Name: a non-random mouse model for pharmacological reactivation of mecp2 on the inactive x chromosome
Uploaded: 2019-05-22T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Non-random Mouse Model for Pharmacological Reactivation of Mecp2 on the Inactive X Chromosome at JoVE.com

Forfatterne takker Antonio Bedalov for at levere reagenser; University of Virginia vævs histologi kerne til kryosektionering; University of Virginia flow flowcytometri Core for flow cytometri analyse; Christian Blue og Saloni Singh for teknisk assistance med genotypebestemmelse. Dette arbejde blev støttet af en dobbelt hoo Research Grant til Z.Z., og en pilot Project program Award fra University of Virginia-Virginia Tech Seed fund Award og Hartwell Foundation individuelle biomedicinsk forskning Award til S.B.

Arbejde, der involverer mus, blev godkendt af University of Virginia institutions Komité for dyrepasning og-brug (IACUC; #4112).
1. Generer en ikke-tilfældig XCI Mouse model med genetisk mærket Mecp2 på XI
Bemærk: De muse stammer, der blev anvendt i undersøgelsen, var følgende: Mecp2-gfp/Mecp2-gfp (Mecp2TM 3.1 fugl, materiale oversigt) og xist/δxist (B6; 129-xist < tm5Sado ></...

<ol>
	<li>Lyon, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-chromosome+inactivation+as+a+system+of+gene+dosage+compensation+to+regulate+gene+expression.">X-chromosome inactivation as a system of gene dosage compensation to regulate gene expression.</a> Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology. 36, 119-130 (1989).</li><li>Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delving+into+the+diversity+of+facultative+heterochromatin:+the+epigenetics+of+the+inactive+X+chromosome.">Delving into the diversity of facultative heterochromatin: the epigenetics of the inactive X chromosome.</a> Current Opinion in Genetics Development. 15 (5), 482-489 (2005).</li><li>Augui, S., Nora, E. P., Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+X-chromosome+inactivation+by+the+X-inactivation+centre.">Regulation of X-chromosome inactivation by the X-inactivation centre.</a> Nature Review Genetics. 12 (6), 429-442 (2011).</li><li>Pontier, D. B., Gribnau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xist+regulation+and+function+explored.">Xist regulation and function explored.</a> Human Genetics. 130 (2), 223-236 (2011).</li><li>Barnes, C., Kanhere, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+RNA-Protein+Interactions+Through+In+Vitro+RNA+Pull-Down+Assays.">Identification of RNA-Protein Interactions Through In Vitro RNA Pull-Down Assays.</a> Methods in Molecular Biology. 1480, 99-113 (2016).</li><li>McHugh, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Xist+lncRNA+interacts+directly+with+SHARP+to+silence+transcription+through+HDAC3.">The Xist lncRNA interacts directly with SHARP to silence transcription through HDAC3.</a> Nature. 521 (7551), 232-236 (2015).</li><li>Minajigi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomes.+A+comprehensive+Xist+interactome+reveals+cohesin+repulsion+and+an+RNA-directed+chromosome+conformation.">Chromosomes. A comprehensive Xist interactome reveals cohesin repulsion and an RNA-directed chromosome conformation.</a> Science. 349 (6245), (2015).</li><li>Mira-Bontenbal, H., Gribnau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Xist-Interacting+Proteins+in+X-Chromosome+Inactivation.">New Xist-Interacting Proteins in X-Chromosome Inactivation.</a> Current Biology. 26 (8), R338-R342 (2016).</li><li>Mira-Bontenbal, H., Gribnau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Xist-Interacting+Proteins+in+X-Chromosome+Inactivation.">New Xist-Interacting Proteins in X-Chromosome Inactivation.</a> Curren Biology. 26 (10), 1383 (2016).</li><li>Ridings-Figueroa, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nuclear+matrix+protein+CIZ1+facilitates+localization+of+Xist+RNA+to+the+inactive+X-chromosome+territory.">The nuclear matrix protein CIZ1 facilitates localization of Xist RNA to the inactive X-chromosome territory.</a> Genes and Development. 31 (9), 876-888 (2017).</li><li>Sunwoo, H., Colognori, D., Froberg, J. E., Jeon, Y., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repeat+E+anchors+Xist+RNA+to+the+inactive+X+chromosomal+compartment+through+CDKN1A-interacting+protein+(CIZ1).">Repeat E anchors Xist RNA to the inactive X chromosomal compartment through CDKN1A-interacting protein (CIZ1).</a> Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. , (2017).</li><li>Bhatnagar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+pharmacological+reactivation+of+the+mammalian+inactive+X+chromosome.">Genetic and pharmacological reactivation of the mammalian inactive X chromosome.</a> Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (35), 12591-12598 (2014).</li><li>Zoghbi, H. Y., Percy, A. K., Schultz, R. J., Fill, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+X+chromosome+inactivation+in+the+Rett+syndrome.">Patterns of X chromosome inactivation in the Rett syndrome.</a> Brain Development. 12 (1), 131-135 (1990).</li><li>Anvret, M., Wahlstrom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rett+syndrome:+random+X+chromosome+inactivation.">Rett syndrome: random X chromosome inactivation.</a> Clinical Genetics. 45 (5), 274-275 (1994).</li><li>Amir, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rett+syndrome+is+caused+by+mutations+in+X-linked+MECP2,+encoding+methyl-CpG-binding+protein+2.">Rett syndrome is caused by mutations in X-linked MECP2, encoding methyl-CpG-binding protein 2.</a> Nature Genetics. 23 (2), 185-188 (1999).</li><li>Przanowski, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+reactivation+of+inactive+X-linked+Mecp2+in+cerebral+cortical+neurons+of+living+mice.">Pharmacological reactivation of inactive X-linked Mecp2 in cerebral cortical neurons of living mice.</a> Proceedings of Natlional Academy of Sciences of the United States of America. 115 (31), 7991-7996 (2018).</li><li>Borensztein, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xist-dependent+imprinted+X+inactivation+and+the+early+developmental+consequences+of+its+failure.">Xist-dependent imprinted X inactivation and the early developmental consequences of its failure.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 24 (3), 226-233 (2017).</li><li>Jensen, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+histological+staining+and+fluorescence+using+ImageJ.">Quantitative analysis of histological staining and fluorescence using ImageJ.</a> Anatomical Record (Hoboken). 296 (3), 378-381 (2013).</li><li>Cseke, L. J., Talley, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+PCR-based+genotyping+method+to+distinguish+between+wild-type+and+ornamental+varieties+of+Imperata+cylindrica.">A PCR-based genotyping method to distinguish between wild-type and ornamental varieties of Imperata cylindrica.</a> Journal of Visualized Experiments. (60), (2012).</li></ol>

Tidligere blev Xcif'er, der selektivt kræves til hæmning af XI-linkede gener i pattedyrs kvindelige celler, identificeret12. Vi yderligere optimeret potente små molekyle hæmmere til at målrette XCIFs, såsom ACVR1 og downstream effektorer af PDPK1, som effektivt genaktivere XI-linked Mecp2 i mus fibroblast cellelinjer, mus kortikale neuroner, og en menneskelig fibroblast celle afledt af en RTT-patient. Disse resultater tyder på, at XI reaktivering er en plausibel terapeutisk tilgang...

X kromosom inaktivering (XCI) er en proces af dosering kompensation, der balancerer X-linked genekspression ved at genhæmning en kopi af X-kromosomet hos kvinder1. Som følge heraf akkumulerer det inaktive X-kromosom (XI) karakteristiske træk ved heterokromatin, herunder DNA-methylering og hæmmende histonmodifikationer, såsom Histon H3-lysin 27 trimethylering (H3K27me3) og Histon H2A ubiquitination (H2Aub) 2. den overordnede regulator af x-kromosom hæmning er x-inaktiverings Center (xic)-regionen, ca. 100 − 500 kb, som styrer optællingen og parringen af x-kromosomerne, det tilfældige valg af x-kromosom til inaktivering og initiering og spredning af genhæmning langs X-kromosomet3. Processen med X inaktivering initieres af X inaktiv specifik afskrift (Xist), der frakker XI i CIS til at mægle kromosom-dækkende lyddæmpnings-og omforme den tredimensionale struktur af x-kromosom4. For nylig har flere protemiske og genetiske skærme identificeret yderligere regulatorer af XCI, såsom xist interagerende proteiner5,6,7,8,9 , 10 stk. , 11 af , 12. for eksempel, en tidligere undersøgelse ved hjælp af en upartisk genom-dækkende RNA interferens skærm identificeret 13 Trans-virkende XCI faktorer (xcifs)12. Mekanisk, XCIFs regulerer Xist udtryk og derfor interfererer med xcifs funktion forårsager defekt XCI12. Sammen har de seneste fremskridt på området givet vigtig indsigt i de molekylære maskiner, der er nødvendige for at initiere og vedligeholde XCI.
Identifikation af XCI regulatorer og forståelse af deres mekanisme i XCI er direkte relevant for X-linked humane sygdomme, såsom RETT syndrom (RTT)13,14. RTT er en sjælden Neuro udviklende lidelse forårsaget af en heterozygot mutation i det X-linkede methyl-CpG-bindingsprotein 2 (MECP2), der påvirker overvejende piger15. Da MECP2 er placeret på X-kromosomet, er RTT-pigerne heterozygot for MECP2 mangel med ~ 50% celler, der udtrykker vildtype og ~ 50% udtrykker mutant MECP2. Især RTT mutant celler havn en sovende, men vild-type kopi af Mecp2 på XI, der giver en kilde til det funktionelle gen, som hvis reaktiveret, kunne potentielt lindre symptomer på sygdommen. Ud over RTT, der er flere andre X-linked menneskelige sygdomme, for hvilke reaktivering af XI repræsenterer en potentiel terapeutisk tilgang, såsom DDX3X syndrom.
Hæmning af XCIFs, 3-phosphoinositide afhængige protein kinase-1 (PDPK1) og Activity A receptor type 1 (ACVR1), enten ved kort hårnål RNA (shRNA) eller små Molekylær hæmmere, genaktiverer XI-sammenkædede gener12. Farmakologisk reaktivering af XI-linkede gener observeres i forskellige ex vivo modeller, der omfatter muse fibroblast cellelinjer, voksne mus kortikale neuroner, mus embryonale fibroblaster, og fibroblast cellelinjer afledt af en RTT patient12. Det er dog endnu ikke påvist, om farmakologisk reaktivering af XI-linkede gener er gennemførlig in vivo. En begrænsende faktor er manglen på effektive dyremodeller til nøjagtigt at måle ekspressionen af gener fra genaktiveret XI. Mod dette mål, en Xistδ: Mecp2/Xist: Mecp2-Gfp musemodel er blevet genereret, der bærer en genetisk mærket Mecp2 på XI i alle cellerne på grund af heterozygot sletning i Xist på maternel X kromosom16. Ved hjælp af denne model, er udtrykket af Mecp2 fra XI blevet kvantiteret efter behandling med XCIFs hæmmere i hjernen af levende mus. Her er den generation af xistδ: Mecp2/xist: Mecp2-gfp musemodel og metodologi til kvantitat XI reaktivering i kortikale neuroner ved hjælp af immunofluorescens-baserede analyser beskrevet.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >MICE</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mecp2tm3.1Bird</td>
			<td >The Jackson Laboratory</td>
			<td>#014610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >B6;129-Xist (tm5Sado)</td>
			<td>provided by Antonio Bedalov, Fred Hutchinson Cancer Center, Seattle</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >REAGENTS</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >22x22 mm coverslip</td>
			<td >FISHERfinest (Fisher Scientific)</td>
			<td >125488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >32% Paraformaldehyde</td>
			<td >Electron Microscopy Sciences</td>
			<td >15714-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >50 ml syringe</td>
			<td>Medline Industries</td>
			<td>NPMJD50LZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >60mm culture dish</td>
			<td >CellStar</td>
			<td >628160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >7-AAD </td>
			<td >BioLegend</td>
			<td >420403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ammonium chloride (NH4Cl)</td>
			<td >Fisher Chemical</td>
			<td >A661-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >anti-GFP-AlexaFluor647</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td >A-31852</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >anti-MAP2</td>
			<td >Aves Labs</td>
			<td >MAP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >BSA</td>
			<td >Promega</td>
			<td >R396D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Buprenorphine SR</td>
			<td >Zoopharm</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >citric acid </td>
			<td >Sigma</td>
			<td >C-1857</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DMSO</td>
			<td >Fisher Bioreagents</td>
			<td >BP231-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td >Corning Cellgro</td>
			<td >10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethanol</td>
			<td >Decon Labs</td>
			<td >2701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td >VWR Life Science</td>
			<td>89510-198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >gelatin</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >G9391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >glass slides</td>
			<td >Fisherbrand</td>
			<td >22-034-486</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >goat anti-chicken FITC-labeled secondary antibody </td>
			<td >Aves Labs</td>
			<td >F-1005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >GSK650394</td>
			<td >ApexBio</td>
			<td >B1051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >hamilton 10&#956;l syringe </td>
			<td >Hamilton Sigma-Aldrich</td>
			<td >28615-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >14025-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ketamine</td>
			<td>Ketaset</td>
			<td>NDC 0856-2013-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Large blunt/blunt curved scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14519-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >LDN193189</td>
			<td >Cayman Chemicals</td>
			<td >11802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >lodixanol</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >1343517</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >magnesium chloride (MgCl2)</td>
			<td >Fisher Chemical</td>
			<td >M35-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Methylcelulose</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >M0262-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >mounting medium with DAPI </td>
			<td >Vectashield</td>
			<td >H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Needle tip, 26 GA x 1.25&#34;</td>
			<td >PrecisionGlide</td>
			<td >305111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ophthalmic ointment </td>
			<td >Refresh Lacri-Lube</td>
			<td >93468</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >optimal cutting temperature (O.C.T.) </td>
			<td >ThermoFisher</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PCR mix</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep)</td>
			<td >Corning</td>
			<td >30-002-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Phosphate buffered saline pH 7.4 (PBS)</td>
			<td >Corning Cellgro</td>
			<td >46-103-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Potassium chloride (KCl)</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >P330-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >scalpel blades</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Shallow glass or plastic tray</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >skin glue/tissue adhesive</td>
			<td >3M Vetbond</td>
			<td >1469SB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >sodium azide</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >CAS 26628-22-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td >Fisher Chemical</td>
			<td >S642-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >standard hemostat forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>13013-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Standard tweezers</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11027-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Straight iris scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14058-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >sucrose</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >BP220-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tris-base</td>
			<td >Fisher Bioreagents</td>
			<td >BP152-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Triton X-100</td>
			<td >Fisher Bioreagents</td>
			<td >BP151-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypsin-EDTA </td>
			<td >Gibco</td>
			<td >15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Xylazine</td>
			<td >Akorn</td>
			<td>NDC: 59399-111-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EQUIPMENT</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Zeiss AxioObserver Live-Cell microscope </td>
			<td >Zeiss</td>
			<td >Zeiss AxioObserver</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.45mm burr</td>
			<td >IDEAL MicroDrill</td>
			<td >67-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >BD FACScalibur</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >centrifuge</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >glass homogenizer</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >cell culture incubator</td>
			<td >Thermo Scientific HERACELL VIOS 160i</td>
			<td >13-998-213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Leica 3050S research cryostat </td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >stereotactic platform </td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >thermocycler</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Timer</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ultracentrifuge</td>
			<td >Beckman Coulter Optima L-100 XP</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Water bath (37 &#186;C)</td>
			<td >Fisher Scientific Isotemp 2239</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a non-random mouse model for pharmacological reactivation of mecp2 on the inactive x chromosome

X kromosom inaktivering (XCI) er den tilfældige hæmning af et X kromosom hos kvinder for at opnå gendose ring balance mellem kønnene. Som et resultat, alle kvinder er heterozygot for X-linked genekspression. En af de vigtigste regulatorer af XCI er Xist, som er afgørende for initiering og vedligeholdelse af XCI. Tidligere undersøgelser har identificeret 13 Trans Acting X kromosom inaktiverings faktorer (Xcif'er) ved hjælp af en storstilet, tab-af-funktion genetisk skærm. Hæmning af Xcif'er, såsom ACVR1 og PDPK1, ved hjælp af kort Hårnåle RNA eller små molekyler hæmmere, genaktiverer X kromosom-sammenkædede gener i dyrkede celler. Men gennemførligheden og tolerabiliteten af reaktivering af det inaktive X-kromosom in vivo er endnu ikke fastlagt. Mod dette mål, en Xistδ: Mecp2/Xist: Mecp2-Gfp musemodel er blevet genereret med ikke-tilfældige XCI på grund af sletning af Xist på en X kromosom. Ved hjælp af denne model var omfanget af inaktiv X-reaktivering kvantiteret i muse hjernen efter behandling med XCIF-hæmmere. Nyligt offentliggjorte resultater viser for første gang, at farmakologisk hæmning af XCIFs genaktiverer Mecp2 fra det inaktive X-kromosom i kortikale neuroner i den levende musehjerne.

For at påvise gennemførligheden af Xistδ: Mecp2/Xist: Mecp2-Gfp -musemodel for XI-reaktiverings undersøgelser, blev xcif-inhibitor-medieret reaktivering af XI-linked Mecp2-gfp testet i Foster embryonale fibroblaster (mefs). Kvindelige Mef'er blev isoleret fra dag 15,5 Xistδ: Mecp2/Xist: Mecp2-Gfp- embryoner som beskrevet i punkt 3 (figur 1a). De genotyper af kvindelige Xistδ: Mecp2/Xist: Mecp2-Gfp mefs blev bekræftet ved genotypi...

Watch this Scientific Journal Video about A Non-random Mouse Model for Pharmacological Reactivation of Mecp2 on the Inactive X Chromosome at JoVE.com

A Non-random Mouse Model for Pharmacological Reactivation of Mecp2 on the Inactive X Chromosome

Her beskriver vi en protokol til at generere en levedygtig kvindelig murine model med ikke-tilfældige X kromosom inaktivering, dvs., det maternally-nedarvede X-kromosom er inaktiv i 100% af cellerne. Vi beskriver også en protokol til afprøvning af gennemførlighed, tolerabilitet og sikkerhed ved farmakologisk reaktivering af det inaktive X-kromosom in vivo.

En ikke-tilfældig muse model for farmakologisk reaktivering af Mecp2 på inaktiv X-kromosom

X chromosome inactivation (XCI) is the random silencing of one X chromosome in females to achieve gene dosage balance between the sexes. As a result, all ...

Denne protokol kan bruges til at generere en ikke-tilfældig musemodel til test og kvantificering af reaktivering af det inaktive X-forbundne Mecp2-kromosom i hjernen på en levende mus. Denne model kan let ændres for at studere Xi reaktivering i andre X-linked sygdom modeller såsom DDX3X syndrom. Jeg er en post doc i Sanchita Bhatnagar's laboratorium, og jeg vil demonstrere proceduren med Zeming Zheng.Begynd med at placere den bedøvede mus i en stereotaktisk platform med fortænderne hooked i bid bar af snuden fastholdende. Stram næseklemmen, mens musens hoved holdes på et planplan. Juster højden af ørestængerne for at nå caudal del af øregangen for at holde hovedet immobiliseret.Derefter desinficere hovedet med skiftevis klude af et aktuelt antiseptisk og 70% ethanol. Når musen er klar, skal du bruge en steril skalpel til at lave et 0,75 centimeter vandret snit i midterskald. Brug en 0,45 millimeter grat til at bore to symmetriske huller over højre og venstre kortikale halvkugler to millimeter fra sagittal sutur og lambdoid sutur i den omtrentlige midten af parietal knoglen.Fastgør en 10 mikrolitersprøjte til den stereotaktiske platform, og læg 10 mikroliter frisklavet kemisk hæmmer i sprøjten. Fremføring nålen ind i det første grathul, mens nålen er vinkelret på kraniet. Når nålen krydser kraniet, skal du nulstille koordinaterne på det stereotaktiske digitale display og fremme spidsen af nålen, indtil den når en dybde på 2,5 millimeter.Træk nålen 0,5 millimeter til en dybde på to millimeter og langsomt injicere hele 10 mikroliter volumen af opløsningen over en periode på et minut. Når hele inhibitoren er leveret, skal nålen efterlades i hjernen i endnu et minut, før nålen trækkes tilbage. Gentag injektionen i det andet grathul ved hjælp af køretøjet kun som en kontrol og luk huden over snittet.Overfør derefter musen fra det stereotaktiske apparat på en 37 grader Celsius varmepude med overvågning, indtil den er fuld helbredelse. Ved afslutningen af dosisregimet skal du fastgøre musen på en dissekeringspude. Brug saks og kraftbefængte til at foretage et lateralt snit gennem integument og bugvæggen lige under brystkassen.Forsigtigt adskille leveren fra mellemgulvet og skæres gennem mellemgulvet langs hele længden af brystkassen til at udsætte pleural hulrum. Brug saksen til at foretage et snit i den bageste ende af venstre hjertekammer og straks injicere højre hjertekammer med ca 15 milliliter PBS over en to-minutters periode. En vellykket perfusion vil resultere i en lever farveændring fra rød til lyserød.Når alle PBS er leveret, gennemgå hjertet med ca. 10 milliliter 4% paraformaldehyd i PBS over to minutter. Efter høst hovedet, bruge en saks til at gøre en midterlinjen snit i hovedbunden til at udsætte kraniet. Placer en spids af saksen i foramen magnum at lette oprettelsen af et lateralt snit i kraniet mod øjet.Lav et lignende snit på den anden side af kraniet holde slutningen af saksen så overfladisk som muligt og skære regionen af kraniet mellem øjnene og over næsen af musen. Brug scein til forsigtigt at skrælle kranieknoglerne fra hjernehalvdel og bruge en spatel til at løfte hjernen. Forsigtigt dissekere kranienerverfibre, der fastsætter hjernen til kraniet og placere hjernen i en plastik skål.Derefter punktafgifter lillehjernen og olfaktoriske pærer. For at opnå dele af hjernevævet, først fastsætte hjernen i en 15 milliliter rør fyldt med 4% paraformaldehyd i PBS ved fire grader Celsius natten over. Den næste morgen, skyl hjernevævet mindst tre gange i fem minutter ved fire grader Celsius i frisk PBS per vask.Efter den sidste vask, fjerne forsiden af hver halvkugle med saks og scer og scer og placere prøverne i mærket kryo-forme forsiden nedad. Nedsænk hvert væv i optimal skæretemperatur medium før snap frysning prøverne i flydende nitrogen i en 10 millimeter plast petriskål for minus 80 grader Celsius opbevaring. For at bestemme Xi reaktivering, nedsænke fem til seks mikrometer hjernevæv sektioner i antigen hentning løsning i fem minutter på en 100 grader Celsius varmeblok.Ved inkubationens afslutning vaskes objektglassene med fire fem minutters vask ved stuetemperatur med frisk PBS pr. vask, før rutsjebanerne nedsænkes i blokerende opløsning. Efter 20 minutter ved stuetemperatur vaskes objektglassene tre gange i fem minutter i frisk vaskepude pr. vask. Plet vævsprøver med de relevante primære antistoffer ved fire grader Celsius natten over.Billede dias på en fluorescens mikroskop justere kontrast og lysstyrke til at tillade kvantificering af antallet af GFP positive celler for både narkotika og køretøj behandlet mus hjernehalvdel. For at påvise gennemførligheden af den ikke-tilfældige X-kromosominaktiveringsmusmodel for inaktive X-kromosomreaktiveringsundersøgelser blev genotyperne af kvindelige transgene museembryoner fibroblast bekræftet ved genotypebestemmelse af PCR og flowcytometri. Som vurderet af PCR blev ekspressionen af GFP-mærket methylen CPG-bindende protein to-gen eller MECP2 genaktiveret ved hjælp af lægemidler, men ikke behandling af køretøjer.Ikke-tilfældige X-kromosominaktiveringsmusmodel embryonale fibroblaster udtrykte også nukleare GFP efter narkotika, men ikke behandling af køretøjer, der demonstrerer X-kromosominaktiveringsfaktorhæmmerne, genaktiverer inaktiveret X-kromosom forbundet MECP2 i museembryiniske fibroblaster. Narkotikabehandling genaktiverer inaktiveret X-kromosom MECP2-GFP i omkring 30% af cellerne i narkotika infunderes hjernehalvdel, mens ingen reaktivering er opdaget i køretøjet infunderes halvkugler. Mikrotubule-associeret protein to positive neuroner er også GFP positive i lægemiddelbehandlede halvkugler, der indikerer inaktiveret X-kromosom MECP2-GFP udtryk.Lægemidlet regime vil være afhængig af målet og effekten af de små molekyle hæmmere så optimere dosis og behandling in vitro før test in vivo. Den ikke-tilfældige musemodel kan udnyttes til at teste forskellige lægemidler enten individuelt eller i kombination. Faktisk har vi og andre identificeret flere druggable X kromosom inaktivering faktorer.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Molecular Biology

Genetics

Unit 2

Mendelian Genetics

SCIENTISTS IN ACTION

Conjugative Mating Assays for Sequence-specific Analysis of Transfer Proteins Involved in Bacterial Conjugation

Konjugering Parring Analyser for Sekvens-specifik analyse af Transfer proteiner involveret i konjugation

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia ...

Pooled shRNA Screen for Reactivation of MeCP2 on the Inactive X Chromosome

Poolet shRNA skærmen for reaktivering af MeCP2 på det inaktive X kromosom

Forward genetic screens using reporter genes inserted into the heterochromatin have been extensively used to investigate mechanisms of epigenetic control ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

Høj overførselshastighed identifikation af regulerende gensekvenser ved hjælp af næste generations sekventering af cirkulære kromosom kropsbygning Capture (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

Gensplejsning af Dictyostelium discoideum celler baseret på udvælgelse og vækst på bakterier

Dictyostelium discoideum is an intriguing model organism for the study of cell differentiation processes during development, cell signaling, and other ...

Mass Spectrometry-Based Proteomics Analyses Using the OpenProt Database to Unveil Novel Proteins Translated from Non-Canonical Open Reading Frames

Massespektrometri-baseret Proteomics analyser ved hjælp af OpenProt Database til at afsløre nye proteiner oversat fra ikke-kanoniske åbne læserammer

Genome annotation is central to today's proteomic research as it draws the outlines of the proteomic landscape. Traditional models of open reading frame ...

A Robust Polymerase Chain Reaction-based Assay for Quantifying Cytosine-guanine-guanine Trinucleotide Repeats in Fragile X Mental Retardation-1 Gene

En robust polymerase kæde reaktions baseret analyse til kvantificering af cytosin-guanin-guanin-Trinucleotid gentages i skrøbelig X mental retardering-1 gen

Fragile X syndrome (FXS) and associated disorders are caused by expansion of the cytosine-guanine-guanine (CGG) trinucleotide repeat in the 5&#8217; ...

A Screening Method for Identification of Heterochromatin-Promoting Drugs Using Drosophila

A Screening Method for Identification of Heterochromatin-Promoting Drugs Using Drosophila

En screeningmetode til identifikation af heterokratinfremmende stoffer ved hjælp af Drosophila

Drosophila is an excellent model organism that can be used to screen compounds that might be useful for cancer therapy. The method described here is a ...

Identification of Enhancer-Promoter Contacts in Embryoid Bodies by Quantitative Chromosome Conformation Capture (4C)

Identification of Enhancer-Promoter Contacts in Embryoid Bodies by Quantitative Chromosome Conformation Capture 4C

Identifikation af forstærker-promotor kontakter i embryolede organer ved kvantitative kromosom kropsbygning Capture (4C)

During mammalian development, cell fates are determined through the establishment of regulatory networks that define the specificity, timing, and spatial ...

Application of DNA Fingerprinting using the D1S80 Locus in Lab Classes

Application of DNA Fingerprinting using the D1S80 Locus in Lab Classes

Anvendelse af DNA Fingeraftryk ved hjælp af D1S80 Locus i Lab Klasser

In biological sciences, DNA fingerprinting has been widely used for paternity testing, forensic applications and phylogenetic studies. Here, we describe a ...

Investigating the Pathogenesis of MYH7 Mutation Gly823Glu in Familial Hypertrophic Cardiomyopathy using a Mouse Model

Undersøgelse af patogenesen af MYH7-mutationen Gly823Glu i familiær hypertrofisk kardiomyopati ved hjælp af en musemodel

Familial hypertrophic cardiomyopathy (HCM, OMIM: 613690) is the most common cardiomyopathy in China. However, the underlying genetic etiology of HCM ...