה במדגם אחד והוא יכול בקלות להבחין אותות של עניין מרקע או פלואורסצנטית אוטומטי. עירור-סריקת הדמיה hyperקטרראלית משפרת בטכניקה זו על ידי הפחתת הזמן הדרוש לרכישת תמונה תוך הגברת היחס האות לרעש.

Several techniques rely on detection of fluorescence signals to identify or study phenomena or to elucidate functions. Separation of these fluorescence ...

פרוטוקול זה הוא משמעותי כפי שהוא מתאר שיטה אשר ניתן להשתמש בהם כדי להפריד מספר אותות פלואורסצנטיים בדגימה אחת. בהשוואה לשיטות מסורתיות, סריקת העירור יכולה להגביר את מהירות הניסוי ולשפר את רגישות הנתונים. על ידי שימוש במקורות תאורה שונים כגון לייזר רצף על, שיטה זו עשויה להיות ישימה עבור דיסק מסתובב או לייזר סריקת מערכות מיקרוסקופ קונפוקל.בעת ביצוע סריקות גירוי, מיקרוסקופ הדמיה ספקטרלית, חשוב לבדוק כי שיא העירור של כל תווית פלואורסצנטי מתרחשת באורך גל שונה. כדי להתחיל, הגדר מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך ומצלמה כמתואר בפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן טען את הדגימה על הבמה.מהתפריט הנפתח של החלון הראשי של המיקרו-ניהול, בחר 475 ננומטר לצפייה ראשונית בדגימה. לאחר מכן לחץ פעמיים על התיבה לצד החשיפה והזן 100 כדי להגדיר את זמן החשיפה ב- 100 אלפיות השניה. לבסוף, לחץ על שידור חי כדי להציג את הדוגמה.עכשיו לחץ על אוטומטי. לחצן טווח הצפייה בעוצמה אוטומטית כדי להביא את הערכים המינימליים והמקסימום לטווחים חזותיים משמעותיים. לאחר מכן, השתמשו ב ידיות המיקוד של המיקרוסקופ כדי למקד את הדגימה.לאחר ההתמקדות, התאם את מיקום המדגם כך שהקצה שלו יהיה במרכז שדה התצוגה. ואז לכוונן את המיקוד. הדגימה נמצאת במוקד כשתכונות הקצה בתמונה נראות חדות.עכשיו, פתח את כלי הרכישה הרב-ממדי. בתפריט, לחצו על הלחצן 'טען' ובחרו קביעה מוגדרת מראש הכוללת טווח אורך גל מתאים לרכישה ספקטרלית. לאחר אישור הגדרות הרכישה, עבור לאזור ריק של הדגימה ולחץ על רכישה כדי לאסוף מחסנית תמונה ספקטרלית המכילה רקע ורעש לשימוש לצורך חיסור מאוחר יותר.לאחר מכן, עבור על הדוגמה כדי למצוא את האזורים הבהירים ביותר. דגימות צפויות להיות פלואורסצנטיות אינטנסיבית יותר הרחק מקצה המדגם. לאחר מיקום האזור הבהיר ביותר, יש לקחת ערימת תמונות בודדת.טען את התמונה שנרכשה לתוך Image J ולהשתמש בפונקציית המידה של Image J כדי לאשר כי אורכי גל לא מכילים פיקסלים שלא נתגלה יתר על המידה. אם יש צורך בזמן חשיפה מופחת עקב חשיפת יתר, יש לכבוש מחדש את תמונת הרקע עם זמן חשיפה חדש גם כן. אם נמצא כי אחת מהתמונות מכילה את מגבלת הזיהוי כלפי מעלה של המצלמה, התאם את זמן החשיפה של הסריקה הספקטרלית כדי להבטיח שהאות המרבי בטווח הספקטרלי לא יחרוג מהטווח הדינמי של המצלמה.עם זמן חשיפה מתאים שנקבע כעת, מניחים דגימה ללא תווית על הבמה. רכוש נתוני תמונה ספקטרליים מהדגימה ללא תכלית כדי לקבוע אם קיימת שפעת אוטומטית בסיסית. לאחר מכן, מקם דגימה עם תווית אחת על הבמה.רכוש נתוני תמונה ספקטרליים מכל אחת מהדוגמאות עם התווית הבודדת כדי להשתמש בהם כפקדים ספקטרליים לבניית ספריה ספקטרלית. בצע את הסריקה עבור כל דגימת בקרה באמצעות זמן חשיפה זהה לטווח אורך הגל והגדרות המצלמה. לאחר מכן, מקם שקופית המכילה את הדגימה הניסיונית במיקרוסקופ.בחר שדה תצוגה עם תוויות מתאימות לתאים והשיג את נתוני התמונה הספקטרליים מהדגימה באמצעות הגדרות הרכישה שנקבעו. תקן תמונות לתגובה ספקטרלית שטוחה על-ידי חיסור ספקטרום הרקע מתצלמת הדגימה והכפלת התמונה במקדם התיקון. כאן, סקריפט MATLAB משמש לעיבוד מהיר של התמונות.לאחר מכן, צור את הספרייה הספקטרלית. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, לנרמל כל חבר קצה לרצועה באורך הגל בעוצמה הגדולה ביותר על-ידי קביעת הערך האינטנסיבי ביותר של רצועת אורך הגל וחלוקת המדידה בכל רצועת אורך גל בערך מרבי זה. לאחר מכן שמור את הנתונים הספקטרליים כקובץ dat.לאחר השלמת הפעולה, בטל את ההבעה של נתוני התמונה הספקטרלית. הצעד הבלתי מעורער ייצור תמונת שפע עבור כל תווית פלואורסצנטית, שבה שפע הוא כמות האות הפלואורסצנטי היחסי בתמונה מהתווית הפוטנציאלית. לאחר מכן, פתח כל תמונה ללאmixed כדי לבדוק באופן חזותי את התפלגות הרכיבים הטהורים.השווה את גודל תמונת השגיאה לאלה של התמונות שאינן מוקסות. אם גודל תמונת השגיאה דומה לתמונות השפע שלא נבעו, ייתכן שאותות נתוני התמונה הספקטרלית לא יצוצו במדויק. לבסוף, ודא כי אין מבנים שיורית לא מזוהה על ידי השוואת תמונת השגיאה לתמונות unmixed.כאשר מתבצע כראוי, תהליך unmixing ספקטרלי מאפשר הפרדה של ערימת תמונה ספקטרלית לתוך תרומות בהתאמה מכל תווית פלואורסצנטיות. כאן, ערכת תמונה ספקטרלית ללא מעופש עם תמונות בודדות המדגישות את השפע האוטומטי של תאי השריר החלקים בדרכי הנשימה, בדיקה של GCaMP ותווית מיטוכונדרית. קיימת שגיאה גבוהה הקשורה לאזורים הגרעיניים וה perinuclear של התאים המציין כי הספקטרום הנמדד של אזורים אלה אינם אחראים היטב על ידי ספקטרום בספריה ספקטרלית.ספקטרום טהור שנאסף מתאים מסומנים כי הם גם autofluorescent צפוי לזהם את הפרופיל הספקטרלי עבור הרכיב הטהור. כאן, ניתן לראות את ההבדל של unmixing עם ספקטרום טהור מזוהם עם שפעת אוטומטית, לעומת ספקטרום טהור מתוקן לאחר הפחתה בקנה מידה. רכישת נתונים נכונה היא חיונית כאשר דימות דגימות רגישות כפי שהם עשויים לשרוד רק הפעלת הדמיה אחת בניגוד לרקע ופקדים אשר ניתן לדמיין מחדש.ודא שהגדרות החומרה והרכישה המתאימות נקבעות מראש ככל האפשר. כשלל הבא, קטעי וידאו שנוצרו מנתונים לשגות זמן שנרכשו באמצעות מערכת זו ניתן להשתמש כדי לעקוב אחר מקורות פלואורסצנטיים במקומות דיסקרטיים לאורך זמן כגון לוקליזציה אות שליח שני. יש לדאוג בעת שימוש במקורות אור רבי עוצמה כדי למנוע חשיפה לעיניים.כמו כן, הקפד ללבוש כפפות נאותות בעת טיפול תוויות ביולוגיות.

Research

JoVE Journal

Engineering

Use of a Multi-compartment Dynamic Single Enzyme Phantom for Studies of Hyperpolarized Magnetic Resonance Agents

שימוש פנטום אנזים יחיד דינמי רב-תא ללימודים של סוכני תהודה מגנטית Hyperpolarized

Imaging of hyperpolarized substrates by magnetic resonance shows great clinical promise for assessment of critical biochemical processes in real time. Due ...

Dynamic Pore-scale Reservoir-condition Imaging of Reaction in Carbonates Using Synchrotron Fast Tomography

Dynamic נקבובית בקנה מידה Reservoir-מצב הדמיה של ריאקציה קרבונטים שימוש טומוגרפיה Synchrotron מהיר

Underground storage permanence is a major concern for carbon capture and storage. Pumping CO2 into carbonate reservoirs has the potential to dissolve ...

Advanced Compositional Analysis of Nanoparticle-polymer Composites Using Direct Fluorescence Imaging

ניתוח ההלחנה מתקדם של מרוכבים Nanoparticle-פולימר באמצעות דימות פלואורסצנטי ישיר

The fabrication of polymer-nanoparticle composites is extremely important in the development of many functional materials. Identifying the precise ...

Sub-nanometer Resolution Imaging with Amplitude-modulation Atomic Force Microscopy in Liquid

הדמיה ברזולוציה משנה ננומטר עם מיקרוסקופית כוח אטומי משרעת אפנון בנוזל

Atomic force microscopy (AFM) has become a well-established technique for nanoscale imaging of samples in air and in liquid. Recent studies have shown ...

Microfluidic Imaging Flow Cytometry by Asymmetric-detection Time-stretch Optical Microscopy (ATOM)

Microfluidic Imaging Flow Cytometry by Asymmetric-detection Time-stretch Optical Microscopy ATOM

Microfluidic דימות זרימת cytometry ידי אסימטרית איתור זמן למתוח אופטי מיקרוסקופית (ATOM)

Scaling the number of measurable parameters, which allows for multidimensional data analysis and thus higher-confidence statistical results, has been the ...

Novel Photoacoustic Microscopy and Optical Coherence Tomography Dual-modality Chorioretinal Imaging in Living Rabbit Eyes

הדמיה Chorioretinal כפול-מודאליות מיקרוסקופ Photoacoustic הרומן ו טומוגרפיה אופטית קוהרנטית בעיניים הארנב חי

Photoacoustic ocular imaging is an emerging ophthalmic imaging technology that can noninvasively visualize ocular tissue by converting light energy into ...

Synchrotron X-ray Microdiffraction and Fluorescence Imaging of Mineral and Rock Samples

סינכרוטרון Microdiffraction רנטגן והדמיה זריחה של דגימות הסלע המינרלים

In this report, we describe a detailed procedure for acquiring and processing&#160;x-ray microfluorescence (&#956;XRF), and Laue and powder ...

Label-Free Imaging of Single Proteins Secreted from Living Cells via iSCAT Microscopy

ללא תווית הדמיה של יחיד חלבונים מופרש מתאי חי דרך iSCAT מיקרוסקופ

We demonstrate interferometric scattering (iSCAT) microscopy, a method capable of detecting single unlabeled proteins secreted from individual living ...