Name: excitation-scanning hyperspectral imaging microscopy to efficiently discriminate fluorescence signals
Uploaded: 2019-08-22T12:30:00
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著者らは、NSF 1725937、NIH P01HL066299、NIH R01HL058506、NIH S10OD020149、NIH UL1 TR001417、NIH R01HL137030、AHA 18PRE3400060000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000ドル、研究基金からの支援を認め、NIH R01HL066299、NIH R01HL058506、NIH S10OD020149、NIH UL1 TR001417

1. デバイスのセットアップ
<ol><li>光源:高出力と高コリメーションを備えた広帯域スペクトル光源を選択します(これらの研究には300 W Xeアークランプを使用しました)。</li>
	<li>シャッター(オプション):タイムラプスイメージング用の光漂白を減らすために、光学パスにシャッターを追加します。</li>
	<li>調整可能なフィルタシステム:機械的チューニングアセンブリと薄膜調整フィルタ(TFTF)セ?...

励起スキャンハイパースペクトルイメージングセットアップの最適な使用は、光路の構築から始まります。特に、光源、フィルタ(tableおよびdichroic)、フィルタ切り替え方法、およびカメラの選択は、利用可能なスペクトル範囲、可能なスキャン速度、検出器感度、および空間サンプリングを決定する。水銀アークランプは、多くの励起波長ピークを提供しますが、フラットなスペクトル出力?...

スペクトルイメージングは、様々な方法で行われ、いくつかの用語1、2、3、4によって参照される。一般に、スペクトルイメージングとは、少なくとも2つの空間次元と1つのスペクトル次元で取得されたデータをいう。マルチスペクトルおよびハイパースペクトルイメージングは、ほとんどの場合、波長帯の数またはスペクトルバンドが連続して1であるかどうかによって区別されます。このアプリケーションでは、ハイパースペクトルデータは、励起に使用される各バンドパスフィルタの半分の最大(FWHM)で全幅の半分以下の中心波長の間隔によって達成される連続した波長帯で取得されたスペクトルデータとして定義されます(すなわち、5 nm)14-20 nmの帯域幅を持つバンドパスフィルタのための中心波長間隔)。データ バンドの性質が連続しているので、データセットのオーバーサンプリングが可能で、スペクトル ドメインのサンプリング時にナイキストの基準が満たされます。
ハイパースペクトルイメージングは、1970年代と1980年代にNASAによって最初のランドサット衛星5、6と共に開発されました。複数の連続したスペクトルバンドからデータを収集すると、各ピクセルの輝度スペクトルの生成が可能になります。個々の成分の輝度スペクトルを特定して定義することで、その特性スペクトルによって表面材料を検出するだけでなく、信号の変動などの介在信号の除去も可能になりました。大気条件。その特性スペクトルを用いた物質検出の概念は、Shröckらが5つの異なる蛍光体と既知のスペクトルの組み合わせを使用して、呼ばれるプロセスで標識染色体を区別するために1996年に生物学的システムに適用されました。スペクトルカリオタイピング7.この技術は、2000年に鶴井らによって組織サンプルの蛍光イメージングのために、7つの蛍光色素と特異値分解を用いて、各ピクセルのスペクトル分離を参照のスペクトルの線形組み合わせに達成するために精緻化された。図書館8.彼らのリモートセンシング対応と同様に、各既知の蛍光体の寄与度は、各蛍光体のスペクトルの先行情報を与えられたハイパースペクトル画像から計算することができる。
ハイパースペクトルイメージングは、農業9、天文学10、生物医学11、化学イメージング12、環境応用13、アイケア14、食品科学15の分野でも使用されています。法医学16,17, 医学18, 鉱物学19, および監視20.現在の蛍光顕微鏡ハイパースペクトルイメージングシステムの主な制限は、標準的なハイパースペクトルイメージング技術が1)最初に励起光を濾過してサンプル励起を制御し、次に狭いバンドで蛍光信号を単離するということです。2)さらに、発光した光をフィルタリングして、蛍光発光を後で数学的に分離できる狭いバンドに分離する21。励起照明と放出蛍光の両方をフィルタリングすると、使用可能な信号の量が減少し、信号対雑音比が低下し、取得時間が長くなります。信号が小さくなり、取得時間が長いため、診断ツールとしてのハイパースペクトルイメージングの適用性が制限されます。
ハイパースペクトルイメージングを利用するが、利用可能な信号を高め、それによって必要な集録時間21、22を減らすイメージ投射様式が開発された。この新しいモダリティは、励起走査熱ハイパースペクトルイメージングと呼ばれ、励起波長を変化させ、広範囲の放射光を収集することにより、スペクトル画像データを取得します。この技術は、発光走査技術21、22と比較して、信号対雑音比の桁増加の桁数が増加することが以前に示されている。信号対雑音比の増加は、検出された発光の広帯域パス(約600nm)によるもので、特異性は蛍光発光の代わりに励起光のみをフィルタリングすることによって提供されます。これにより、すべての放出された光(すべての励起波長)が検出器21に到達することができます。さらに、この技術は、外因性標識から自己蛍光を区別するために使用することができる。さらに、検出可能な信号の増加による集録時間を短縮できるため、光漂白の危険性が低減され、スペクトルビデオイメージングに許容される集録速度でスペクトルスキャンが可能になります。
このプロトコルの目的は、励起スキャンハイパースペクトルイメージング顕微鏡のデータ集録ガイドとして機能することです。さらに、ライト パスとハードウェアを理解するのに役立つ説明が含まれています。また、励起走査熱ハイパースペクトルイメージング顕微鏡用のオープンソースソフトウェアの実装についても説明する。最後に、NISTトレーサブル標準にシステムを校正し、正確な結果を出すためにソフトウェアとハードウェアの設定を調整し、検出された信号を個々のコンポーネントからの寄与にミックス解除する方法について説明します。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:2119px;" width="2120">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Airway Smooth Muscle Cells</td>
			<td style="width:327px;">National Disease Research Interchange (NDRI)</td>
			<td style="width:360px;">Isolated from human lung tissues obtained from NDRI</td>
			<td style="width:1105px;">Highly autofluorescent, calcium sensitive cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Automated Shutter</td>
			<td style="width:327px;">Thorlabs Inc.</td>
			<td style="width:360px;">SHB1</td>
			<td>Remote-controllable shutter to minimize photobleaching</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Automated Stage</td>
			<td style="width:327px;">Prior Scientific</td>
			<td style="width:360px;">H177P1T4</td>
			<td>Remote-controllable stage for automated multiple field of view or stitched image collection.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Automated Stage Controller (XY)</td>
			<td style="width:327px;">Prior Scientific</td>
			<td style="width:360px;">Proscan III (H31XYZE-US)</td>
			<td>For interfacing automated stage with computer and joystick</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Buffer</td>
			<td style="width:327px;">Made in-house</td>
			<td style="width:360px;">Made in-house</td>
			<td>145 mM NaCl, 4 mM KCl, 20 mM HEPES, 10 mM D-glucose, 1 mM MgCl2, and 1mM CaCl2, at pH 7.3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Cell Chamber</td>
			<td style="width:327px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:360px;">Attofluor Cell Chamber, A7816</td>
			<td>Coverslip holder composed of surgical stainless steel and a rubber O-ring to seal in media and prevent sample and/or objective contamination</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Excitation Filters</td>
			<td style="width:327px;">Semrock Inc.</td>
			<td style="width:360px;">TBP01-378/16</td>
			<td>Center wavelength range (340-378 nm), Bandwidth (Minimum 16 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.88)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;"></td>
			<td style="width:327px;">Semrock Inc.</td>
			<td style="width:360px;">TBP01-402/16</td>
			<td>Center wavelength range (360-400 nm), Bandwidth (Minimum 16 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.8)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;"></td>
			<td style="width:327px;">Semrock Inc.</td>
			<td style="width:360px;">TBP01-449/15</td>
			<td>Center wavelength range (400-448.8 nm), Bandwidth (Minimum 15 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.8)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;"></td>
			<td style="width:327px;">Semrock Inc.</td>
			<td style="width:360px;">TBP01-501/15</td>
			<td>Center wavelength range (448.8-501.5 nm), Bandwidth (Minimum 15 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.84)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;"></td>
			<td style="width:327px;">Semrock Inc.</td>
			<td style="width:360px;">TBP01-561/14</td>
			<td>Center wavelength range (501.5-561 nm), Bandwidth (Minimum 14 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.83)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Fluorescence Filter Cube Dichroic Beamsplitter</td>
			<td style="width:327px;">Semrock Inc.</td>
			<td style="width:360px;">FF495-Di03</td>
			<td>Separates excitation and emission light at 495 nm (&#62;98% reflection between 350-488 nm, &#62;93% transmission between 502-950 nm), Filter effective index (1.78)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Fluorescence Filter Cube Longpass Filter</td>
			<td style="width:327px;">Semrock Inc.</td>
			<td style="width:360px;">FF01 496/LP-25</td>
			<td>Allows passage of light longer than 496 nm ( &#62;93% average transmission between 503.2-1100 nm), Refractive index (1.86)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">GCaMP Probe</td>
			<td style="width:327px;">Addgene</td>
			<td style="width:360px;">G-CaMP3; Plasmid #22692</td>
			<td>A single-wavelength GCaMP2-based genetically encoded calcium indicator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Integrating Sphere</td>
			<td style="width:327px;">Ocean Optics</td>
			<td style="width:360px;">FOIS-1</td>
			<td>Used for accurate measurement of wide-angle illumination</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Inverted Fluorescence Microscope</td>
			<td style="width:327px;">Nikon Instruments</td>
			<td style="width:360px;">TE2000</td>
			<td>Inverted microscopes allow direct excitation of sample without the need to penetrate layers of media and/or tissue.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Mitotracker Green FM</td>
			<td style="width:327px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:360px;">M7514</td>
			<td>Labels mitochondria</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">NIST-Traceable Calibration Lamp</td>
			<td style="width:327px;">Ocean Optics</td>
			<td style="width:360px;">LS-1-CAL-INT</td>
			<td>A lamp with a known spectrum for use as a standard</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">NIST-Traceable Fluorescein</td>
			<td style="width:327px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:360px;">F36915</td>
			<td>For verifying appropriate spectral response of the system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">NucBlue</td>
			<td style="width:327px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:360px;">R37605</td>
			<td>Labels cell nuclei</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Objective (10X)</td>
			<td style="width:327px;">Nikon Instruments</td>
			<td style="width:360px;">Plan Apo &#955; 10X/0.45 &#8734;/0.17 MRD00105</td>
			<td>Useful for large fields of view</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Objective (20X)</td>
			<td style="width:327px;">Nikon Instruments</td>
			<td style="width:360px;">Plan Apo &#955; 20X/0.75 &#8734;/0.17 MRD00205</td>
			<td>Most often used for tissue samples</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Objective (60X)</td>
			<td style="width:327px;">Nikon Instruments</td>
			<td>Plan Apo VC 60X/1.2 WI &#8734;/0.15-0.18 WD 0.27</td>
			<td>Most often used for cell samples</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">sCMOS Camera</td>
			<td style="width:327px;">Photometrics</td>
			<td style="width:360px;">Prime 95B (Rev A8-062802018)</td>
			<td>For acquiring high-sensitivity digital images</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Spectrometer</td>
			<td style="width:327px;">Ocean Optics</td>
			<td style="width:360px;">QE65000</td>
			<td>Used to measure spectral output of excitation-scanning spectral system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Tunable Filter Changer</td>
			<td style="width:327px;">Sutter Instrument</td>
			<td style="width:360px;">Lambda VF-5</td>
			<td>Motorized unit for automated excitation filter tuning/switching</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Xenon Arc Lamp</td>
			<td style="width:327px;">Sunoptic Technologies</td>
			<td style="width:360px;">Titan 300HP Lightsource</td>
			<td>Light source with relatively uniform spectral output</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

excitation-scanning hyperspectral imaging microscopy to efficiently discriminate fluorescence signals

いくつかの技術は、蛍光信号の検出に依存して現象を同定または研究したり、機能を解明したりします。これらの蛍光シグナルの分離は、蛍光源が互いに分離できるハイパースペクトルイメージングの出現まで、また背景信号と自己蛍光(スペクトルの知識を与えられた)から分離することができるまで、煩わしいことが証明された。署名)。しかし、従来の発光スキャンハイパースペクトルイメージングは、励起光と発光光の両方のフィルタリングが必要なため、取得時間が遅く、信号対雑音比が低くなります。励起スキャンハイパースペクトルイメージングは、取得したデータの信号対雑音比を同時に増加させながら、必要な集録時間を短縮することが以前に示されています。市販の装置を使用して、このプロトコルは、単一のサンプル内の複数の蛍光源からの信号を分離するための励起走査熱ハイパースペクトルイメージング顕微鏡システムを組み立て、校正し、使用する方法を説明します。細胞や組織の顕微鏡イメージングに非常に適用可能であるが、この技術は、化学イメージングを含むがこれらに限定されない励起波長を変化させ可能である蛍光を利用したあらゆるタイプの実験にも有用であり、化学イメージング、環境応用、アイケア、食品科学、法医学、鉱物学

このプロトコルからいくつかの重要な手順は、イメージングとスペクトルアーティファクトの正確さと欠如の両方のデータの収集を確保するために必要です。これらの手順をスキップすると、重要に見えるが、他のスペクトルイメージングシステムでは検証または再現できないデータが生成され、その結果、そのデータで行われた結論が事実上無効になります。これ?...

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Excitation-Scanning Hyperspectral Imaging Microscopy to Efficiently Discriminate Fluorescence Signals

蛍光信号を効率的に判別する励起走査察ハイパースペクトルイメージング顕微鏡

スペクトルイメージングは、単一のサンプルで複数の蛍光信号を同定および分離するための信頼性の高いソリューションとなり、目的の信号と背景または自己蛍光を容易に区別できます。励起スキャンハイパースペクトルイメージングは、信号対雑音比を同時に増加させながら、必要な画像集録時間を短縮することで、この技術を向上させます。

Several techniques rely on detection of fluorescence signals to identify or study phenomena or to elucidate functions. Separation of these fluorescence ...

このプロトコルは、1つのサンプルで複数の蛍光シグナルを分離するために使用できる方法を記述しているので重要です。従来の方法と比較して、励起スキャンは実験の速度を上げ、データの感度を向上させることができます。スーパーコンティニュムレーザーなどの異なる照明源を使用することにより、この方法は、回転ディスクまたはレーザー走査型共焦点顕微鏡システムに適用できる可能性があります。励起走査を行う場合、分光イメージング顕微鏡は、各蛍光標識の励起ピークが異なる波長で発生することを確認することが重要である。まず、テキストプロトコルに記載されているように、反転蛍光顕微鏡とカメラを設置します。その後、ステージ上でサンプルをロードします。マイクロマネージャーメインウィンドウのドロップダウンメニューから、最初のサンプル表示用に475ナノメートルを選択します。次に、露出の横にあるボックスをダブルクリックし、「100」と入力して、露出時間を 100 ミリ秒に設定します。最後に、[ライブ] をクリックしてサンプルを表示します。今すぐ[自動]をクリックします。最小および最大値を意味のある視覚的な範囲に持ち込むための自動強度表示範囲ボタン。次に、顕微鏡のフォーカスノブを使用してサンプルをフォーカスします。フォーカスが入ったら、サンプルの位置を調整して、視野の中央にエッジが表示されるようにします。次に、フォーカスを微調整します。イメージ内のエッジ フィーチャがシャープに見えるとき、サンプルはフォーカスされます。次に、多次元取得ツールを開きます。メニューで、ロードボタンをクリックし、スペクトル取得に適した波長範囲を含むプリセット設定を選択します。取得設定が確認されたら、サンプルの空白の領域に移動し、取得をクリックして、後で減算に使用する背景とノイズを含むスペクトル画像スタックを収集します。次に、サンプルを動かして最も明るい領域を見つけます。サンプルは、サンプルの端から離れてより強い蛍光を持っている可能性があります。最も明るい領域が見つかったら、単一の画像スタックを取ります。取得した画像をイメージJにロードし、画像Jの測定機能を使用して、露光過多のピクセルを含む波長がないことを確認します。露出過多のために露出時間を短縮する必要がある場合は、背景画像も新しい露光時間で再撮影する必要があります。いずれかの画像にカメラの上方検出限界が含まれていることが判明した場合は、スペクトルスキャンの露光時間を調整して、スペクトル範囲全体の最大信号がカメラのダイナミックレンジを超えないようにします。適切な露光時間が決定された時点で、ラベルなしサンプルをステージに配置します。ラベルなしのサンプルからスペクトル画像データを取得し、基礎となる自己蛍光が存在するかどうかを判断します。次に、単一ラベルのサンプルをステージに配置します。スペクトル ライブラリを構築するためのスペクトル コントロールとして使用する、単一ラベルの各サンプルからスペクトル 画像データを取得します。同一の波長範囲露光時間とカメラ設定を使用して、各制御サンプルのスキャンを実行します。次に、実験試料を含むスライドを顕微鏡に置く。適切にラベル付けされたセルを持つ視野を選択し、決定された取得設定を使用してサンプルからスペクトル画像データを取得します。サンプル画像から背景スペクトルを引き、補正係数を掛けて画像を平らなスペクトル応答に補正します。ここでは、MATLAB スクリプトを使用して、画像を迅速に処理します。次に、スペクトルライブラリを生成します。最良の結果を得るには、どの波長バンドが最も強い値を持つかを決定し、各波長帯域の測定値をその最大値で割ることによって、各端部材を最大強度の波長帯域に正規化します。次に、スペクトルデータを dat ファイルとして保存します。完了したら、スペクトル画像データのミックスを解除します。アンミックスステップは、各蛍光標識に対して豊富な画像を生成し、その存在量は、見込みラベルからの画像中の相対的な蛍光シグナルの量である。次に、各未混合画像を開いて、純粋な成分の分布を視覚的に検査します。エラー画像の大きさを、混合されていない画像の大きさと比較します。誤差画像の大きさが混ざり合っていない画像と類似している場合、スペクトル画像データ内の信号が正確に考慮されないことがあります。最後に、未混合画像とエラー画像を比較して、未確認の残存構造がないことを確認します。正しく実行すると、スペクトル非混合プロセスにより、スペクトル画像スタックを各蛍光ラベルからのそれぞれの寄与に分離することができます。ここで、気道平滑筋細胞自家蛍光を強調する個々の画像を用いて設定された未混合スペクトル画像、GCaMPプローブおよびミトコンドリア標識を示す。スペクトルライブラリ内のスペクトルによって測定されたスペクトルが十分に考慮されないことを示す細胞の核および核周領域に関連する高い誤差がある。また、自己蛍光である標識細胞から収集された純粋なスペクトルは、純粋成分のスペクトルプロファイルを汚染する可能性があります。ここで、自己蛍光で汚染された純粋なスペクトルと、スケール減算後の補正された純スペクトルとの混合解除の違いを見ることができる。適切なデータ取得は、バックグラウンドや再イメージ化される可能性のあるコントロールとは異なり、1回のイメージングセッションしか生き残ることもできないので、機密サンプルをイメージングする際に不可欠です。ハードウェアと取得の適切な設定が、可能な限り事前に決められていることを確認します。次のステップとして、このシステムを使用して取得したタイムラプスデータから作成されたビデオを使用して、第2のメッセンジャー信号局在化などの時間の経過とともに控えめな場所で蛍光源を追跡することができます。強力な光源を使用して目の露出を避けるには注意してください。また、生物学的ラベルを取り扱う際には、必ず適切な手袋を着用してください。

Research

JoVE Journal

Engineering

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