Name: excitation-scanning hyperspectral imaging microscopy to efficiently discriminate fluorescence signals
Uploaded: 2019-08-22T12:30:00
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Os autores gostariam de reconhecer o apoio da NSF 1725937, NIH P01HL066299, NIH R01HL058506, NIH S10OD020149, NIH UL1 TR001417, NIH R01HL137030, AHA 18PRE34060163, e o fundo de pesquisa de câncer de Abraham Mitchell.

1. dispositivo de set-up
<ol><li>Fonte luminosa: selecione uma fonte luminosa espectral da largo-faixa com saída de poder superior e colimação elevada (uma lâmpada de arco de 300 W xe foi usada para estes estudos).</li>
	<li>Obturador (opcional): Adicione um obturador ao caminho óptico para reduzir o fotobranqueamento para imagens de lapso de tempo.</li>
	<li>Sistema ajustável do filtro: incorpore um conjunto de ajustamento mecânico e um filtro sintonizável da fino-película (TFTF) ajustado para permitir a esca...

O uso ideal de uma configuração de imagem hiperespectral de excitação-digitalização começa com a construção do caminho de luz. Em particular, a escolha da fonte luminosa, dos filtros (ajustáveis e dichroic), do método do interruptor do filtro, e da câmera determina a escala espectral disponível, a velocidade possível da varredura, a sensibilidade do detector, e a amostragem espacial. As lâmpadas de arco de mercúrio oferecem muitos picos de comprimento de onda de excitação, mas não fornecem uma saída e...

A imagem latente espectral pode ser executada em uma variedade de maneiras e é referida por diversos termos1,2,3,4. Em geral, a imagem espectral refere-se aos dados adquiridos em pelo menos duas dimensões espaciais e uma dimensão espectral. A imagem latente Multispectral e hiperespectrais é distinguida o mais frequentemente pelo número de faixas do comprimento de onda ou se as faixas espectrais são contíguas1. Para esta aplicação, os dados hiperespectrais são definidos como os dados espectrais adquiridos com as faixas contíguas do comprimento de onda conseguidas pelo afastamento de comprimentos de onda Center não menos do que a metade da largura cheia no meio máximo (FWHM) de cada filtro do bandpass usado para a excitação (isto é, 5 nanômetro espaçamento de comprimento de onda Center para filtros de banda com larguras de banda 14-20 nm). A natureza contígua das bandas de dados permite um excesso de amostragem do conjunto, assegurando que os critérios de Nyquist são satisfeitos ao amostrando o domínio espectral.
A imagem latente Hyperspectral foi desenvolvida por NASA nos 1970s e nos 1980s conjuntamente com o primeiro satélite Landsat5,6. A coleta de dados de várias bandas espectrais contíguas permitiu a geração de um espectro de radiância de cada pixel. Identificar e definir o espectro de radiância de componentes individuais permitiu não só detectar materiais de superfície por seus espectros característicos, mas também permitiu a remoção de sinais intervenientes, como variações no sinal devido à condições atmosféricas. O conceito de detecção de materiais utilizando seus espectros característicos foi aplicado em sistemas biológicos em 1996 quando Schröck et al. utilizaram combinações de cinco diferentes fluoróforos e seus espectros conhecidos para distinguir os cromossomas rotulados em um processo denominado Karyotyping espectral7. Esta técnica foi elaborada em 2000 por Tsurui et al. para a imagem latente da fluorescência de amostras do tecido, usando sete tinturas fluorescentes e a decomposição singular do valor para conseguir a separação espectral de cada pixel em combinações lineares dos espectros na referência na biblioteca8. Semelhante a seus homólogos de sensoriamento remoto, a contribuição de cada fluoróforo conhecido pode ser calculada a partir da imagem hiperespectral, dada a priori informações do espectro de cada fluoróforo.
A imagem latente de Hyperspectral foi usada igualmente nas áreas daagricultura 9,astronomia 10, biomedicina11, imagem latente química12, aplicações ambientais13, cuidado14do olho, ciência de alimento15, ciência forense16,17, ciência médica18, mineralogia19e vigilância20. Uma limitação chave de sistemas de imagem latente hiperespectrais do microscópio de fluorescência atual é que a tecnologia de imagem latente hiperespectrais padrão isola sinais da fluorescência em bandas estreitas por 1) primeiramente filtrando a luz da excitação para controlar a excitação da amostra, a seguir 2) mais adicional que filtra a luz emitida para separar a emissão da fluorescência em faixas estreitas que podem mais tarde ser separadas matematicamente21. Filtrar a iluminação da excitação e a fluorescência emitida reduzem a quantidade de sinal disponível, que abaixa a relação sinal-à-ruído e necessita tempos de aquisição longos. O sinal baixo e os tempos longos da aquisição limitam a aplicabilidade da imagem latente hiperespectrais como uma ferramenta diagnóstica.
Uma modalidade da imagem latente foi desenvolvida que empreuse da imagem latente hiperespectrais mas impulsiona o sinal disponível, reduzindo desse modo o tempo necessário da aquisição21,22. Esta modalidade nova, chamada imagem latente hiperespectrais da excitação-exploração, adquire dados espectrais da imagem variando o comprimento de onda da excitação e coletando uma escala larga da luz emitida. Tem sido demonstrado anteriormente que esta técnica produz aumentos de ordem de magnitude na relação sinal/ruído em comparação com as técnicas de digitalização de emissões21,22. O aumento na relação sinal-ruído é em grande parte devido ao bandpass largo (~ 600 nanômetro) da luz de emissão detectada, quando a especificidade for fornecida filtrando somente a luz da excitação em vez da emissão da fluorescência. Isto permite que toda a luz emitida (para cada comprimento de onda da excitação) alcangue o detetor21. Adicionalmente, esta técnica pode ser usada para discriminar a autofluorescência de rótulos exógenos. Além disso, a capacidade de reduzir o tempo de aquisição devido ao aumento do sinal detectável reduz o perigo de fotobranqueamento, bem como permite varreduras espectrais a uma taxa de aquisição que é aceitável para imagens de vídeo espectral.
O objetivo deste protocolo é servir como um guia de aquisição de dados para a microscopia de imagem hiperespectral de varredura de excitação. Além disso, as descrições são incluídas que ajudam a entender o caminho de luz e hardware. Também é descrita a implementação de software de código aberto para um microscópio de imagem hiperespectral de varredura de excitação. Por fim, são fornecidas descrições sobre como calibrar o sistema para um padrão rastreável pelo NIST, ajustar as configurações de software e hardware para obter resultados precisos e desmisturar o sinal detectado em contribuições de componentes individuais.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:2119px;" width="2120">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Airway Smooth Muscle Cells</td>
			<td style="width:327px;">National Disease Research Interchange (NDRI)</td>
			<td style="width:360px;">Isolated from human lung tissues obtained from NDRI</td>
			<td style="width:1105px;">Highly autofluorescent, calcium sensitive cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Automated Shutter</td>
			<td style="width:327px;">Thorlabs Inc.</td>
			<td style="width:360px;">SHB1</td>
			<td>Remote-controllable shutter to minimize photobleaching</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Automated Stage</td>
			<td style="width:327px;">Prior Scientific</td>
			<td style="width:360px;">H177P1T4</td>
			<td>Remote-controllable stage for automated multiple field of view or stitched image collection.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Automated Stage Controller (XY)</td>
			<td style="width:327px;">Prior Scientific</td>
			<td style="width:360px;">Proscan III (H31XYZE-US)</td>
			<td>For interfacing automated stage with computer and joystick</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Buffer</td>
			<td style="width:327px;">Made in-house</td>
			<td style="width:360px;">Made in-house</td>
			<td>145 mM NaCl, 4 mM KCl, 20 mM HEPES, 10 mM D-glucose, 1 mM MgCl2, and 1mM CaCl2, at pH 7.3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Cell Chamber</td>
			<td style="width:327px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:360px;">Attofluor Cell Chamber, A7816</td>
			<td>Coverslip holder composed of surgical stainless steel and a rubber O-ring to seal in media and prevent sample and/or objective contamination</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Excitation Filters</td>
			<td style="width:327px;">Semrock Inc.</td>
			<td style="width:360px;">TBP01-378/16</td>
			<td>Center wavelength range (340-378 nm), Bandwidth (Minimum 16 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.88)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;"></td>
			<td style="width:327px;">Semrock Inc.</td>
			<td style="width:360px;">TBP01-402/16</td>
			<td>Center wavelength range (360-400 nm), Bandwidth (Minimum 16 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.8)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;"></td>
			<td style="width:327px;">Semrock Inc.</td>
			<td style="width:360px;">TBP01-449/15</td>
			<td>Center wavelength range (400-448.8 nm), Bandwidth (Minimum 15 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.8)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;"></td>
			<td style="width:327px;">Semrock Inc.</td>
			<td style="width:360px;">TBP01-501/15</td>
			<td>Center wavelength range (448.8-501.5 nm), Bandwidth (Minimum 15 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.84)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;"></td>
			<td style="width:327px;">Semrock Inc.</td>
			<td style="width:360px;">TBP01-561/14</td>
			<td>Center wavelength range (501.5-561 nm), Bandwidth (Minimum 14 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.83)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Fluorescence Filter Cube Dichroic Beamsplitter</td>
			<td style="width:327px;">Semrock Inc.</td>
			<td style="width:360px;">FF495-Di03</td>
			<td>Separates excitation and emission light at 495 nm (&#62;98% reflection between 350-488 nm, &#62;93% transmission between 502-950 nm), Filter effective index (1.78)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Fluorescence Filter Cube Longpass Filter</td>
			<td style="width:327px;">Semrock Inc.</td>
			<td style="width:360px;">FF01 496/LP-25</td>
			<td>Allows passage of light longer than 496 nm ( &#62;93% average transmission between 503.2-1100 nm), Refractive index (1.86)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">GCaMP Probe</td>
			<td style="width:327px;">Addgene</td>
			<td style="width:360px;">G-CaMP3; Plasmid #22692</td>
			<td>A single-wavelength GCaMP2-based genetically encoded calcium indicator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Integrating Sphere</td>
			<td style="width:327px;">Ocean Optics</td>
			<td style="width:360px;">FOIS-1</td>
			<td>Used for accurate measurement of wide-angle illumination</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Inverted Fluorescence Microscope</td>
			<td style="width:327px;">Nikon Instruments</td>
			<td style="width:360px;">TE2000</td>
			<td>Inverted microscopes allow direct excitation of sample without the need to penetrate layers of media and/or tissue.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Mitotracker Green FM</td>
			<td style="width:327px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:360px;">M7514</td>
			<td>Labels mitochondria</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">NIST-Traceable Calibration Lamp</td>
			<td style="width:327px;">Ocean Optics</td>
			<td style="width:360px;">LS-1-CAL-INT</td>
			<td>A lamp with a known spectrum for use as a standard</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">NIST-Traceable Fluorescein</td>
			<td style="width:327px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:360px;">F36915</td>
			<td>For verifying appropriate spectral response of the system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">NucBlue</td>
			<td style="width:327px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:360px;">R37605</td>
			<td>Labels cell nuclei</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Objective (10X)</td>
			<td style="width:327px;">Nikon Instruments</td>
			<td style="width:360px;">Plan Apo &#955; 10X/0.45 &#8734;/0.17 MRD00105</td>
			<td>Useful for large fields of view</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Objective (20X)</td>
			<td style="width:327px;">Nikon Instruments</td>
			<td style="width:360px;">Plan Apo &#955; 20X/0.75 &#8734;/0.17 MRD00205</td>
			<td>Most often used for tissue samples</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Objective (60X)</td>
			<td style="width:327px;">Nikon Instruments</td>
			<td>Plan Apo VC 60X/1.2 WI &#8734;/0.15-0.18 WD 0.27</td>
			<td>Most often used for cell samples</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">sCMOS Camera</td>
			<td style="width:327px;">Photometrics</td>
			<td style="width:360px;">Prime 95B (Rev A8-062802018)</td>
			<td>For acquiring high-sensitivity digital images</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Spectrometer</td>
			<td style="width:327px;">Ocean Optics</td>
			<td style="width:360px;">QE65000</td>
			<td>Used to measure spectral output of excitation-scanning spectral system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Tunable Filter Changer</td>
			<td style="width:327px;">Sutter Instrument</td>
			<td style="width:360px;">Lambda VF-5</td>
			<td>Motorized unit for automated excitation filter tuning/switching</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Xenon Arc Lamp</td>
			<td style="width:327px;">Sunoptic Technologies</td>
			<td style="width:360px;">Titan 300HP Lightsource</td>
			<td>Light source with relatively uniform spectral output</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

excitation-scanning hyperspectral imaging microscopy to efficiently discriminate fluorescence signals

Várias técnicas dependem da detecção de sinais de fluorescência para identificar ou estudar fenômenos ou para elucidar funções. A separação destes sinais da fluorescência foi provada complicada até o advento da imagem latente hiperespectrais, em que as fontes da fluorescência podem ser separadas de se e de sinais do fundo e do autofluorescence (dado o conhecimento de seu espectral assinaturas). Entretanto, a imagem latente hiperespectrais tradicional, da emissão-exploração sofre dos tempos lentos da aquisição e das baixas relações do sinal-à-ruído devido à filtração necessária da excitação e da luz da emissão. Foi mostrado previamente que a imagem latente hiperespectrais da excitação-exploração reduz o tempo necessário da aquisição ao simultaneamente aumentar a relação sinal-à-ruído de dados adquiridos. Usando equipamentos comercialmente disponíveis, este protocolo descreve como montar, calibrar e usar um sistema de microscopia de imagem hiperespectral de varredura de excitação para a separação de sinais de várias fontes de fluorescência em uma única amostra. Quando altamente aplicável à imagem latente microscópica das pilhas e dos tecidos, esta técnica pode igualmente ser útil para qualquer tipo de experiência que utiliza a fluorescência em que é possível variar comprimentos de onda da excitação, incluindo mas não limitado a: imagem latente química, aplicações ambientais, cuidados com os olhos, ciência dos alimentos, ciência forense, ciência médica e mineralogia.

Várias etapas importantes deste protocolo são necessárias para garantir a coleta de dados que são precisos e desprovidos de imagens e artefatos espectrais. Pular essas etapas pode resultar em dados que parecem significativos, mas não podem ser verificados ou reproduzidos com qualquer outro sistema de imagens espectrais, anulando assim efetivamente quaisquer conclusões feitas com esses dados. O chefe entre estas etapas importantes é a correção de saída espectral adequada (seção...

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Excitation-Scanning Hyperspectral Imaging Microscopy to Efficiently Discriminate Fluorescence Signals

Microscopia de imagem hiperespectral de detecção de excitação para discriminar sinais de fluorescência de forma eficiente

A imagem latente espectral transformou-se uma solução de confiança para a identificação e a separação de sinais múltiplos da fluorescência em uma única amostra e pode prontamente distinguir sinais do interesse do fundo ou do autofluorescence. A excitação-a imagem latente hiperespectrais da exploração melhora nesta técnica diminuindo o tempo necessário da aquisição da imagem ao simultaneamente aumentar a relação do sinal-à-ruído.

Several techniques rely on detection of fluorescence signals to identify or study phenomena or to elucidate functions. Separation of these fluorescence ...

Este protocolo é significativo, pois descreve um método que pode ser usado para separar vários sinais fluorescentes em uma única amostra. Em comparação com os métodos tradicionais, a excitação-digitalização pode aumentar a velocidade do experimento e melhorar a sensibilidade dos dados. Usando diferentes fontes de iluminação, como um laser de supercontinuum, este método pode ser aplicável a sistemas de microscópio confocal de varredura de disco giratório ou laser.Ao realizar varreduras de excitação, microscopia de imagem espectral, é importante verificar se o pico de excitação de cada rótulo fluorescente ocorre em um comprimento de onda diferente. Para começar, configure um microscópio e câmera de fluorescência invertidas, conforme descrito no protocolo de texto. Em seguida, carregue a amostra no palco.No menu suspenso da janela principal do microgerente, selecione 475 nanômetros para visualização inicial da amostra. Em seguida, clique duas vezes na caixa ao lado da exposição e digite 100 para definir o tempo de exposição em 100 milissegundos. Por fim, clique ao vivo para ver a amostra.Agora clique em Auto. O botão de faixa de visualização de intensidade automática para trazer os valores mínimos e máximos para faixas visuais significativas. Em seguida, use os botões de foco do microscópio para concentrar a amostra.Uma vez em foco, ajuste a posição da amostra para que sua borda esteja no centro do campo de visão. Então ajuste o foco. A amostra está em foco quando as características de borda na imagem parecem nítidas.Agora, abra a ferramenta de aquisição multidimensional. No menu, clique no botão de carga e escolha uma configuração predefinida contendo uma faixa de comprimento de onda apropriada para aquisição espectral. Uma vez confirmadas as configurações de aquisição, mova-se para uma região em branco da amostra e clique em adquirir para coletar uma pilha de imagens espectrais contendo fundo e ruído para usar para subtração posteriormente.Em seguida, mova-se sobre a amostra para encontrar as regiões mais brilhantes. É provável que as amostras tenham fluorescência mais intensa longe da borda da amostra. Uma vez localizada a região mais brilhante, pegue uma única pilha de imagens.Carregue a imagem adquirida na Imagem J e use a função de medida da Imagem J para confirmar que nenhum comprimento de onda contém pixels superexpostos. Se for necessário um tempo de exposição reduzido devido à superexposição, a imagem de fundo deve ser retomada com um novo tempo de exposição também. Se alguma das imagens estiver contendo o limite de detecção ascendente da câmera, ajuste o tempo de exposição da varredura espectral para garantir que o sinal máximo em toda a faixa espectral não exceda o alcance dinâmico da câmera.Com um tempo de exposição apropriado agora determinado, coloque uma amostra sem rótulo no palco. Adquira dados de imagem espectral da amostra não rotulada para determinar se há alguma autofluoresência subjacente. Em seguida, coloque uma amostra de um único rótulo no palco.Adquira dados de imagem espectral de cada uma das amostras de rótulo único para usar como controles espectrais para construir uma biblioteca espectral. Execute a varredura para cada amostra de controle usando um tempo de exposição de comprimento de onda idêntico e configurações da câmera. Em seguida, coloque um slide contendo a amostra experimental no microscópio.Selecione um campo de visão que tenha rotulado adequadamente as células e adquira os dados de imagem espectral da amostra usando as configurações de aquisição determinadas. Corrigir imagens para uma resposta espectral plana subtraindo o espectro de fundo da imagem da amostra e multiplicando a imagem pelo coeficiente de correção. Aqui, um script MATLAB é usado para processar rapidamente as imagens.Em seguida, gere a biblioteca espectral. Para obter melhores resultados, normalize cada membro final para a faixa de comprimento de onda de maior intensidade, determinando qual faixa de comprimento de onda tem o valor mais intenso e dividindo a medição em cada faixa de comprimento de onda por esse valor máximo. Em seguida, salve os dados espectrais como um arquivo dat.Quando concluído, desmixe os dados de imagem espectral. A etapa desmixagem gerará uma imagem de abundância para cada rótulo fluorescente, onde a abundância é a quantidade de sinal fluorescente relativo na imagem do rótulo prospectivo. Em seguida, abra cada imagem não misturada para inspecionar visualmente a distribuição de componentes puros.Compare a magnitude da imagem de erro com a das imagens não misturadas. Se a magnitude da imagem de erro for semelhante às imagens de abundância não misturadas, os sinais nos dados de imagem espectral podem não ser contabilizados com precisão. Finalmente, verifique se não há estruturas residuais não identificadas comparando a imagem de erro com as imagens não misturadas.Quando realizado corretamente, o processo de desmcompra espectral permite a separação de uma pilha de imagem espectral em suas respectivas contribuições de cada rótulo de fluorescência. Aqui, um conjunto de imagens espectrais não misturadas com imagens individuais destacando a autofluorescência de células musculares lisas das vias aéreas, uma sonda GCaMP e um rótulo mitocondrial. Há um alto erro associado às regiões nucleares e perinucleares das células indicando que os espectros medidos dessas regiões não são bem contabilizados pelo espectro na biblioteca espectral.Espectros puros coletados de células rotuladas que também são autofluorescentes provavelmente contaminarão o perfil espectral para o componente puro. Aqui, pode-se ver a diferença de descomprturação com espectro puro contaminado com autofluorescência, versus o espectro puro corrigido após subtração dimensionada. A aquisição adequada de dados é essencial quando amostras sensíveis à imagem só podem sobreviver a uma única sessão de imagem, ao contrário do fundo e controles que podem ser reimaged.Certifique-se de que as configurações adequadas de hardware e aquisição sejam predeterminadas o máximo possível. Como próximo passo, vídeos criados a partir de dados de lapso de tempo adquiridos usando este sistema podem ser usados para rastrear fontes fluorescentes em locais discretos ao longo do tempo, como a localização do sinal de segundo mensageiro. Tome cuidado ao usar fontes de luz poderosas para evitar a exposição ocular.Além disso, certifique-se de usar luvas adequadas ao manusear rótulos biológicos.

Research

JoVE Journal

Engineering

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