Name: a non-random mouse model for pharmacological reactivation of mecp2 on the inactive x chromosome
Uploaded: 2019-05-22T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Non-random Mouse Model for Pharmacological Reactivation of Mecp2 on the Inactive X Chromosome at JoVE.com

يشكر المؤلفات [أنتونيو] [بدالوف] ل يزود الكواشف; جامعه فرجينيا نسيج الانسجه الاساسيه للحصول علي التجميد; جامعه فرجينيا تدفق الخلوية الاساسيه لتحليل تدفق الخلوي. كريستيان بلو و سالوني سينغ للحصول علي المساعدة التقنية في التنميط الجيني. وقد تم دعم هذا العمل من خلال منحه بحثيه مزدوجة إلى Z.Z. بشان ، وجائزه برنامج المشروع التجريبي من جامعه فرجينيا فيرجينيا للتكنولوجيا البذور جائزه الصندوق وجائزه البحوث الطبية الحيوية الفردية مؤسسه هارتويل إلى نشره سورينام

وتمت الموافقة علي العمل المتعلق بالفئران من قبل لجنه الرعاية المؤسسية للحيوانات واستخدامها التابعة لجامعه فرجينيا (IACUC ؛ #4112).
1. توليد نموذج ماوس XCI غير عشوائية مع المسمي وراثيا Mecp2 علي Xi
ملاحظه: وكانت سلالات الماوس المستخدمة في الدراسة علي النحو ?...

<ol>
	<li>Lyon, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-chromosome+inactivation+as+a+system+of+gene+dosage+compensation+to+regulate+gene+expression.">X-chromosome inactivation as a system of gene dosage compensation to regulate gene expression.</a> Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology. 36, 119-130 (1989).</li><li>Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delving+into+the+diversity+of+facultative+heterochromatin:+the+epigenetics+of+the+inactive+X+chromosome.">Delving into the diversity of facultative heterochromatin: the epigenetics of the inactive X chromosome.</a> Current Opinion in Genetics Development. 15 (5), 482-489 (2005).</li><li>Augui, S., Nora, E. P., Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+X-chromosome+inactivation+by+the+X-inactivation+centre.">Regulation of X-chromosome inactivation by the X-inactivation centre.</a> Nature Review Genetics. 12 (6), 429-442 (2011).</li><li>Pontier, D. B., Gribnau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xist+regulation+and+function+explored.">Xist regulation and function explored.</a> Human Genetics. 130 (2), 223-236 (2011).</li><li>Barnes, C., Kanhere, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+RNA-Protein+Interactions+Through+In+Vitro+RNA+Pull-Down+Assays.">Identification of RNA-Protein Interactions Through In Vitro RNA Pull-Down Assays.</a> Methods in Molecular Biology. 1480, 99-113 (2016).</li><li>McHugh, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Xist+lncRNA+interacts+directly+with+SHARP+to+silence+transcription+through+HDAC3.">The Xist lncRNA interacts directly with SHARP to silence transcription through HDAC3.</a> Nature. 521 (7551), 232-236 (2015).</li><li>Minajigi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomes.+A+comprehensive+Xist+interactome+reveals+cohesin+repulsion+and+an+RNA-directed+chromosome+conformation.">Chromosomes. A comprehensive Xist interactome reveals cohesin repulsion and an RNA-directed chromosome conformation.</a> Science. 349 (6245), (2015).</li><li>Mira-Bontenbal, H., Gribnau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Xist-Interacting+Proteins+in+X-Chromosome+Inactivation.">New Xist-Interacting Proteins in X-Chromosome Inactivation.</a> Current Biology. 26 (8), R338-R342 (2016).</li><li>Mira-Bontenbal, H., Gribnau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Xist-Interacting+Proteins+in+X-Chromosome+Inactivation.">New Xist-Interacting Proteins in X-Chromosome Inactivation.</a> Curren Biology. 26 (10), 1383 (2016).</li><li>Ridings-Figueroa, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nuclear+matrix+protein+CIZ1+facilitates+localization+of+Xist+RNA+to+the+inactive+X-chromosome+territory.">The nuclear matrix protein CIZ1 facilitates localization of Xist RNA to the inactive X-chromosome territory.</a> Genes and Development. 31 (9), 876-888 (2017).</li><li>Sunwoo, H., Colognori, D., Froberg, J. E., Jeon, Y., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repeat+E+anchors+Xist+RNA+to+the+inactive+X+chromosomal+compartment+through+CDKN1A-interacting+protein+(CIZ1).">Repeat E anchors Xist RNA to the inactive X chromosomal compartment through CDKN1A-interacting protein (CIZ1).</a> Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. , (2017).</li><li>Bhatnagar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+pharmacological+reactivation+of+the+mammalian+inactive+X+chromosome.">Genetic and pharmacological reactivation of the mammalian inactive X chromosome.</a> Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (35), 12591-12598 (2014).</li><li>Zoghbi, H. Y., Percy, A. K., Schultz, R. J., Fill, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+X+chromosome+inactivation+in+the+Rett+syndrome.">Patterns of X chromosome inactivation in the Rett syndrome.</a> Brain Development. 12 (1), 131-135 (1990).</li><li>Anvret, M., Wahlstrom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rett+syndrome:+random+X+chromosome+inactivation.">Rett syndrome: random X chromosome inactivation.</a> Clinical Genetics. 45 (5), 274-275 (1994).</li><li>Amir, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rett+syndrome+is+caused+by+mutations+in+X-linked+MECP2,+encoding+methyl-CpG-binding+protein+2.">Rett syndrome is caused by mutations in X-linked MECP2, encoding methyl-CpG-binding protein 2.</a> Nature Genetics. 23 (2), 185-188 (1999).</li><li>Przanowski, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+reactivation+of+inactive+X-linked+Mecp2+in+cerebral+cortical+neurons+of+living+mice.">Pharmacological reactivation of inactive X-linked Mecp2 in cerebral cortical neurons of living mice.</a> Proceedings of Natlional Academy of Sciences of the United States of America. 115 (31), 7991-7996 (2018).</li><li>Borensztein, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xist-dependent+imprinted+X+inactivation+and+the+early+developmental+consequences+of+its+failure.">Xist-dependent imprinted X inactivation and the early developmental consequences of its failure.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 24 (3), 226-233 (2017).</li><li>Jensen, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+histological+staining+and+fluorescence+using+ImageJ.">Quantitative analysis of histological staining and fluorescence using ImageJ.</a> Anatomical Record (Hoboken). 296 (3), 378-381 (2013).</li><li>Cseke, L. J., Talley, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+PCR-based+genotyping+method+to+distinguish+between+wild-type+and+ornamental+varieties+of+Imperata+cylindrica.">A PCR-based genotyping method to distinguish between wild-type and ornamental varieties of Imperata cylindrica.</a> Journal of Visualized Experiments. (60), (2012).</li></ol>

سابقا ، تم تحديد XCIFs المطلوبة بشكل انتقائي لإسكات الجينات المرتبطة بالحادي عشر في الخلايا الانثويه الثديية12. ونحن كذلك الأمثل مثبطات جزيء صغير قويه لاستهداف XCIFs ، مثل ACVR1 والمستجيبين المصب من PDPK1 ، والتي بكفاءة تنشيط الحادي عشر مرتبطة Mecp2 في خطوط الخلية الخلايا الليفية ال?...

X صبغ الكروموسوم (XCI) هو عمليه التعويض الجرعة التي يوازن التعبير الجينات المرتبطة X عن طريق إسكات نسخه واحده من كروموسوم X في الإناث1. ونتيجة لذلك ، يتراكم الكروموسوم X غير النشط (Xi) السمات المميزة للهتروكروماتين بما في ذلك ميثيل الحمض النووي والتعديلات المثبطة للهخه ، مثل هيستون H3-يسين 27 ثلاثي ميثيل (H3K27me3) و هيستون H2A اوبيتاميوشن (H2Aub) 2. المنظم الرئيسي لإسكات الكروموسوم x هو مركز التنشيط العاشر (الأكسجين) المنطقة ، حوالي 100 − 500 كيلوبايت ، والتي تتحكم في العد والاقتران من الكروموسومات x ، واختيار عشوائي من كروموسوم x لعدم التنشيط ، والبدء و نشر من إسكات علي طول كروموسوم X3. يتم بدء عمليه التنشيط X بواسطة النسخة المحددة X غير النشطة (Xist) التي تغطي الحادي عشر في رابطه الدول المستقلة للتوسط في إسكات الكروموسومات وأعاده تشكيل البنية ثلاثية الابعاد لكروموسوم x4. في الاونه الاخيره ، وقد حددت العديد من الشاشات البروتينية والوراثية المنظمين اضافيه من xci ، مثل البروتينات المتفاعلة xci 5،6،7،8،9 , 10 , 11 , 12. علي سبيل المثال ، الدراسة السابقة باستخدام الجينوم علي نطاق واسع الجينات تداخل الحمض الريبي كشفت 13 العوامل العابرة لل Xci (xcifs)12. الميكانيكية ، XCIFs تنظيم التعبير Xist التالي ، التداخل مع الدالة xcifs يسبب عيب xci12. معا ، قدمت التطورات الاخيره في الميدان رؤى هامه في آلات الجزيئية المطلوبة لبدء والحفاظ علي XCI.
تحديد المنظمين xci وفهم آليتهم في xci ذات الصلة مباشره بالامراض البشرية المرتبطة ب X ، مثل متلازمة ريت (rtt)13،14. RTT هو اضطراب النمو العصبي النادرة الناجمة عن طفرة غير متجانسة في البروتين الربط العاشر الميثيل-CpG ملزمه 2 (MECP2) الذي يصيب الفتات في الغالب15. لان MECP2 يقع علي الكروموسوم X, الفتات rtt هي متغايرة لنقص MECP2 مع ~ 50% الخلايا التعبير عن نوع البرية و ~ 50% التعبير عن متحولة MECP2. ولا سيما ، RTT خلايا متحولة الميناء نسخه نائمه ولكن البرية من نوع من Mecp2 علي الحادي عشر ، وتوفير مصدر للجينات وظيفية ، والتي إذا أعيد تنشيطها ، يمكن ان تخفف من اعراض المرض. بالاضافه إلى RTT ، هناك العديد من الامراض البشرية الأخرى المرتبطة بالعاشر ، والتي تمثل أعاده تنشيط Xi نهجا علاجيا محتملا ، مثل متلازمة DDX3X.
تثبيط XCIFs ، 3-phosphoinositide البروتين المعتمدة كيناز-1 (PDPK1) ، و activin نوع مستقبلات 1 (ACVR1) ، اما عن طريق قصيرة الحمض الريبي النيبالي (شرانا) أو مثبطات جزيء صغير ، يعيد تنشيط الجينات المرتبطة Xi12. ولوحظ أعاده تنشيط الدوائية من الجينات المرتبطة Xi في مختلف النماذج الجسم السابق التي تشمل خطوط الخلايا الليفية الماوس, الكبار الخلايا العصبية القشرية الماوس, الخلايا الليفية الفئران الجنينية, وخطوط الخلية الليفية المستمدة من المريض RTT12. ومع ذلك ، ما إذا كان التنشيط الدوائي للجينات المرتبطة بالحادي عشر أمرا ممكنا في الجسم الذي لا يزال يتعين إثباته. أحد العوامل المقيدة هو عدم وجود نماذج حيوانيه فعاله لقياس تعبير الجينات بدقه عن أعاده تنشيط الحادي عشر. نحو هذا الهدف ، xistδ: Mecp2/Xist: تم إنشاء نموذج الماوس Mecp2 Gfp الذي يحمل المسمي وراثيا Mecp2 علي Xi في جميع الخلايا بسبب الحذف غير المتجانس في اكسيست علي الام X كروموسوم16. باستخدام هذا النموذج, التعبير عن Mecp2 من الحادي عشر وقد تم تكميمها بعد العلاج مع مثبطات XCIFs في الدماغ من الفئران الحية. هنا ، يتم وصف الجيل من xistδ: Mecp2/Xist: Mecp2-Gfp نموذج الماوس ومنهجيه لأعاده تحديد القيمة الحادي عشر في الخلايا العصبية القشرية باستخدام المقايسات القائمة علي المناعي.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >MICE</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mecp2tm3.1Bird</td>
			<td >The Jackson Laboratory</td>
			<td>#014610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >B6;129-Xist (tm5Sado)</td>
			<td>provided by Antonio Bedalov, Fred Hutchinson Cancer Center, Seattle</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >REAGENTS</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >22x22 mm coverslip</td>
			<td >FISHERfinest (Fisher Scientific)</td>
			<td >125488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >32% Paraformaldehyde</td>
			<td >Electron Microscopy Sciences</td>
			<td >15714-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >50 ml syringe</td>
			<td>Medline Industries</td>
			<td>NPMJD50LZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >60mm culture dish</td>
			<td >CellStar</td>
			<td >628160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >7-AAD </td>
			<td >BioLegend</td>
			<td >420403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ammonium chloride (NH4Cl)</td>
			<td >Fisher Chemical</td>
			<td >A661-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >anti-GFP-AlexaFluor647</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td >A-31852</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >anti-MAP2</td>
			<td >Aves Labs</td>
			<td >MAP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >BSA</td>
			<td >Promega</td>
			<td >R396D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Buprenorphine SR</td>
			<td >Zoopharm</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >citric acid </td>
			<td >Sigma</td>
			<td >C-1857</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DMSO</td>
			<td >Fisher Bioreagents</td>
			<td >BP231-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td >Corning Cellgro</td>
			<td >10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethanol</td>
			<td >Decon Labs</td>
			<td >2701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td >VWR Life Science</td>
			<td>89510-198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >gelatin</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >G9391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >glass slides</td>
			<td >Fisherbrand</td>
			<td >22-034-486</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >goat anti-chicken FITC-labeled secondary antibody </td>
			<td >Aves Labs</td>
			<td >F-1005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >GSK650394</td>
			<td >ApexBio</td>
			<td >B1051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >hamilton 10&#956;l syringe </td>
			<td >Hamilton Sigma-Aldrich</td>
			<td >28615-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >14025-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ketamine</td>
			<td>Ketaset</td>
			<td>NDC 0856-2013-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Large blunt/blunt curved scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14519-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >LDN193189</td>
			<td >Cayman Chemicals</td>
			<td >11802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >lodixanol</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >1343517</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >magnesium chloride (MgCl2)</td>
			<td >Fisher Chemical</td>
			<td >M35-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Methylcelulose</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >M0262-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >mounting medium with DAPI </td>
			<td >Vectashield</td>
			<td >H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Needle tip, 26 GA x 1.25&#34;</td>
			<td >PrecisionGlide</td>
			<td >305111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ophthalmic ointment </td>
			<td >Refresh Lacri-Lube</td>
			<td >93468</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >optimal cutting temperature (O.C.T.) </td>
			<td >ThermoFisher</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PCR mix</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep)</td>
			<td >Corning</td>
			<td >30-002-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Phosphate buffered saline pH 7.4 (PBS)</td>
			<td >Corning Cellgro</td>
			<td >46-103-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Potassium chloride (KCl)</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >P330-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >scalpel blades</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Shallow glass or plastic tray</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >skin glue/tissue adhesive</td>
			<td >3M Vetbond</td>
			<td >1469SB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >sodium azide</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >CAS 26628-22-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td >Fisher Chemical</td>
			<td >S642-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >standard hemostat forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>13013-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Standard tweezers</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11027-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Straight iris scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14058-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >sucrose</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >BP220-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tris-base</td>
			<td >Fisher Bioreagents</td>
			<td >BP152-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Triton X-100</td>
			<td >Fisher Bioreagents</td>
			<td >BP151-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypsin-EDTA </td>
			<td >Gibco</td>
			<td >15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Xylazine</td>
			<td >Akorn</td>
			<td>NDC: 59399-111-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EQUIPMENT</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Zeiss AxioObserver Live-Cell microscope </td>
			<td >Zeiss</td>
			<td >Zeiss AxioObserver</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.45mm burr</td>
			<td >IDEAL MicroDrill</td>
			<td >67-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >BD FACScalibur</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >centrifuge</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >glass homogenizer</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >cell culture incubator</td>
			<td >Thermo Scientific HERACELL VIOS 160i</td>
			<td >13-998-213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Leica 3050S research cryostat </td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >stereotactic platform </td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >thermocycler</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Timer</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ultracentrifuge</td>
			<td >Beckman Coulter Optima L-100 XP</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Water bath (37 &#186;C)</td>
			<td >Fisher Scientific Isotemp 2239</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a non-random mouse model for pharmacological reactivation of mecp2 on the inactive x chromosome

X صبغ الكروموسوم (XCI) هو إسكات عشوائي لكروموسوم X واحد في الإناث لتحقيق توازن الجرعة الجينية بين الجنسين. ونتيجة لذلك ، فان جميع الإناث غير متجانسة بالنسبة للتعبير الجيني المرتبط بالعاشر. واحده من الجهات التنظيمية الرئيسية لل XCI هو Xci، وهو أمر ضروري لبدء وصيانة xci. وقد حددت الدراسات السابقة 13 من العوامل التي تعمل بالكروموسوم X بالانابه (XCIFs) باستخدام شاشه وراثيه واسعه النطاق لفقدان الوظائف. تثبيط XCIFs ، مثل ACVR1 و PDPK1 ، وذلك باستخدام قصيرة دبوس الشعر RNA أو مثبطات جزيء صغير ، يعيد تنشيط X الجينات المرتبطة كروموسوم في الخلايا المستزرعة. ولكن الجدوى والقابلية لأعاده تنشيط الكروموسوم X غير النشط في الجسم المجري لا يزال يتعين تحديده. نحو هذا الهدف ، xistδ: Mecp2/Xist: تم إنشاء نموذج الماوس Mecp2 Gfp مع xist غير عشوائية بسبب حذف xist علي كروموسوم X واحد. باستخدام هذا النموذج ، تم تحديد مدي أعاده تنشيط X غير نشط في الدماغ الماوس بعد العلاج مع مثبطات XCIF. تظهر النتائج المنشورة مؤخرا ، للمرة الاولي ، ان تثبيط الدوائية من XCIFs يعيد تنشيط Mecp2 من كروموسوم X غير نشط في الخلايا العصبية القشرية من الدماغ الماوس الحية.

لإثبات جدوى xistδ: Mecp2/Xist: Mecp2-gfp نموذج الماوس للدراسات أعاده التنشيط xi ، تم اختبار xist المثبط الوساطة أعاده تنشيط المرتبطة بالحادي عشر Mecp2-gfp في الخلايا الليفية الجنينية الفئران (mefs). تم عزل الإناث MEFs من اليوم 15.5 xistδ: Mecp2/Xist: الاجنه Mecp2-Gfp كما هو موضح في القسم 3 (ا...

Watch this Scientific Journal Video about A Non-random Mouse Model for Pharmacological Reactivation of Mecp2 on the Inactive X Chromosome at JoVE.com

A Non-random Mouse Model for Pharmacological Reactivation of Mecp2 on the Inactive X Chromosome

هنا ، ونحن وصف بروتوكول لتوليد نموذج murine الإناث قابله للحياة مع غير عشوائية X كروموسوم التنشيط ، اي ، أمومي الموروثة X الكروموسوم غير نشط في 100 ٪ من الخلايا. ونحن أيضا وصف بروتوكول لاختبار الجدوى ، والتحمل ، وسلامه أعاده تنشيط الدوائية لكروموسوم X غير نشط في الجسم المجري.

نموذج ماوس غير عشوائي لأعاده تنشيط الدوائية من Mecp2 علي كروموسوم X غير نشط

X chromosome inactivation (XCI) is the random silencing of one X chromosome in females to achieve gene dosage balance between the sexes. As a result, all ...

يمكن استخدام هذا البروتوكول لإنشاء نموذج ماوس غير عشوائي لاختبار وتحديد إعادة تنشيط كروموسوم Mecp2 غير النشط المرتبط بـ X في دماغ الماوس الحي. يمكن تعديل هذا النموذج بسهولة لدراسة إعادة تنشيط Xi في نماذج أمراض أخرى مرتبطة بـ X مثل متلازمة DDX3X. أنا آخر وثيقة في مختبر سانشيتا بهاتناغار وسوف يكون إظهار الإجراء مع زيمينغ تشنغ.تبدأ عن طريق وضع الماوس تخدير في منصة stereotactic مع القواطع مدمن مخدرات في شريط لدغة من المقيد خطم. تشديد المشبك الأنف مع الحفاظ على رأس الماوس على مستوى الطائرة. ضبط ارتفاع قضبان الأذن للوصول إلى الجزء السدومي من قناة الأذن للحفاظ على الرأس غير مُشل.ثم تطهير الرأس مع مناديل بالتناوب من مطهر الموضعية والإيثانول 70٪. عندما يكون الماوس جاهزًا، استخدم مشرطًا معقمة لإجراء شق أفقي 0.75 سنتيمتر في منتصف فروة الرأس. استخدام 0.45 ملليمتر دبر لحفر اثنين من الثقوب متناظرة فوق نصفي الكرة القشرية اليمنى واليسرى ملليمترين من خياطة القوس وخياطة لامدويد في منتصف تقريبي من العظام الجدارية.نعلق بحزم حقنة 10 ميكرولتر إلى منصة stereotactic وتحميل 10 ميكرولترات من مثبطات كيميائية أعدت حديثا في الحقنة. تقدم الإبرة في حفرة البور الأولى مع الحفاظ على إبرة عمودي على الجمجمة. عندما تجتاز الإبرة الجمجمة، صفر الإحداثيات على الشاشة الرقمية المجسمة وتقدم طرف الإبرة حتى يصل إلى عمق 2.5 ملليمتر.سحب إبرة 0.5 ملليمتر إلى عمق مليمترين وحقن ببطء كامل 10 ميكرولتر حجم المحل على مدى فترة دقيقة واحدة. بعد تسليم كل من مثبط، وترك الإبرة في الدماغ لمدة دقيقة أخرى قبل سحب الإبرة. كرر الحقن في ثقب البور الثاني باستخدام السيارة فقط كتحكم وإغلاق الجلد على الشق.ثم نقل الماوس من جهاز stereotactic على وسادة التدفئة درجة مئوية 37 مع مراقبة حتى الشفاء الكامل. في نهاية نظام الجرعة، وتأمين الماوس على لوحة تشريح. استخدام مقص والملقط لجعل شق الجانبي من خلال integument وجدار البطن فقط تحت القفص الصدري.فصل الكبد بعناية من الحجاب الحاجز وقطع من خلال الحجاب الحاجز على طول طول القفص الصدري لفضح تجويف الجنبي. استخدم المقص لإجراء شق إلى الطرف الخلفي للبطين الأيسر وحقن على الفور غرفة القلب اليمنى مع حوالي 15 ملليلتر من برنامج تلفزيوني على مدى فترة دقيقتين. وسوف يؤدي الضخ الناجح في تغيير لون الكبد من الأحمر إلى الوردي الشاحب.عندما تم تسليم كل من برنامج تلفزيوني، ضخ القلب مع ما يقرب من 10 ملليلتر من 4٪ شبهformaldehyde في برنامج تلفزيوني على مدى دقيقتين. بعد حصاد الرأس، استخدم المقص لإجراء شق في منتصف الرأس لفضح الجمجمة. ضع طرفًا واحدًا من المقص في ماغنوم الهضان لتسهيل إنشاء شقّ شقّي في الجمجمة نحو العين.إجراء شق مماثل على الجانب الآخر من الجمجمة مع الحفاظ على نهاية المقص سطحية قدر الإمكان وقطع منطقة الجمجمة بين العينين وفوق أنف الماوس. استخدم ملقطًا لتقشير عظام الجمجمة من نصفي الدماغ واستخدام ملعقة لرفع الدماغ. تشريح بعناية الألياف العصبية القحفية التي إصلاح الدماغ إلى الجمجمة ووضع الدماغ في طبق من البلاستيك.ثم اكوس المصابيح المخيخة والشمية. للحصول على أجزاء من أنسجة الدماغ، أولاً إصلاح الدماغ في أنبوب 15 ملليلتر مليئة 4٪ شبهformaldehyde في برنامج تلفزيوني في أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها. في صباح اليوم التالي، شطف أنسجة الدماغ ثلاث مرات على الأقل لمدة خمس دقائق في أربع درجات مئوية في برنامج تلفزيوني جديد في الغسيل.بعد الغسيل الأخير، إزالة الجزء الأمامي من كل نصف الكرة الأرضية مع مقص ملقط ووضع العينات في تسمية قوالب التبريد الجانب الأمامي إلى أسفل. غمر كل نسيج في متوسط درجة حرارة القطع المثلى قبل المفاجئة تجميد العينات في النيتروجين السائل في طبق بيتري البلاستيك 10 ملليمتر للتخزين ناقص 80 درجة مئوية. لتحديد إعادة تنشيط شي، غمر خمسة إلى ستة أقسام أنسجة الدماغ ميكرومتر في محلول استرجاع المستضد لمدة خمس دقائق على كتلة حرارة 100 درجة مئوية.في نهاية الحضانة، وغسل الشرائح مع أربعة يغسل لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة مع برنامج تلفزيوني الطازجة في غسل قبل غمر الشرائح في حل حجب. بعد 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، اغسل الشرائح ثلاث مرات لمدة خمس دقائق في مخزن غسيل طازج لكل غسيل. وصمة العينات الأنسجة مع الأجسام المضادة الأولية المناسبة في أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها.صورة الشرائح على المجهر الفلوريسين ضبط التباين والسطوع للسماح quantence من عدد الخلايا الإيجابية GFP لكل من المخدرات والمركبات معالجة نصفي الدماغ الماوس. لإثبات جدوى غير عشوائية X كروموسوم تعطيل نموذج الماوس غير نشط العاشر دراسات إعادة تنشيط كروموسوم، تم تأكيد الأنماط الجينية من الألياف الجنينية الماوس المعدلة وراثيا من قبل genotyping PCR وتدفق الخلايا. كما تم تقييمها من قبل PCR، تم تنشيط التعبير عن GFP الموسومة الميثيلين CPG بروتين ملزم جينين أو MECP2 عن طريق المخدرات ولكن ليس العلاج من السيارة.غير عشوائية X كروموسوم تعطيل الماوس نموذج الليفية الجنينية أعرب أيضا GFP النووية بعد المخدرات ولكن ليس علاج السيارة مما يدل على مثبطات عامل تعطيل كروموسوم X إعادة تنشيط كروموسوم X المعطلة مرتبطة MECP2 في الليفية الجنينية الماوس. العلاج من المخدرات ينشط المعطل X كروموسوم MECP2-GFP في حوالي 30٪ من الخلايا في نصفي الدماغ المخدرات غرست في حين لم يتم الكشف عن إعادة تنشيط في نصف الكرة الأرضية السيارة غرست. البروتين المرتبطة Microtubule اثنين من الخلايا العصبية الإيجابية هي أيضا GFP إيجابية في نصفي الكرة الأرضية المعالجة المخدرات تشير إلى تعطيل X كروموسوم MECP2-GFP التعبير.سوف يكون نظام المخدرات تعتمد على الهدف وفعالية مثبطات جزيء صغير حتى تحسين الجرعة والعلاج في المختبر قبل الاختبار في الجسم الحي. ويمكن استخدام نموذج الماوس غير العشوائي لاختبار المخدرات المختلفة إما بشكل فردي أو في تركيبة. في الواقع، ونحن وآخرون قد حددت عدة عوامل تعطيل الكروموسوم X قابلة للأدوية.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Molecular Biology

Genetics

Unit 2

Mendelian Genetics

SCIENTISTS IN ACTION

Conjugative Mating Assays for Sequence-specific Analysis of Transfer Proteins Involved in Bacterial Conjugation

اقترانية التزاوج فحوصات لتحليل تسلسل محدد من البروتينات نقل تشارك في الإقتران البكتيرية

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia ...

Pooled shRNA Screen for Reactivation of MeCP2 on the Inactive X Chromosome

شرنا المجمعة الشاشة لإعادة تنشيط MeCP2 على كروموسوم X غير نشط

Forward genetic screens using reporter genes inserted into the heterochromatin have been extensively used to investigate mechanisms of epigenetic control ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

تحديد تسلسل الجينات التنظيمية استخدام تسلسل الجيل المقبل من تكيف كروموسوم دائرية الفائق التقاط (ج 4-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

الهندسة الوراثية ديسكويديوم ديكتيوستيليوم "الخلايا استناداً إلى" التحديد والنمو في البكتيريا

Dictyostelium discoideum is an intriguing model organism for the study of cell differentiation processes during development, cell signaling, and other ...

Mass Spectrometry-Based Proteomics Analyses Using the OpenProt Database to Unveil Novel Proteins Translated from Non-Canonical Open Reading Frames

تحليلات البروتيوميات الجماعي القائم على قياس الطيف الكتلي باستخدام قاعدة البيانات أوبينبروت لكشف النقاب عن البروتينات رواية مترجمة من إطارات القراءة المفتوحة غير متعارف عليه

Genome annotation is central to today's proteomic research as it draws the outlines of the proteomic landscape. Traditional models of open reading frame ...

A Robust Polymerase Chain Reaction-based Assay for Quantifying Cytosine-guanine-guanine Trinucleotide Repeats in Fragile X Mental Retardation-1 Gene

اختبار قوي من تفاعل البوليميراز القائم على سلسلة لقياس السيتوسين-غوانين-غوانين ترينوكلوتيد يكرر في التهشاشة X التخلف العقلي-1 الجينات

Fragile X syndrome (FXS) and associated disorders are caused by expansion of the cytosine-guanine-guanine (CGG) trinucleotide repeat in the 5&#8217; ...

A Screening Method for Identification of Heterochromatin-Promoting Drugs Using Drosophila

A Screening Method for Identification of Heterochromatin-Promoting Drugs Using Drosophila

طريقة فحص لتحديد العقاقير المعززة للهيتروكروماتين باستخدام دروسوفيلا

Drosophila is an excellent model organism that can be used to screen compounds that might be useful for cancer therapy. The method described here is a ...

Identification of Enhancer-Promoter Contacts in Embryoid Bodies by Quantitative Chromosome Conformation Capture (4C)

Identification of Enhancer-Promoter Contacts in Embryoid Bodies by Quantitative Chromosome Conformation Capture 4C

تحديد جهات اتصال محسن-المروج في الأجسام الجنينية من خلال التقاط تثبيت الكروموسومات الكمية (4C)

During mammalian development, cell fates are determined through the establishment of regulatory networks that define the specificity, timing, and spatial ...

Application of DNA Fingerprinting using the D1S80 Locus in Lab Classes

Application of DNA Fingerprinting using the D1S80 Locus in Lab Classes

تطبيق بصمات الحمض النووي باستخدام الموضع D1S80 في فصول المختبر

In biological sciences, DNA fingerprinting has been widely used for paternity testing, forensic applications and phylogenetic studies. Here, we describe a ...

Investigating the Pathogenesis of MYH7 Mutation Gly823Glu in Familial Hypertrophic Cardiomyopathy using a Mouse Model

التحقيق في التسبب في طفرة MYH7 Gly823Glu في اعتلال عضلة القلب الضخامي العائلي باستخدام نموذج الماوس

Familial hypertrophic cardiomyopathy (HCM, OMIM: 613690) is the most common cardiomyopathy in China. However, the underlying genetic etiology of HCM ...