Name: excitation-scanning hyperspectral imaging microscopy to efficiently discriminate fluorescence signals
Uploaded: 2019-08-22T12:30:00
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लेखकों को एनएसएफ 1725937, NIH P01HL066299, NIH R01HL058506, NIH S10OD020149, NIH UL1 TR001417, NIH R01HL137030, AHA 18PRE34060163, और मिशेल कैंसर अनुसंधान से समर्थन स्वीकार करना चाहते हैं.

1. डिवाइस सेट-अप
<ol><li>प्रकाश स्रोत: उच्च शक्ति उत्पादन और उच्च समांतरण के साथ एक व्यापक बैंड वर्णक्रमीय प्रकाश स्रोत का चयन करें (एक 300 डब्ल्यू Xe चाप दीपक इन अध्ययनों के लिए इस्तेमाल किया गया था).</li>
	<li>शटर (वैक...

एक उत्तेजना स्कैनिंग hyperspectral इमेजिंग सेट अप का इष्टतम उपयोग प्रकाश पथ के निर्माण के साथ शुरू होता है. विशेष रूप से, प्रकाश स्रोत की पसंद, फिल्टर (टूनाबल और dichroic), फिल्टर स्विचन विधि, और कैमरा उपलब्ध वर्णक्रमी...

स्पेक्ट्रल इमेजिंग विभिन्न तरीकों से की जा सकती है और इसे अनेक शब्दों1,2,3,4द्वारा निर्दिष्ट किया जाता है . सामान्य तत्त्क्षणीय इमेजिंग कम से कम दो स्थानिक आयामों और एक वर्णक्रमीय आयाम में प्राप्त डेटा को निर्दिष्ट करता है। बहुस्पेक्ट्रल और हाइपरस्पेक्ट्रल इमेजिंग अक्सर तरंगदैर्ध्य बैंडों की संख्या से अलग होती है या क्या वर्णक्रमीय बैंड समीपवर्ती1होते हैं। इस आवेदन के लिए, hyperspectral डेटा उत्तेजना के लिए इस्तेमाल किया प्रत्येक bandpass फिल्टर की आधी अधिकतम (FWHM) पर आधे से कम नहीं आधे से अधिक पूर्ण चौड़ाई केंद्र तरंगदैर्ध्य के अंतराल द्वारा प्राप्त निरंतर तरंगदैर्ध्य बैंड के साथ प्राप्त वर्णक्रमीय डेटा के रूप में परिभाषित किया गया है (यानी, 5 एनएम 14-20 एनएम बैंडविड्थ के साथ bandpass फिल्टर के लिए केंद्र तरंगदैर्ध्य रिक्ति) डेटा बैंड के निरंतर प्रकृति डेटासेट के एक oversampling के लिए अनुमति देता है, यह सुनिश्चित करना है कि NyQuist मापदंड संतुष्ट हैं जब वर्णक्रमीय डोमेन नमूना.
हाइपरस्पेक्ट्रल इमेजिंग को नासा द्वारा 1970 और 1980 के दशक में पहले लैंडसैट उपग्रह5,6के साथ संयोजन के रूप में विकसित किया गया था . कई आसन्न वर्णक्रमीय बैंड से डेटा एकत्र प्रत्येक पिक्सेल की एक चमक स्पेक्ट्रम की पीढ़ी की अनुमति दी. अलग-अलग घटकों की चमक स्पेक्ट्रम की पहचान और परिभाषित करने से न केवल उनकी विशेषता स्पेक्ट्रम द्वारा सतह सामग्री का पता लगाना संभव हो गया है, बल्कि यह हस्तक्षेप संकेतों को हटाने के लिए भी अनुमति देता है, जैसे कि सिग्नल में बदलाव के कारण वायुमंडलीय स्थितियों. उनकी विशेषता स्पेक्ट्रम का उपयोग कर सामग्री का पता लगाने की अवधारणा 1996 में जैविक प्रणालियों के लिए लागू किया गया था जब श्रेक एट अल. पांच अलग fluorophores और उनके ज्ञात spectra के संयोजन का इस्तेमाल किया एक प्रक्रिया में लेबल गुणसूत्रों भेद करने के लिए कहा वर्णक्रमीय कर्योटाइपिंग7| इस तकनीक पर विस्तार से किया गया था 2000 Tsurui एट अल द्वारा ऊतक के नमूने के फ्लोरोसेंट इमेजिंग के लिए, सात फ्लोरोसेंट रंगों और विलक्षण मूल्य अपघटन का उपयोग करने के लिए संदर्भ में स्पेक्ट्रम के रैखिक संयोजन में प्रत्येक पिक्सेल के वर्णक्रमीय जुदाई को प्राप्त करने के लिए पुस्तकालय8| उनके रिमोट सेंसिंग समकक्षों के समान, प्रत्येक ज्ञात फ्लोरोफोर के योगदान की गणना हाइपरस्पेक्ट्रल छवि से की जा सकती है, प्रत्येक फ्लोरोफोर के स्पेक्ट्रम की एक प्राथमिकता जानकारी दी जाती है।
हाइपरस्पेक्ट्रल इमेजिंग का उपयोग कृषिकेक्षेत्रों में भी किया गया है 9 , खगोल विज्ञान10, बायोमेडिसिन11, रासायनिक इमेजिंग12, पर्यावरण अनुप्रयोग13, नेत्र देखभाल14, खाद्य विज्ञान15, फॉरेंसिक साइंस16,17, मेडिकल साइंस18, खनिजविज्ञान 19, और निगरानी20. वर्तमान फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप hyperspectral इमेजिंग सिस्टम की एक प्रमुख सीमा यह है कि मानक hyperspectral इमेजिंग प्रौद्योगिकी द्वारा संकीर्ण बैंड में फ्लोरोसेंट संकेतों को अलग 1) पहले नमूना उत्तेजना को नियंत्रित करने के लिए उत्तेजना प्रकाश छानने, तो 2) आगे छानने उत्सर्जित प्रकाश संकीर्ण बैंड है कि बाद में गणितीय21अलग किया जा सकता है में फ्लोरोसेंट उत्सर्जन को अलग करने के लिए। उत्तेजना रोशनी और उत्सर्जित फ्लोरोसेंट दोनों को फ़िल्टर करने से उपलब्ध सिग्नल की मात्रा कम हो जाती है, जो सिग्नल-टू-शोर अनुपात को कम करती है और लंबा अधिग्रहण समय आवश्यक है। कम संकेत और लंबा अधिग्रहण बार एक नैदानिक उपकरण के रूप में hyperspectral इमेजिंग की प्रयोज्यता सीमा.
एक इमेजिंग मोडलिटी विकसित की गई है जो हाइपरस्पेक्ट्रल इमेजिंग का उपयोग करती है लेकिन उपलब्ध सिग्नल को बढ़ा देती है, जिससे आवश्यक अधिग्रहण समय21,22को कम किया जा सकता है। इस नई मोडलिटी, जिसे उत्तेजना-स्कैनिंग हाइपरस्पेक्ट्रल इमेजिंग कहा जाता है, उत्तेजना तरंगदैर्ध्य को अलग करके और उत्सर्जित प्रकाश की एक विस्तृत श्रृंखला का संग्रह करके वर्णक्रमीय छवि डेटा प्राप्त करती है। यह पहले से दर्शाया गया है कि इस तकनीक से उत्सर्जन स्कैनिंग तकनीकों21,22की तुलना में संकेत-से-शोर अनुपात में परिमाण वृद्धि के आदेश प्राप्त होते हैं। सिग्नल-टू-शोर अनुपात में वृद्धि काफी हद तक उत्सर्जन प्रकाश के विस्तृत बैंडपास ($600 एनएम) के कारण हुई है, जबकि विशिष्टता फ्लोरोसेंट उत्सर्जन के बजाय केवल उत्तेजना प्रकाश को छानने के द्वारा प्रदान की जाती है। यह सभी उत्सर्जित प्रकाश की अनुमति देता है (हर उत्तेजना तरंगदैर्ध्य के लिए) डिटेक्टर21तक पहुँचने के लिए. इसके अतिरिक्त, इस तकनीक exogenous लेबल से autofluorence भेदभाव करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इसके अलावा, वृद्धि की डिटेक्टेबल सिग्नल के कारण अधिग्रहण समय को कम करने की क्षमता photobleaching के खतरे को कम कर देता है और साथ ही एक अधिग्रहण दर है कि वर्णक्रमीय वीडियो इमेजिंग के लिए स्वीकार्य है पर वर्णक्रमीय स्कैन की अनुमति देता है.
इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य उत्तेजना-स्कैनिंग hyperspectral इमेजिंग माइक्रोस्कोपी के लिए एक डेटा अधिग्रहण गाइड के रूप में सेवा करने के लिए है. इसके अतिरिक्त, वर्णन शामिल किए गए हैं जो प्रकाश पथ और हार्डवेयर को समझने में मदद करते हैं. यह भी वर्णित एक उत्तेजना स्कैनिंग hyperspectral इमेजिंग माइक्रोस्कोप के लिए खुला स्रोत सॉफ्टवेयर के कार्यान्वयन है. अंत में, विवरण कैसे एक NIST-ट्रेसकरनेयोग्य मानक करने के लिए प्रणाली जांचना, सटीक परिणाम के लिए सॉफ्टवेयर और हार्डवेयर सेटिंग्स को समायोजित करने के लिए प्रदान की जाती हैं, और अलग-अलग घटकों से योगदान में पता चला संकेत unmix.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:2119px;" width="2120">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Airway Smooth Muscle Cells</td>
			<td style="width:327px;">National Disease Research Interchange (NDRI)</td>
			<td style="width:360px;">Isolated from human lung tissues obtained from NDRI</td>
			<td style="width:1105px;">Highly autofluorescent, calcium sensitive cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Automated Shutter</td>
			<td style="width:327px;">Thorlabs Inc.</td>
			<td style="width:360px;">SHB1</td>
			<td>Remote-controllable shutter to minimize photobleaching</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Automated Stage</td>
			<td style="width:327px;">Prior Scientific</td>
			<td style="width:360px;">H177P1T4</td>
			<td>Remote-controllable stage for automated multiple field of view or stitched image collection.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Automated Stage Controller (XY)</td>
			<td style="width:327px;">Prior Scientific</td>
			<td style="width:360px;">Proscan III (H31XYZE-US)</td>
			<td>For interfacing automated stage with computer and joystick</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Buffer</td>
			<td style="width:327px;">Made in-house</td>
			<td style="width:360px;">Made in-house</td>
			<td>145 mM NaCl, 4 mM KCl, 20 mM HEPES, 10 mM D-glucose, 1 mM MgCl2, and 1mM CaCl2, at pH 7.3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Cell Chamber</td>
			<td style="width:327px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:360px;">Attofluor Cell Chamber, A7816</td>
			<td>Coverslip holder composed of surgical stainless steel and a rubber O-ring to seal in media and prevent sample and/or objective contamination</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Excitation Filters</td>
			<td style="width:327px;">Semrock Inc.</td>
			<td style="width:360px;">TBP01-378/16</td>
			<td>Center wavelength range (340-378 nm), Bandwidth (Minimum 16 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.88)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;"></td>
			<td style="width:327px;">Semrock Inc.</td>
			<td style="width:360px;">TBP01-402/16</td>
			<td>Center wavelength range (360-400 nm), Bandwidth (Minimum 16 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.8)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;"></td>
			<td style="width:327px;">Semrock Inc.</td>
			<td style="width:360px;">TBP01-449/15</td>
			<td>Center wavelength range (400-448.8 nm), Bandwidth (Minimum 15 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.8)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;"></td>
			<td style="width:327px;">Semrock Inc.</td>
			<td style="width:360px;">TBP01-501/15</td>
			<td>Center wavelength range (448.8-501.5 nm), Bandwidth (Minimum 15 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.84)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;"></td>
			<td style="width:327px;">Semrock Inc.</td>
			<td style="width:360px;">TBP01-561/14</td>
			<td>Center wavelength range (501.5-561 nm), Bandwidth (Minimum 14 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.83)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Fluorescence Filter Cube Dichroic Beamsplitter</td>
			<td style="width:327px;">Semrock Inc.</td>
			<td style="width:360px;">FF495-Di03</td>
			<td>Separates excitation and emission light at 495 nm (&#62;98% reflection between 350-488 nm, &#62;93% transmission between 502-950 nm), Filter effective index (1.78)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Fluorescence Filter Cube Longpass Filter</td>
			<td style="width:327px;">Semrock Inc.</td>
			<td style="width:360px;">FF01 496/LP-25</td>
			<td>Allows passage of light longer than 496 nm ( &#62;93% average transmission between 503.2-1100 nm), Refractive index (1.86)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">GCaMP Probe</td>
			<td style="width:327px;">Addgene</td>
			<td style="width:360px;">G-CaMP3; Plasmid #22692</td>
			<td>A single-wavelength GCaMP2-based genetically encoded calcium indicator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Integrating Sphere</td>
			<td style="width:327px;">Ocean Optics</td>
			<td style="width:360px;">FOIS-1</td>
			<td>Used for accurate measurement of wide-angle illumination</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Inverted Fluorescence Microscope</td>
			<td style="width:327px;">Nikon Instruments</td>
			<td style="width:360px;">TE2000</td>
			<td>Inverted microscopes allow direct excitation of sample without the need to penetrate layers of media and/or tissue.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Mitotracker Green FM</td>
			<td style="width:327px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:360px;">M7514</td>
			<td>Labels mitochondria</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">NIST-Traceable Calibration Lamp</td>
			<td style="width:327px;">Ocean Optics</td>
			<td style="width:360px;">LS-1-CAL-INT</td>
			<td>A lamp with a known spectrum for use as a standard</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">NIST-Traceable Fluorescein</td>
			<td style="width:327px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:360px;">F36915</td>
			<td>For verifying appropriate spectral response of the system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">NucBlue</td>
			<td style="width:327px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:360px;">R37605</td>
			<td>Labels cell nuclei</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Objective (10X)</td>
			<td style="width:327px;">Nikon Instruments</td>
			<td style="width:360px;">Plan Apo &#955; 10X/0.45 &#8734;/0.17 MRD00105</td>
			<td>Useful for large fields of view</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Objective (20X)</td>
			<td style="width:327px;">Nikon Instruments</td>
			<td style="width:360px;">Plan Apo &#955; 20X/0.75 &#8734;/0.17 MRD00205</td>
			<td>Most often used for tissue samples</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Objective (60X)</td>
			<td style="width:327px;">Nikon Instruments</td>
			<td>Plan Apo VC 60X/1.2 WI &#8734;/0.15-0.18 WD 0.27</td>
			<td>Most often used for cell samples</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">sCMOS Camera</td>
			<td style="width:327px;">Photometrics</td>
			<td style="width:360px;">Prime 95B (Rev A8-062802018)</td>
			<td>For acquiring high-sensitivity digital images</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Spectrometer</td>
			<td style="width:327px;">Ocean Optics</td>
			<td style="width:360px;">QE65000</td>
			<td>Used to measure spectral output of excitation-scanning spectral system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Tunable Filter Changer</td>
			<td style="width:327px;">Sutter Instrument</td>
			<td style="width:360px;">Lambda VF-5</td>
			<td>Motorized unit for automated excitation filter tuning/switching</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Xenon Arc Lamp</td>
			<td style="width:327px;">Sunoptic Technologies</td>
			<td style="width:360px;">Titan 300HP Lightsource</td>
			<td>Light source with relatively uniform spectral output</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

excitation-scanning hyperspectral imaging microscopy to efficiently discriminate fluorescence signals

कई तकनीकों की पहचान करने या घटना का अध्ययन करने के लिए या कार्यों को स्पष्ट करने के लिए फ्लोरोसेंट संकेतों का पता लगाने पर भरोसा करते हैं। इन फ्लोरोसेंट संकेतों का पृथक्करण हाइपरस्पेक्ट्रल इमेजिंग के आगमन तक बोझिल साबित हुआ, जिसमें फ्लोरोसेंट स्रोतों को एक दूसरे से अलग किया जा सकता है और साथ ही पृष्ठभूमि संकेतों और ऑटोफ्लोरेसीसेंस (अपने वर्णक्रमीय का ज्ञान दिया गया है) हस्ताक्षर)। हालांकि, पारंपरिक, उत्सर्जन स्कैनिंग हाइपरस्पेक्ट्रल इमेजिंग धीमी अधिग्रहण समय और कम संकेत-से-शोर अनुपात दोनों उत्तेजना और उत्सर्जन प्रकाश की आवश्यक फ़िल्टरिंग के कारण से ग्रस्त है। यह पहले से दिखाया गया है कि उत्तेजना स्कैनिंग hyperspectral इमेजिंग आवश्यक अधिग्रहण समय कम कर देता है, जबकि एक साथ प्राप्त डेटा के संकेत से शोर अनुपात में वृद्धि. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध उपकरणों का उपयोग करना, इस प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे इकट्ठा करने के लिए, जांचना, और एक ही नमूने में कई फ्लोरोसेंट स्रोतों से संकेतों की जुदाई के लिए एक उत्तेजना स्कैनिंग hyperspectral इमेजिंग माइक्रोस्कोपी प्रणाली का उपयोग करें. जबकि कोशिकाओं और ऊतकों के सूक्ष्म इमेजिंग के लिए अत्यधिक लागू है, इस तकनीक भी फ्लोरोसेंट का उपयोग प्रयोग के किसी भी प्रकार के लिए उपयोगी हो सकता है जिसमें यह उत्तेजना तरंगदैर्ध्य भिन्न करने के लिए संभव है, सहित, लेकिन तक सीमित नहीं: रासायनिक इमेजिंग, पर्यावरण अनुप्रयोगों, नेत्र देखभाल, खाद्य विज्ञान, फोरेंसिक विज्ञान, चिकित्सा विज्ञान, और खनिज विज्ञान.

इस प्रोटोकॉल से कई महत्वपूर्ण कदम डेटा है कि दोनों सटीक और इमेजिंग और वर्णक्रमीय कलाकृतियों से रहित है के संग्रह को सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक हैं. इन चरणों को छोड़ने के परिणामस्वरूप वह ?...

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Excitation-Scanning Hyperspectral Imaging Microscopy to Efficiently Discriminate Fluorescence Signals

एक्सक्पेंशन-स्कैनिंग हाइपरस्पेक्ट्रल इमेजिंग माइक्रोस्कोपी को कुशलता से फ्लुओरेंस सिग्नलों को भेदभाव करने के लिए

स्पेक्ट्रल इमेजिंग एक ही नमूने में कई फ्लोरोसेंट संकेतों की पहचान और जुदाई के लिए एक विश्वसनीय समाधान बन गया है और आसानी से पृष्ठभूमि या autofluorscence से ब्याज के संकेतों को अलग कर सकते हैं। उत्तेजना-स्कैनिंग हाइपरस्पेक्ट्रल इमेजिंग आवश्यक छवि अधिग्रहण समय को कम करके इस तकनीक पर सुधार करती है, जबकि साथ ही सिग्नल-टू-शोर अनुपात में वृद्धि करती है।

Several techniques rely on detection of fluorescence signals to identify or study phenomena or to elucidate functions. Separation of these fluorescence ...

यह प्रोटोकॉल महत्वपूर्ण है क्योंकि यह एक विधि का वर्णन करता है जिसका उपयोग एक ही नमूने में कई फ्लोरोसेंट संकेतों को अलग करने के लिए किया जा सकता है। पारंपरिक तरीकों की तुलना में, उत्तेजन-स्कैनिंग प्रयोग की गति को बढ़ा सकता है और डेटा की संवेदनशीलता में सुधार कर सकता है। एक सुपरकंपाइनम लेजर जैसे विभिन्न रोशनी स्रोतों का उपयोग करके, यह विधि कताई डिस्क या लेजर स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप सिस्टम पर लागू हो सकती है।उत्तेजन-स्कैनिंग, स्पेक्ट्रल इमेजिंग माइक्रोस्कोपी का प्रदर्शन करते समय, यह जांचना महत्वपूर्ण है कि प्रत्येक फ्लोरोसेंट लेबल का उत्तेजन शिखर एक अलग तरंगदैर्ध्य पर होता है। शुरू करने के लिए, पाठ प्रोटोकॉल में वर्णित एक उल्टे फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप और कैमरा स्थापित करें। इसके बाद सैंपल को स्टेज पर लोड करें।माइक्रोमैनेजर मुख्य खिड़की के ड्रॉप-डाउन मेनू से, प्रारंभिक नमूना देखने के लिए 475 नैनोमीटर का चयन करें। फिर एक्सपोजर के बगल में बॉक्स पर डबल-क्लिक करें और 100 मिलीसेकंड पर एक्सपोजर समय निर्धारित करने के लिए 100 दर्ज करें। अंत में, नमूना देखने के लिए लाइव पर क्लिक करें।अब ऑटो पर क्लिक करें। न्यूनतम और अधिकतम मानों को सार्थक, दृश्य पर्वतमाला में लाने के लिए स्वचालित तीव्रता देखने की सीमा बटन। इसके बाद, नमूने को केंद्रित करने के लिए माइक्रोस्कोप के फोकस घुंडी का उपयोग करें।एक बार ध्यान में रहने के बाद, नमूने की स्थिति को समायोजित करें ताकि यह बढ़त देखने के क्षेत्र के केंद्र में हो। फिर फोकस को फाइन ट्यून करें। नमूना ध्यान में है जब छवि में बढ़त सुविधाओं तेज दिखाई देते हैं ।अब, बहुआयामी अधिग्रहण उपकरण खोलें। मेनू में, लोड बटन पर क्लिक करें और स्पेक्ट्रल अधिग्रहण के लिए एक उपयुक्त तरंगदैर्ध्य सीमा वाली एक प्रीसेट सेटिंग चुनें। एक बार अधिग्रहण सेटिंग्स की पुष्टि हो जाने के बाद, नमूना के एक खाली क्षेत्र में जाएं और बाद में घटाव के लिए उपयोग करने के लिए पृष्ठभूमि और शोर युक्त एक स्पेक्ट्रल इमेज स्टैक इकट्ठा करने के लिए अधिग्रहण करें।फिर, प्रतिभाशाली क्षेत्रों को खोजने के लिए नमूने के बारे में आगे बढ़ें। नमूनों में नमूने के किनारे से अधिक तीव्र फ्लोरेसेंस होने की संभावना है। एक बार प्रतिभाशाली क्षेत्र स्थित है, एक ही छवि ढेर ले लो।अधिग्रहीत छवि को इमेज जे में लोड करें और इमेज जे के माप फ़ंक्शन का उपयोग इस बात की पुष्टि करने के लिए करें कि किसी भी तरंगदैर्ध्य में ओवरएक्सपोज किए गए पिक्सेल नहीं होते हैं। यदि ओवरएक्सपोजर के कारण कम एक्सपोजर समय आवश्यक है, तो पृष्ठभूमि छवि को एक नए एक्सपोजर समय के साथ फिर से लिया जाना चाहिए। यदि किसी भी चित्र में कैमरे की ऊपर की ओर डिटेक्शनल सीमा पाई गई, तो स्पेक्ट्रल स्कैन के एक्सपोजर समय को समायोजित करें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि पूरे स्पेक्ट्रल रेंज में अधिकतम सिग्नल कैमरे की गतिशील सीमा से अधिक नहीं है।अब निर्धारित एक उपयुक्त एक्सपोजर समय के साथ, मंच पर एक अवेलेबल नमूना रखें। यह निर्धारित करने के लिए अवेलेबल नमूने से स्पेक्ट्रल इमेज डेटा प्राप्त करें कि क्या कोई अंतर्निहित ऑटोफ्लोरेसेंस है। इसके बाद स्टेज पर सिंगल लेबल वाला सैंपल रखें।स्पेक्ट्रल लाइब्रेरी बनाने के लिए स्पेक्ट्रल नियंत्रण के रूप में उपयोग करने के लिए प्रत्येक एकल-लेबल नमूनों से स्पेक्ट्रल इमेज डेटा प्राप्त करें। एक समान तरंगदैर्ध्य रेंज एक्सपोजर समय और कैमरा सेटिंग्स का उपयोग करके प्रत्येक नियंत्रण नमूने के लिए स्कैन करें। इसके बाद माइक्रोस्कोप पर प्रायोगिक नमूने वाली स्लाइड रखें।एक दृश्य का क्षेत्र चुनें जिसने कोशिकाओं को उचित रूप से लेबल किया है और निर्धारित अधिग्रहण सेटिंग्स का उपयोग करके नमूने से स्पेक्ट्रल इमेज डेटा प्राप्त करें। नमूना छवि से पृष्ठभूमि स्पेक्ट्रम को घटाकर और सुधार गुणांक द्वारा छवि को गुणा करके एक फ्लैट स्पेक्ट्रल प्रतिक्रिया के लिए छवियों को सही करें। यहां, छवियों को जल्दी से संसाधित करने के लिए एक मैटलैब स्क्रिप्ट का उपयोग किया जाता है।इसके बाद, स्पेक्ट्रल लाइब्रेरी जेनरेट करें। सर्वोत्तम परिणामों के लिए, प्रत्येक अंतिम सदस्य को सबसे बड़ी तीव्रता के तरंगदैर्ध्य बैंड को सामान्य करें, यह निर्धारित करके कि तरंगदैर्ध्य बैंड का सबसे तीव्र मूल्य है और प्रत्येक तरंगदैर्ध्य बैंड पर माप को उस अधिकतम मूल्य द्वारा विभाजित करता है। इसके बाद स्पेक्ट्रल डाटा को डैट फाइल के रूप में सेव करें।पूरा होने पर, स्पेक्ट्रल इमेज डेटा को अनमिक्स करें। अनमिक्सिंग चरण प्रत्येक फ्लोरोसेंट लेबल के लिए एक बहुतायत छवि उत्पन्न करेगा, जहां बहुतायत संभावित लेबल से छवि में सापेक्ष फ्लोरोसेंट सिग्नल की मात्रा है। इसके बाद, शुद्ध घटकों के वितरण का नेत्रहीन निरीक्षण करने के लिए प्रत्येक अनमिक्स छवि खोलें।त्रुटि छवि के परिमाण की तुलना अमिशक्स छवियों से करें। यदि त्रुटि छवि का परिमाण अमिश्रित बहुतायत छवियों के समान है, तो स्पेक्ट्रल इमेज डेटा में संकेतों का सही हिसाब नहीं दिया जा सकता है। अंत में, जांचें कि त्रुटि छवि की तुलना अनमिक्स किए गए छवियों से करके कोई अज्ञात अवशिष्ट संरचनाएं नहीं हैं।जब सही ढंग से प्रदर्शन किया जाता है, तो स्पेक्ट्रल अनमिक्सिंग प्रक्रिया प्रत्येक फ्लोरेसेंस लेबल से संबंधित योगदान में एक स्पेक्ट्रल इमेज स्टैक को अलग करने की अनुमति देती है। यहां, एक अनमिक्स्ड स्पेक्ट्रल इमेज सेट की गई है जिसमें वायुमार्ग चिकनी मांसपेशी सेल ऑटोफ्लोरेसेंस, एक जीसीएएमपी जांच और एक माइटोकॉन्ड्रियल लेबल को हाइलाइट किया गया है। कोशिकाओं के परमाणु और परिवासी परमाणु क्षेत्रों से जुड़ी उच्च त्रुटि है जो यह दर्शाती है कि उन क्षेत्रों के मापा गया स्पेक्ट्रा स्पेक्ट्रा पुस्तकालय में स्पेक्ट्रा द्वारा अच्छी तरह से जिम्मेदार नहीं है।लेबल कोशिकाओं से एकत्र किए गए शुद्ध स्पेक्ट्रा जो ऑटोफ्लोरेटेंट भी हैं, शुद्ध घटक के लिए स्पेक्ट्रल प्रोफाइल को दूषित कर देंगे। यहां, कोई भी ऑटोफ्लोरेसेंस से दूषित शुद्ध स्पेक्ट्रा के साथ अनमिक्सिंग का अंतर देख सकता है, बनाम स्केल्ड घटाव के बाद सही शुद्ध स्पेक्ट्रा। संवेदनशील नमूनों की इमेजिंग करते समय उचित डेटा अधिग्रहण आवश्यक है क्योंकि वे केवल पृष्ठभूमि और नियंत्रणों के विपरीत एक इमेजिंग सत्र से बच सकते हैं जिसे फिर से कल्पना की जा सकती है।सुनिश्चित करें कि उचित हार्डवेयर और अधिग्रहण सेटिंग्स जितना संभव हो पूर्व निर्धारित कर रहे हैं। अगले चरण के रूप में, इस प्रणाली का उपयोग करके अधिग्रहीत समय-चूक डेटा से बनाए गए वीडियो का उपयोग समय के साथ विचारशील स्थानों में फ्लोरोसेंट स्रोतों को ट्रैक करने के लिए किया जा सकता है जैसे कि दूसरा मैसेंजर सिग्नल स्थानीयकरण। आंखों के संपर्क से बचने के लिए शक्तिशाली प्रकाश स्रोतों का उपयोग करते समय ध्यान रखें।इसके अलावा, जैविक लेबल को संभालते समय उचित दस्ताने पहनना सुनिश्चित करें।

Research

JoVE Journal

Engineering

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