Name: excitation-scanning hyperspectral imaging microscopy to efficiently discriminate fluorescence signals
Uploaded: 2019-08-22T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Excitation-Scanning Hyperspectral Imaging Microscopy to Efficiently Discriminate Fluorescence Signals at JoVE.com

Yazarlar NSF 1725937, NIH P01HL066299, NIH R01HL058506, NIH S10OD020149, NIH UL1 TR001417, NIH R01HL137030, AHA 18PRE34060163 ve İbrahim Mitchell Araştırma Fonu'ndan destek almak istiyorum.

1. Cihaz kurulumu
<ol><li>Işık kaynağı: yüksek güç çıkışı ve yüksek kolimasyon (bu çalışmalar için 300 W Xe ark lambası kullanılmıştır) ile geniş bant spektral ışık kaynağı seçin.</li>
	<li>Deklanşör (isteğe bağlı): hızlandırılmış görüntüleme için fotobeyaztma işlemini azaltmak için optik yola bir deklanşör ekleyin.</li>
	<li>Ayarlanabilir filtre sistemi: istenilen dalga boyu ayarlanabilir uyarma aralığını (örneğin, 360-485 nm) etkinleştirmek için mekanik bir ayar ...

Uyarma taramalı hiperspektral görüntüleme kurulumunun en iyi kullanımı ışık yolunun inşası ile başlar. Özellikle, ışık kaynağı seçimi, filtreler (tunable ve dichroic), filtre anahtarlama yöntemi ve kamera mevcut spektral aralığı, olası tarayın hızı, dedektör hassasiyeti ve mekansal örnekleme belirler. Cıva ark lambaları birçok uyarma dalga boyu zirveleri sunuyoruz ama düz bir spektral çıkış sağlamaz ve bir NIST izlenebilir yanıt geri spektral görüntü verilerini düzeltmek için ?...

Spektral görüntüleme çeşitli şekillerde yapılabilir ve çeşitliterimler1,2,3,4ile adlandırılır. Genel olarak, spektral görüntüleme en az iki mekansal boyut ve bir spektral boyutta elde edilen verileri ifade eder. Multispektral ve hiperspektral görüntüleme en sık dalga boyu bantlarının sayısı veya spektral bantların bitişik olup olmadığı ile ayırt edilir1. Bu uygulama için hiperspektral veriler, uyarma için kullanılan her bandpass filtresinin yarım maksimum (FWHM) tam genişliğinin yarısından az olmayan merkez dalga boylarının aralıkları ile elde edilen bitişik dalga boyu bantları ile elde edilen spektral veriler olarak tanımlanır (örn. 5 nm 14-20 nm bant genişlikli bandpass filtreler iã§in merkez dalga boyu sÃ1/4releri). Veri bantlarının bitişik yapısı, veri kümesinin aşırı örneklemesine olanak sağlayarak, spektral etki alanını örneklemede Nyquist ölçütlerinin karşılanmasını sağlar.
Hiperspektral görüntüleme NASA tarafından 1970'li ve 1980'li yıllarda ilk Landsat uydusu 5 ile birlikte geliştirilmiştir5,6. Birkaç bitişik spektral banttan veri toplamak, her pikselin parlak spektrumunun oluşmasına olanak sağladı. Tek tek bileşenlerin parlaklık spektrumunun tanımlanması ve tanımlanması, yüzey malzemelerinin karakteristik spektrumları tarafından algılanmasının yanı sıra, sinyaldeki değişimler gibi müdahale eden sinyallerin de atmosferik koşullar. Karakteristik spektrumlarını kullanarak malzemelerin saptanması kavramı 1996 yılında Schröck ve ark. beş farklı floroforve bilinen spektrumların kombinasyonlarını kullanarak etiketli kromozomları bir süreç olarak adlandırıldığında biyolojik sistemlere uygulanmıştır. spektral karyotipleme7. Bu teknik 2000 yılında Tsurui ve ark. tarafından doku örneklerinin floresan görüntülemesi için, yedi floresan boya ve tekil değer ayrışması kullanılarak, her pikselin referanstaki doğrusal spektrum kombinasyonlarına spektral ayrıştırma elde edilmesi için ayrıntılı olarak geliştirilmiştir. kütüphane8. Uzaktan algılama benzerlerine benzer şekilde, bilinen her floroforun katkısı hiperspektral görüntüden hesaplanabilir, her florofor spektrumunun priori bilgileri göz önüne alındığında.
Hiperspektral görüntüleme de tarım alanlarında kullanılmıştır9, astronomi10, biyotıp11, kimyasal görüntüleme12, çevresel uygulamalar13, göz bakımı14, gıda bilimi15, adli tıp16,17, tıp bilimi18, mineraloji19, ve gözetim20. Mevcut floresan mikroskop hiperspektral görüntüleme sistemlerinin önemli bir sınırlamastandart hiperspektral görüntüleme teknolojisi dar bantlarda floresan sinyalleri izole 1) ilk örnek uyarma kontrol etmek için uyarma ışığı filtreleme, daha sonra 2) daha fazla filtreleme daha sonra matematiksel olarak 21 ayrılabilir dar bantlarhalinde floresan emisyon ayırmak için yayılan ışık . Hem uyarma aydınlatmasını hem de yayılan floresanları filtrelemek, mevcut sinyal miktarını azaltır, bu da sinyal-gürültü oranını düşürür ve uzun edinme süreleri gerektirir. Düşük sinyal ve uzun edinme süreleri, hiperspektral görüntülemenin tanı aracı olarak uygulanabilirliğini sınırlar.
Hiperspektral görüntülemekullanan ancak mevcut sinyali artıran bir görüntüleme yöntemi geliştirilmiştir, böylece gerekli edinme süresini kısaltır21,22. Uyarma taramalı hiperspektral görüntüleme adı verilen bu yeni yöntem, uyarma dalga boyunu değiştirerek ve geniş bir yayılan ışık aralayarak spektral görüntü verilerini elde eder. Daha önce bu tekniğin emisyon tarama teknikleri21,22ile karşılaştırıldığında sinyal-gürültü oranı büyüklük artışları siparişleri verimleri gösterilmiştir. Sinyal-gürültü oranındaki artış büyük ölçüde tespit edilen geniş bantgeçişinden (~600 nm) kaynaklanırken, özgüllük floresan emisyon yerine sadece uyarma ışığının filtrelanmasıyla sağlanır. Bu, yayılan tüm ışığın (her uyarma dalga boyuiçin) dedektör21'e ulaşmasını sağlar. Ayrıca, bu teknik eksojen etiketlerden otofloresans ayırt etmek için kullanılabilir. Ayrıca, artan tespit edilebilir sinyal nedeniyle edinme süresini kısaltma yeteneği fotobeyazrlama tehlikesini azaltır yanı sıra spektral video görüntüleme için kabul edilebilir bir edinim hızında spektral taramaları sağlar.
Bu protokolün amacı, hiperspektral görüntüleme mikroskobu için bir veri toplama rehberi olarak hizmet vermektir. Buna ek olarak, ışık yolunu ve donanımı anlamanın yolunu anlamaya yardımcı olan açıklamalar da dahildir. Ayrıca açıklanan bir uyarma tarama hiperspektral görüntüleme mikroskobu için açık kaynak yazılım uygulamasıdır. Son olarak, sistemin NIST tarafından izlenebilir bir standarda göre nasıl kalibre edilemeyeceği, doğru sonuçlar için yazılım ve donanım ayarlarını ayarlama ve algılanan sinyali tek tek bileşenlerin katkılarına karıştırması için açıklamalar sağlanır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:2119px;" width="2120">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Airway Smooth Muscle Cells</td>
			<td style="width:327px;">National Disease Research Interchange (NDRI)</td>
			<td style="width:360px;">Isolated from human lung tissues obtained from NDRI</td>
			<td style="width:1105px;">Highly autofluorescent, calcium sensitive cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Automated Shutter</td>
			<td style="width:327px;">Thorlabs Inc.</td>
			<td style="width:360px;">SHB1</td>
			<td>Remote-controllable shutter to minimize photobleaching</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Automated Stage</td>
			<td style="width:327px;">Prior Scientific</td>
			<td style="width:360px;">H177P1T4</td>
			<td>Remote-controllable stage for automated multiple field of view or stitched image collection.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Automated Stage Controller (XY)</td>
			<td style="width:327px;">Prior Scientific</td>
			<td style="width:360px;">Proscan III (H31XYZE-US)</td>
			<td>For interfacing automated stage with computer and joystick</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Buffer</td>
			<td style="width:327px;">Made in-house</td>
			<td style="width:360px;">Made in-house</td>
			<td>145 mM NaCl, 4 mM KCl, 20 mM HEPES, 10 mM D-glucose, 1 mM MgCl2, and 1mM CaCl2, at pH 7.3</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Cell Chamber</td>
			<td style="width:327px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:360px;">Attofluor Cell Chamber, A7816</td>
			<td>Coverslip holder composed of surgical stainless steel and a rubber O-ring to seal in media and prevent sample and/or objective contamination</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Excitation Filters</td>
			<td style="width:327px;">Semrock Inc.</td>
			<td style="width:360px;">TBP01-378/16</td>
			<td>Center wavelength range (340-378 nm), Bandwidth (Minimum 16 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.88)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;"></td>
			<td style="width:327px;">Semrock Inc.</td>
			<td style="width:360px;">TBP01-402/16</td>
			<td>Center wavelength range (360-400 nm), Bandwidth (Minimum 16 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.8)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;"></td>
			<td style="width:327px;">Semrock Inc.</td>
			<td style="width:360px;">TBP01-449/15</td>
			<td>Center wavelength range (400-448.8 nm), Bandwidth (Minimum 15 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.8)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;"></td>
			<td style="width:327px;">Semrock Inc.</td>
			<td style="width:360px;">TBP01-501/15</td>
			<td>Center wavelength range (448.8-501.5 nm), Bandwidth (Minimum 15 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.84)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;"></td>
			<td style="width:327px;">Semrock Inc.</td>
			<td style="width:360px;">TBP01-561/14</td>
			<td>Center wavelength range (501.5-561 nm), Bandwidth (Minimum 14 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.83)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Fluorescence Filter Cube Dichroic Beamsplitter</td>
			<td style="width:327px;">Semrock Inc.</td>
			<td style="width:360px;">FF495-Di03</td>
			<td>Separates excitation and emission light at 495 nm (&#62;98% reflection between 350-488 nm, &#62;93% transmission between 502-950 nm), Filter effective index (1.78)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Fluorescence Filter Cube Longpass Filter</td>
			<td style="width:327px;">Semrock Inc.</td>
			<td style="width:360px;">FF01 496/LP-25</td>
			<td>Allows passage of light longer than 496 nm ( &#62;93% average transmission between 503.2-1100 nm), Refractive index (1.86)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">GCaMP Probe</td>
			<td style="width:327px;">Addgene</td>
			<td style="width:360px;">G-CaMP3; Plasmid #22692</td>
			<td>A single-wavelength GCaMP2-based genetically encoded calcium indicator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Integrating Sphere</td>
			<td style="width:327px;">Ocean Optics</td>
			<td style="width:360px;">FOIS-1</td>
			<td>Used for accurate measurement of wide-angle illumination</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Inverted Fluorescence Microscope</td>
			<td style="width:327px;">Nikon Instruments</td>
			<td style="width:360px;">TE2000</td>
			<td>Inverted microscopes allow direct excitation of sample without the need to penetrate layers of media and/or tissue.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Mitotracker Green FM</td>
			<td style="width:327px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:360px;">M7514</td>
			<td>Labels mitochondria</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">NIST-Traceable Calibration Lamp</td>
			<td style="width:327px;">Ocean Optics</td>
			<td style="width:360px;">LS-1-CAL-INT</td>
			<td>A lamp with a known spectrum for use as a standard</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">NIST-Traceable Fluorescein</td>
			<td style="width:327px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:360px;">F36915</td>
			<td>For verifying appropriate spectral response of the system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">NucBlue</td>
			<td style="width:327px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:360px;">R37605</td>
			<td>Labels cell nuclei</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Objective (10X)</td>
			<td style="width:327px;">Nikon Instruments</td>
			<td style="width:360px;">Plan Apo &#955; 10X/0.45 &#8734;/0.17 MRD00105</td>
			<td>Useful for large fields of view</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Objective (20X)</td>
			<td style="width:327px;">Nikon Instruments</td>
			<td style="width:360px;">Plan Apo &#955; 20X/0.75 &#8734;/0.17 MRD00205</td>
			<td>Most often used for tissue samples</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Objective (60X)</td>
			<td style="width:327px;">Nikon Instruments</td>
			<td>Plan Apo VC 60X/1.2 WI &#8734;/0.15-0.18 WD 0.27</td>
			<td>Most often used for cell samples</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">sCMOS Camera</td>
			<td style="width:327px;">Photometrics</td>
			<td style="width:360px;">Prime 95B (Rev A8-062802018)</td>
			<td>For acquiring high-sensitivity digital images</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Spectrometer</td>
			<td style="width:327px;">Ocean Optics</td>
			<td style="width:360px;">QE65000</td>
			<td>Used to measure spectral output of excitation-scanning spectral system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Tunable Filter Changer</td>
			<td style="width:327px;">Sutter Instrument</td>
			<td style="width:360px;">Lambda VF-5</td>
			<td>Motorized unit for automated excitation filter tuning/switching</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:327px;">Xenon Arc Lamp</td>
			<td style="width:327px;">Sunoptic Technologies</td>
			<td style="width:360px;">Titan 300HP Lightsource</td>
			<td>Light source with relatively uniform spectral output</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

excitation-scanning hyperspectral imaging microscopy to efficiently discriminate fluorescence signals

Çeşitli teknikler, fenomenleri tanımlamak veya incelemek veya işlevleri açıklamak için floresan sinyallerinin algılanmasına dayanır. Bu floresan sinyallerinin ayrılması, floresan kaynaklarının birbirlerinden, arka plan sinyalleri ve otofloresanlardan ayrılabildiği hiperspektral görüntülemenin ortaya çıkmasına kadar hantal olduğu kanıtlanmıştır (spektral bilgileri ne kadar dır? imzalar). Ancak, geleneksel, emisyon taramalı hiperspektral görüntüleme, hem uyarma hem de emisyon ışığının gerekli filtrelenmesi nedeniyle yavaş edinim süreleri ve düşük sinyal-gürültü oranlarından muzdariptir. Daha önce uyarma taramalı hiperspektral görüntülemenin gerekli kazanım süresini kısaltırken aynı zamanda elde edilen verilerin sinyal-gürültü oranını artırdığı gösterilmiştir. Ticari olarak kullanılabilen ekipmanı kullanan bu protokol, tek bir örnekteki birkaç floresan kaynaktan gelen sinyallerin ayrılması için uyarma taramalı hiperspektral görüntüleme mikroskobu sisteminin nasıl monte edilebildiğini, kalibre edilebildiğini ve kullanılacağını açıklar. Hücrelerin ve dokuların mikroskobik görüntülemesi için son derece geçerli olmakla birlikte, bu teknik, uyarma dalga boylarını değiştirmek mümkün olan floresan kullanan her türlü deney için de yararlı olabilir: kimyasal görüntüleme, çevre uygulamaları, göz bakımı, gıda bilimi, adli tıp, tıp bilimi ve mineraloji.

Bu protokolden birkaç önemli adım, hem doğru hem de görüntüleme ve spektral eserlerden yoksun veri toplanmasını sağlamak için gereklidir. Bu adımları atlamak, önemli görünen ancak başka bir spektral görüntüleme sistemiyle doğrulanamayan veya çoğaltılamayan verilere neden olabilir ve böylece söz konusu verilerle elde edilen sonuçlar etkin bir şekilde geçersiz kılınabilir. Bu önemli adımlar arasında baş uygun spektral çıkış düzeltme (bölüm 3). Düze...

Watch this Scientific Journal Video about Excitation-Scanning Hyperspectral Imaging Microscopy to Efficiently Discriminate Fluorescence Signals at JoVE.com

Excitation-Scanning Hyperspectral Imaging Microscopy to Efficiently Discriminate Fluorescence Signals

Floresan Sinyallerini Etkin Bir Şekilde Ayırt Etmek Için Uyarma-Tarama hiperspektral görüntüleme mikroskobu

Spektral görüntüleme, birden fazla floresan sinyalin tek bir örnekte tanımlanması ve ayrılması için güvenilir bir çözüm haline gelmiştir ve ilgi sinyallerini arka plandan veya otofloresanstan kolayca ayırt edebilir. Uyarma-tarama hiperspektral görüntüleme aynı anda sinyal-gürültü oranını artırırken gerekli görüntü edinme süresini azaltarak bu tekniği geliştirir.

Several techniques rely on detection of fluorescence signals to identify or study phenomena or to elucidate functions. Separation of these fluorescence ...

Bu protokol, tek bir örnekte birkaç floresan sinyali ayırmak için kullanılabilecek bir yöntemi tanımladığı için önemlidir. Geleneksel yöntemlerle karşılaştırıldığında, uyarma-tarama deneyin hızını artırabilir ve verilerin hassasiyetini artırabilir. Bu yöntem, süper süreklilik lazer gibi farklı aydınlatma kaynakları kullanılarak dönen disk veya lazer tarama konfokal mikroskop sistemleri için uygulanabilir.Uyarma-tarama, spektral görüntüleme mikroskopisi yaparken, her floresan etiketin uyarma zirvesinin farklı bir dalga boyunda oluşunun olup olmadığını kontrol etmek önemlidir. Başlamak için, metin protokolünde açıklandığı gibi ters floresan mikroskobu ve kamerayı ayarlayın. Sonra sahnede örnek yükleyin.Micromanager ana penceresinin açılır menüsünden, ilk örnek görüntüleme için 475 nanometre seçin. Ardından pozlamanın yanındaki kutuya çift tıklayın ve pozlama süresini 100 milisaniye olarak ayarlamak için 100 girin. Son olarak, örneği görüntülemek için canlı'yı tıklatın.Şimdi Otomatik'e tıklayın. Minimum ve maksimum değerleri anlamlı, görsel aralıklara getirmek için otomatik yoğunluk izleme aralığı düğmesi. Ardından, numuneyi odaklamak için mikroskobun odak tonlarını kullanın.Odaklandıktan sonra, numunenin konumunu, kenarının görüş alanının merkezinde olacak şekilde ayarlayın. O zaman odakta ince ayar. Görüntüdeki kenar özellikleri keskin göründüğünde örnek odaktadır.Şimdi, çok boyutlu edinme aracını açın. Menüde, yük düğmesini tıklatın ve spektral edinimi için uygun bir dalga boyu aralığı içeren önceden ayarlanmış bir ayar seçin. Edinme ayarları onaylandıktan sonra, numunenin boş bir bölgesine geçin ve daha sonra çıkarma için kullanılacak arka plan ve gürültü içeren bir spektral görüntü yığını toplamak için satın alın'ı tıklatın.Ardından, en parlak bölgeleri bulmak için örnek hakkında hareket edin. Örneklerin, numunenin kenarından uzakta daha yoğun floresan olması muhtemeldir. En parlak bölge bulunduğunda, tek bir görüntü yığını alın.Elde edilen görüntüyü Görüntü J'ye yükleyin ve hiçbir dalga boylarının aşırı pozlanmış piksel içermediğini doğrulamak için Image J'nin ölçüm işlevini kullanın. Aşırı pozlama nedeniyle daha az pozlama süresi gerekiyorsa, arka plan görüntüsü de yeni bir pozlama süresi ile geri alınmalıdır. Görüntülerden herhangi birinin kameranın yukarı algılama sınırını içerdiği tespit edilirse, spektral aralıkboyunca maksimum sinyalin kameranın dinamik aralığını aşmadığından emin olmak için spektral tarayın pozlama süresini ayarlayın.Şimdi belirlenen uygun bir pozlama süresiyle, sahneye etiketlenmemiş bir örnek yerleştirin. Altta yatan bir otofloresence olup olmadığını belirlemek için etiketlenmemiş örnekten spektral görüntü verilerini edinin. Ardından, sahneye tek etiketli bir örnek yerleştirin.Spektral kitaplık oluşturmak için spektral denetimolarak kullanmak üzere tek etiketli örneklerin her birinden spektral görüntü verileri edinin. Aynı dalga boyu aralığı pozlama süresi ve kamera ayarlarını kullanarak her kontrol numunesi için taramaya devam edin. Ardından, mikroskoba deneysel numuneiçeren bir slayt yerleştirin.Hücreleri uygun şekilde etiketlemiş bir görünüm alanı seçin ve belirlenen edinme ayarlarını kullanarak örnekten spektral görüntü verilerini elde edin. Arka plan spektrumunu örnek görüntüden çıkararak ve görüntüyü düzeltme katsayısıyla çarparak görüntüleri düz bir spektral yanıta doğru layın. Burada, görüntüleri hızlı bir şekilde işlemek için bir MATLAB komut dosyası kullanılır.Sonra, spektral kitaplığı oluşturun. En iyi sonuçlar için, hangi dalga boyu bandının en yoğun değere sahip olduğunu belirleyerek ve her dalga boyu bandındaki ölçümü bu maksimum değere bölerek her bir uç üyeyi en yüksek yoğunluktaki dalga boyu bandına normalleştirin. Sonra spektral verileri dat dosyası olarak kaydedin.Tamamlandığında, spektral görüntü verilerini karıştırın. Karıştırmayı karıştırmaadım, her floresan etiket için bir bolluk görüntüsü oluşturur, burada bolluk, görüntüdeki göreli floresan sinyal miktarıdır. Ardından, saf bileşenlerin dağıtımını görsel olarak incelemek için her karışık olmayan görüntüyü açın.Hata görüntüsünün büyüklüğünü karışık olmayan görüntülerle karşılaştırın. Hata görüntüsünün büyüklüğü karışık olmayan bolluk görüntülerine benziyorsa, spektral görüntü verilerindeki sinyaller doğru bir şekilde muhasebelemeyebilir. Son olarak, hata görüntüsünü karışık olmayan görüntülerle karşılaştırarak tanımlanamayan artık yapılar olup olmadığını denetleyin.Doğru yapıldığında, spektral karıştırma işlemi, spektral görüntü yığınının her floresan etiketinden ilgili katkılara ayrılmasını sağlar. Burada, hava yolu düz kas hücre otofloresans vurgulayan bireysel görüntüler ile karışık olmayan bir spektral görüntü seti, bir GCaMP prob ve bir mitokondriyal etiket. Hücrelerin nükleer ve perinükleer bölgeleri ile ilişkili yüksek hata bu bölgelerin ölçülen spektrumları iyi spektral kütüphanede spektrumlar tarafından hesap olmadığını gösteren vardır.Aynı zamanda otofloresan etiketli hücrelerden toplanan saf spektrumlar büyük olasılıkla saf bileşen için spektral profili kontamine olacaktır. Burada, bir otofloresan ile kontamine saf spektrumile karıştırma farkı görebilirsiniz, ölçekli çıkarma sonra düzeltilmiş saf spektrumları karşı. Hassas numunelerin görüntülenmesinde uygun veri toplama, arka plan ve yeniden görüntülenebilen kontrollerden farklı olarak tek bir görüntüleme seansı sağlanabilir.Uygun donanım ve edinme ayarlarının mümkün olduğunca önceden belirlendiğinden emin olun. Bir sonraki adım olarak, bu sistem kullanılarak elde edilen hızlandırılmış verilerden oluşturulan videolar, ikinci haberci sinyali yerelleştirme gibi zaman içinde gizli konumlardaki floresan kaynakları izlemek için kullanılabilir. Göze maruz kalmaktan kaçınmak için güçlü ışık kaynaklarını kullanırken dikkatli olalım.Ayrıca, biyolojik etiketleri kullanırken uygun eldiven giymek emin olun.

Research

JoVE Journal

Engineering

Use of a Multi-compartment Dynamic Single Enzyme Phantom for Studies of Hyperpolarized Magnetic Resonance Agents

Hiperpolarize Manyetik Rezonans Ajanlar Araştırmaları bir Multi-bölmesi Dinamik Tek Enzim Phantom Kullanımı

Imaging of hyperpolarized substrates by magnetic resonance shows great clinical promise for assessment of critical biochemical processes in real time. Due ...

Dynamic Pore-scale Reservoir-condition Imaging of Reaction in Carbonates Using Synchrotron Fast Tomography

Sinkrotron Hızlı Tomografi ile Karbonat içinde Reaksiyon Dinamik Gözenek ölçekli Rezervuar-koşul Görüntüleme

Underground storage permanence is a major concern for carbon capture and storage. Pumping CO2 into carbonate reservoirs has the potential to dissolve ...

Advanced Compositional Analysis of Nanoparticle-polymer Composites Using Direct Fluorescence Imaging

Doğrudan Floresan Görüntüleme kullanma Nanoparçacık-polimer kompozitler Gelişmiş Bileşim Analizi

The fabrication of polymer-nanoparticle composites is extremely important in the development of many functional materials. Identifying the precise ...

Sub-nanometer Resolution Imaging with Amplitude-modulation Atomic Force Microscopy in Liquid

Sıvı olarak Genlik modülasyonu Atomik Kuvvet Mikroskobu ile alt nanometre Çözünürlüklü Görüntüleme

Atomic force microscopy (AFM) has become a well-established technique for nanoscale imaging of samples in air and in liquid. Recent studies have shown ...

Microfluidic Imaging Flow Cytometry by Asymmetric-detection Time-stretch Optical Microscopy (ATOM)

Microfluidic Imaging Flow Cytometry by Asymmetric-detection Time-stretch Optical Microscopy ATOM

Asimetrik Algılama Zaman-Streçi Optik Mikroskopi (ATOM) ile Mikroakışkan Görüntüleme Akış Sitometresi

Scaling the number of measurable parameters, which allows for multidimensional data analysis and thus higher-confidence statistical results, has been the ...

Novel Photoacoustic Microscopy and Optical Coherence Tomography Dual-modality Chorioretinal Imaging in Living Rabbit Eyes

Yaşam tavşan gözünde roman Photoacoustic mikroskobu ve optik Koherens tomografi çift-modality Chorioretinal görüntüleme

Photoacoustic ocular imaging is an emerging ophthalmic imaging technology that can noninvasively visualize ocular tissue by converting light energy into ...

Synchrotron X-ray Microdiffraction and Fluorescence Imaging of Mineral and Rock Samples

Sinkrotron x-ışını Microdiffraction ve Mineral ve kaya örneklerini floresans görüntüleme

In this report, we describe a detailed procedure for acquiring and processing&#160;x-ray microfluorescence (&#956;XRF), and Laue and powder ...

Label-Free Imaging of Single Proteins Secreted from Living Cells via iSCAT Microscopy

Etiket içermeyen Imaging, tek proteinler salgılanan iSCAT mikroskobu ile yaşayan hücrelerden

We demonstrate interferometric scattering (iSCAT) microscopy, a method capable of detecting single unlabeled proteins secreted from individual living ...