Name: a non-random mouse model for pharmacological reactivation of mecp2 on the inactive x chromosome
Uploaded: 2019-05-22T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Non-random Mouse Model for Pharmacological Reactivation of Mecp2 on the Inactive X Chromosome at JoVE.com

De auteurs bedanken Antonio Bedalov voor het verstrekken van reagentia; Universiteit van Virginia weefsel de kern van de histologie voor cryosectioning; Universiteit van Virginia flow Cytometry core voor flow Cytometry analyse; Christian Blue en de van de technische hulp bij het genotypen Singh. Dit werk werd ondersteund door een dubbele Hoo Research Grant aan Z.Z., en een pilot project programma Award van de Universiteit van Virginia-Virginia Tech Seed Fund Award en de Hartwell Foundation individuele biomedische onderzoek Award aan S.B.

Het werk dat muizen impliceert werd goedgekeurd door de Universiteit van Virginia Institutional de zorg van het dier en het gebruiks Comité (DEC; #4112).
1. Genereer een niet-Random XCI muis model met genetisch gelabelde Mecp2 op XI
Opmerking: De stammen van de muis die in de studie worden gebruikt waren als volgt: Mecp2-GFP/Mecp2-GFP (Mecp2TM 3.1 vogel, lijst van materialen) en xist/ΔXist</...

<ol>
	<li>Lyon, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-chromosome+inactivation+as+a+system+of+gene+dosage+compensation+to+regulate+gene+expression.">X-chromosome inactivation as a system of gene dosage compensation to regulate gene expression.</a> Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology. 36, 119-130 (1989).</li><li>Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delving+into+the+diversity+of+facultative+heterochromatin:+the+epigenetics+of+the+inactive+X+chromosome.">Delving into the diversity of facultative heterochromatin: the epigenetics of the inactive X chromosome.</a> Current Opinion in Genetics Development. 15 (5), 482-489 (2005).</li><li>Augui, S., Nora, E. P., Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+X-chromosome+inactivation+by+the+X-inactivation+centre.">Regulation of X-chromosome inactivation by the X-inactivation centre.</a> Nature Review Genetics. 12 (6), 429-442 (2011).</li><li>Pontier, D. B., Gribnau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xist+regulation+and+function+explored.">Xist regulation and function explored.</a> Human Genetics. 130 (2), 223-236 (2011).</li><li>Barnes, C., Kanhere, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+RNA-Protein+Interactions+Through+In+Vitro+RNA+Pull-Down+Assays.">Identification of RNA-Protein Interactions Through In Vitro RNA Pull-Down Assays.</a> Methods in Molecular Biology. 1480, 99-113 (2016).</li><li>McHugh, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Xist+lncRNA+interacts+directly+with+SHARP+to+silence+transcription+through+HDAC3.">The Xist lncRNA interacts directly with SHARP to silence transcription through HDAC3.</a> Nature. 521 (7551), 232-236 (2015).</li><li>Minajigi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomes.+A+comprehensive+Xist+interactome+reveals+cohesin+repulsion+and+an+RNA-directed+chromosome+conformation.">Chromosomes. A comprehensive Xist interactome reveals cohesin repulsion and an RNA-directed chromosome conformation.</a> Science. 349 (6245), (2015).</li><li>Mira-Bontenbal, H., Gribnau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Xist-Interacting+Proteins+in+X-Chromosome+Inactivation.">New Xist-Interacting Proteins in X-Chromosome Inactivation.</a> Current Biology. 26 (8), R338-R342 (2016).</li><li>Mira-Bontenbal, H., Gribnau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Xist-Interacting+Proteins+in+X-Chromosome+Inactivation.">New Xist-Interacting Proteins in X-Chromosome Inactivation.</a> Curren Biology. 26 (10), 1383 (2016).</li><li>Ridings-Figueroa, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nuclear+matrix+protein+CIZ1+facilitates+localization+of+Xist+RNA+to+the+inactive+X-chromosome+territory.">The nuclear matrix protein CIZ1 facilitates localization of Xist RNA to the inactive X-chromosome territory.</a> Genes and Development. 31 (9), 876-888 (2017).</li><li>Sunwoo, H., Colognori, D., Froberg, J. E., Jeon, Y., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repeat+E+anchors+Xist+RNA+to+the+inactive+X+chromosomal+compartment+through+CDKN1A-interacting+protein+(CIZ1).">Repeat E anchors Xist RNA to the inactive X chromosomal compartment through CDKN1A-interacting protein (CIZ1).</a> Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. , (2017).</li><li>Bhatnagar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+pharmacological+reactivation+of+the+mammalian+inactive+X+chromosome.">Genetic and pharmacological reactivation of the mammalian inactive X chromosome.</a> Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (35), 12591-12598 (2014).</li><li>Zoghbi, H. Y., Percy, A. K., Schultz, R. J., Fill, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+X+chromosome+inactivation+in+the+Rett+syndrome.">Patterns of X chromosome inactivation in the Rett syndrome.</a> Brain Development. 12 (1), 131-135 (1990).</li><li>Anvret, M., Wahlstrom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rett+syndrome:+random+X+chromosome+inactivation.">Rett syndrome: random X chromosome inactivation.</a> Clinical Genetics. 45 (5), 274-275 (1994).</li><li>Amir, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rett+syndrome+is+caused+by+mutations+in+X-linked+MECP2,+encoding+methyl-CpG-binding+protein+2.">Rett syndrome is caused by mutations in X-linked MECP2, encoding methyl-CpG-binding protein 2.</a> Nature Genetics. 23 (2), 185-188 (1999).</li><li>Przanowski, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+reactivation+of+inactive+X-linked+Mecp2+in+cerebral+cortical+neurons+of+living+mice.">Pharmacological reactivation of inactive X-linked Mecp2 in cerebral cortical neurons of living mice.</a> Proceedings of Natlional Academy of Sciences of the United States of America. 115 (31), 7991-7996 (2018).</li><li>Borensztein, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xist-dependent+imprinted+X+inactivation+and+the+early+developmental+consequences+of+its+failure.">Xist-dependent imprinted X inactivation and the early developmental consequences of its failure.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 24 (3), 226-233 (2017).</li><li>Jensen, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+histological+staining+and+fluorescence+using+ImageJ.">Quantitative analysis of histological staining and fluorescence using ImageJ.</a> Anatomical Record (Hoboken). 296 (3), 378-381 (2013).</li><li>Cseke, L. J., Talley, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+PCR-based+genotyping+method+to+distinguish+between+wild-type+and+ornamental+varieties+of+Imperata+cylindrica.">A PCR-based genotyping method to distinguish between wild-type and ornamental varieties of Imperata cylindrica.</a> Journal of Visualized Experiments. (60), (2012).</li></ol>

Eerder, XCIFs die selectief worden vereist voor het silencing van XI-gelinkte genen in zoogdieren vrouwelijke cellen werden geïdentificeerd12. We verder geoptimaliseerd krachtige kleine molecule-remmers te richten XCIFs, zoals ACVR1 en downstream-effects van PDPK1, die efficiënt opnieuw activeren XI-linked Mecp2 in de muis fibroblast cel lijnen, muis corticale neuronen, en een menselijke fibroblast cel lijn afgeleid van een RTT patiënt. Deze resultaten suggereren dat XI reactivering is...

X-chromosoom inactivatie (XCI) is een proces van dosering compensatie die X-gebonden genexpressie door silencing een kopie van het X-chromosoom in vrouwen1balanceert. Dientengevolge, accumuleert het inactieve X-chromosoom (XI) kenmerkende eigenschappen van heterochromatin met inbegrip van Methylation van DNA en remmende histone wijzigingen, zoals histone H3-lysine 27 trimethylation (H3K27me3) en histone H2A Ubiquitination (H2Aub) 2. de kapitein regulator van x-chromosoom silencing is de x-inactivatie Center (Xic) regio, ongeveer 100 − 500 KB, die het tellen en koppelen van de x-chromosomen, de willekeurige keuze van het x-chromosoom voor inactivatie controles, en de initiatie en uitspreiden van silencing langs het X-chromosoom3. Het proces van X inactivatie wordt geïnitieerd door X inactief specifieke transcriptie (xist) dat jassen de XI in CIS te bemiddelen chromosoom-brede silencing en remodelleren de driedimensionale structuur van het X-chromosoom4. Onlangs hebben verschillende Proteomic en genetische schermen geïdentificeerd extra regulatoren van XCI, zoals xist interactie eiwitten5,6,7,8,9 , 10 , 11 , 12. bijvoorbeeld, een eerdere studie met behulp van een onbevooroordeelde genoom-Wide RNA interferentie scherm geïdentificeerd 13 trans-Acting XCI factoren (XCIFs)12. Mechanistically, XCIFs reguleren xist expressie en dus interfereren met XCIFs functie veroorzaakt defecte XCI12. Samen, hebben de recente vooruitgang op het gebied belangrijke inzichten in de moleculaire machines verstrekt die nodig zijn om XCI in werking te stellen en te handhaven.
Identificatie van XCI regulators en het begrijpen van hun mechanisme in XCI is direct relevant voor X-gebonden ziekten van de mens, zoals RETT syndroom (RTT)13,14. RTT is een zeldzame neurologische aandoening veroorzaakt door een zygoot mutatie in de X-gebonden methyl-CpG bindende proteïne 2 (MECP2) die hoofdzakelijk van invloed op meisjes15. Omdat MECP2 is gelegen op het X-CHROMOSOOM, RTT meisjes zijn zygoot voor MECP2 deficiëntie met ~ 50% cellen uitdrukken wild-type en ~ 50% uitdrukken Mutant MECP2. Met name, RTT mutantcellen Harbor een slapende maar wild-type kopie van Mecp2 op de XI, het verstrekken van een bron van het functionele gen, die, indien gereactiveerd, zou kunnen verlichten de symptomen van de ziekte. Naast RTT, zijn er verscheidene andere X-verbonden menselijke ziekten, waarvoor de reactivering van XI een potentiële therapeutische benadering, zoals DDX3X syndroom vertegenwoordigt.
Remming van XCIFs, 3-phosphoinositide afhankelijke proteïne kinase-1 (PDPK1), en activin een receptortype 1 (ACVR1), of door korte haarspeld RNA (shRNA) of kleine molecule inhibitors, reactiveert XI-verbonden genen12. Farmacologische reactivering van XI-gebonden genen wordt waargenomen in verschillende ex vivo modellen die muis fibroblast cel lijnen, volwassen muis corticale neuronen, muis embryonale fibroblasten, en fibroblast cel lijnen afgeleid van een RTT patiënt12omvatten. Echter, of farmacologische reactivering van XI-gelinkte genen haalbaar is in vivo nog moet worden aangetoond. Één beperkende factor is het gebrek aan efficiënte dierlijke modellen om de uitdrukking van genen van gereactiveerd XI nauwkeurig te meten. Naar dit doel, een XistΔ: Mecp2/xist: Mecp2-GFP muismodel is gegenereerd dat draagt een genetisch gelabelde Mecp2 op XI in alle cellen als gevolg van zygoot schrapping in xist op de moeder X-chromosoom16. Gebruikend dit model, is de uitdrukking van Mecp2 van XI quantitated na behandeling met XCIFs inhibitors in de hersenen van het leven muizen geweest. Hier, de generatie van de XistΔ: Mecp2/xist: Mecp2-GFP muismodel en methodologie om quantitate XI reactivering in corticale neuronen met behulp van immunofluorescentie-gebaseerde assays wordt beschreven.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >MICE</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mecp2tm3.1Bird</td>
			<td >The Jackson Laboratory</td>
			<td>#014610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >B6;129-Xist (tm5Sado)</td>
			<td>provided by Antonio Bedalov, Fred Hutchinson Cancer Center, Seattle</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >REAGENTS</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >22x22 mm coverslip</td>
			<td >FISHERfinest (Fisher Scientific)</td>
			<td >125488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >32% Paraformaldehyde</td>
			<td >Electron Microscopy Sciences</td>
			<td >15714-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >50 ml syringe</td>
			<td>Medline Industries</td>
			<td>NPMJD50LZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >60mm culture dish</td>
			<td >CellStar</td>
			<td >628160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >7-AAD </td>
			<td >BioLegend</td>
			<td >420403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ammonium chloride (NH4Cl)</td>
			<td >Fisher Chemical</td>
			<td >A661-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >anti-GFP-AlexaFluor647</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td >A-31852</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >anti-MAP2</td>
			<td >Aves Labs</td>
			<td >MAP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >BSA</td>
			<td >Promega</td>
			<td >R396D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Buprenorphine SR</td>
			<td >Zoopharm</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >citric acid </td>
			<td >Sigma</td>
			<td >C-1857</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DMSO</td>
			<td >Fisher Bioreagents</td>
			<td >BP231-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td >Corning Cellgro</td>
			<td >10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethanol</td>
			<td >Decon Labs</td>
			<td >2701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td >VWR Life Science</td>
			<td>89510-198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >gelatin</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >G9391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >glass slides</td>
			<td >Fisherbrand</td>
			<td >22-034-486</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >goat anti-chicken FITC-labeled secondary antibody </td>
			<td >Aves Labs</td>
			<td >F-1005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >GSK650394</td>
			<td >ApexBio</td>
			<td >B1051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >hamilton 10&#956;l syringe </td>
			<td >Hamilton Sigma-Aldrich</td>
			<td >28615-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >14025-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ketamine</td>
			<td>Ketaset</td>
			<td>NDC 0856-2013-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Large blunt/blunt curved scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14519-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >LDN193189</td>
			<td >Cayman Chemicals</td>
			<td >11802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >lodixanol</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >1343517</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >magnesium chloride (MgCl2)</td>
			<td >Fisher Chemical</td>
			<td >M35-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Methylcelulose</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >M0262-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >mounting medium with DAPI </td>
			<td >Vectashield</td>
			<td >H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Needle tip, 26 GA x 1.25&#34;</td>
			<td >PrecisionGlide</td>
			<td >305111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ophthalmic ointment </td>
			<td >Refresh Lacri-Lube</td>
			<td >93468</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >optimal cutting temperature (O.C.T.) </td>
			<td >ThermoFisher</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PCR mix</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep)</td>
			<td >Corning</td>
			<td >30-002-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Phosphate buffered saline pH 7.4 (PBS)</td>
			<td >Corning Cellgro</td>
			<td >46-103-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Potassium chloride (KCl)</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >P330-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >scalpel blades</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Shallow glass or plastic tray</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >skin glue/tissue adhesive</td>
			<td >3M Vetbond</td>
			<td >1469SB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >sodium azide</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >CAS 26628-22-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td >Fisher Chemical</td>
			<td >S642-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >standard hemostat forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>13013-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Standard tweezers</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11027-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Straight iris scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14058-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >sucrose</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >BP220-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tris-base</td>
			<td >Fisher Bioreagents</td>
			<td >BP152-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Triton X-100</td>
			<td >Fisher Bioreagents</td>
			<td >BP151-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypsin-EDTA </td>
			<td >Gibco</td>
			<td >15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Xylazine</td>
			<td >Akorn</td>
			<td>NDC: 59399-111-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EQUIPMENT</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Zeiss AxioObserver Live-Cell microscope </td>
			<td >Zeiss</td>
			<td >Zeiss AxioObserver</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.45mm burr</td>
			<td >IDEAL MicroDrill</td>
			<td >67-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >BD FACScalibur</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >centrifuge</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >glass homogenizer</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >cell culture incubator</td>
			<td >Thermo Scientific HERACELL VIOS 160i</td>
			<td >13-998-213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Leica 3050S research cryostat </td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >stereotactic platform </td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >thermocycler</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Timer</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ultracentrifuge</td>
			<td >Beckman Coulter Optima L-100 XP</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Water bath (37 &#186;C)</td>
			<td >Fisher Scientific Isotemp 2239</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a non-random mouse model for pharmacological reactivation of mecp2 on the inactive x chromosome

X-chromosoom inactivatie (XCI) is de willekeurige silencing van een X-chromosoom bij vrouwen te bereiken gen dosering evenwicht tussen de geslachten. Als gevolg hiervan zijn alle vrouwen zygoot voor X-gebonden genexpressie. Een van de belangrijkste regulatoren van XCI is xist, wat essentieel is voor de initiatie en het onderhoud van XCI. Eerdere studies hebben geïdentificeerd 13 trans Acting X-chromosoom inactivatie factoren (XCIFs) met behulp van een grootschalige, verlies-of-functie genetische scherm. Remming van XCIFs, zoals ACVR1 en PDPK1, met behulp van kort haarspeld RNA of kleine molecule inhibitoren, reactiveert X chromosoom-gebonden genen in gekweekte cellen. Maar de haalbaarheid en tolerantie van het reactiveren van het inactieve X-chromosoom in vivo moet nog worden bepaald. Naar dit doel, een XistΔ: Mecp2/xist: Mecp2-GFP muismodel is gegenereerd met niet-Random XCI als gevolg van schrapping van xist op een X-chromosoom. Met behulp van dit model, de omvang van inactief X reactivering werd quantitated in de muis hersenen na behandeling met XCIF remmers. Onlangs gepubliceerde resultaten tonen, voor de eerste keer, dat de farmacologische remming van XCIFs reactiveert Mecp2 van de inactieve X-chromosoom in corticale neuronen van de levende muis hersenen.

Om aan te tonen de haalbaarheid van de XistΔ: Mecp2/xist: Mecp2-GFP muismodel voor XI reactivering studies, XCIF remmer-gemedieerde reactivering van XI-gebonden Mecp2-GFP werd getest in muis embryonale fibroblasten (MEFs). Vrouwelijke MEFs werden geïsoleerd vanaf dag 15,5 XistΔ: Mecp2/xist: Mecp2-GFP embryo's zoals beschreven in punt 3 (Figuur 1a). De genotypen van vrouwelijke XistΔ: Mecp2/xist: Mecp2-GFP MEFs werden bevestigd door ...

Watch this Scientific Journal Video about A Non-random Mouse Model for Pharmacological Reactivation of Mecp2 on the Inactive X Chromosome at JoVE.com

A Non-random Mouse Model for Pharmacological Reactivation of Mecp2 on the Inactive X Chromosome

Hier beschrijven we een protocol voor het genereren van een levensvatbare vrouwelijke muizenmodel met niet-Random X-chromosoom inactivatie, dat wil zeggen, de moederlijke erfelijke X-chromosoom is inactief in 100% van de cellen. We beschrijven ook een protocol om de haalbaarheid, tolerantie, en de veiligheid van farmacologische reactivering van het inactieve X-chromosoom in vivo te testen.

Een niet-willekeurig muis model voor farmacologische reactivering van Mecp2 op het inactieve X-chromosoom

X chromosome inactivation (XCI) is the random silencing of one X chromosome in females to achieve gene dosage balance between the sexes. As a result, all ...

Dit protocol kan worden gebruikt om een niet-willekeurig muismodel te genereren voor het testen en kwantificeren van de reactivering van het inactieve X-gekoppelde Mecp2-chromosoom in de hersenen van een levende muis. Dit model kan eenvoudig worden aangepast om Xi-reactivering te bestuderen in andere X-gekoppelde ziektemodellen zoals het DDX3X-syndroom. Ik ben een post doc in sanchita Bhatnagar's laboratorium en ik zal de procedure met Zeming Zheng demonstreren.Begin met het positioneren van de verdoofde muis in een stereotactisch platform met de snijtanden in de bijtbalk van de snuit restrainer. Draai de neusklem vast terwijl de muis het hoofd op een vlak vlak houdt. Pas de hoogte van de oorbalken aan om het staartgedeelte van de gehoorgang te bereiken om het hoofd geïmmobiliseerd te houden.Desinfecteer vervolgens de kop met afwisselende doekjes van een actueel antiseptisch en 70% ethanol. Wanneer de muis klaar is, gebruik dan een steriele scalpel om een horizontale incisie van 0,75 centimeter in de middenscals te maken. Gebruik een 0,45 millimeter braam om twee symmetrische gaten boven de rechter en linker corticale hemisferen twee millimeter van de sagittale hechting en de lambdoïde hechting in het benaderende midden van het pariëtale bot boren.Bevestig stevig een 10 microliter spuit aan het stereotactische platform en laad 10 microliter vers bereide chemische remmer in de spuit. Ga de naald in het eerste braamgat terwijl de naald loodrecht op de schedel blijft staan. Wanneer de naald de schedel doorkruist, nul uit de coördinaten op de stereotactische digitale display en vooraf de punt van de naald totdat het een diepte van 2,5 millimeter bereikt.Trek de naald 0,5 millimeter naar een diepte van twee millimeter en injecteer langzaam het volledige volume van 10 microliter van de oplossing over een periode van één minuut. Nadat alle remmer is geleverd, laat de naald nog een minuut in de hersenen voordat u de naald intrekt. Herhaal de injectie in het tweede braamgat met behulp van het voertuig alleen als een controle en sluit de huid over de incisie.Breng de muis vervolgens van het stereotactische apparaat over op een 37 graden Celsius verwarmingskussen met bewaking tot volledig herstel. Aan het einde van het dosisregime beveiligt u de muis op een ontleedpad. Gebruik schaar en tangen om een laterale incisie te maken door het integument en de buikwand net onder de ribbenkast.Scheid de lever voorzichtig van het middenrif en snijd door het middenrif langs de gehele lengte van de ribbenkast om de pleuraholte bloot te leggen. Gebruik de schaar om een incisie te maken aan het achterste uiteinde van de linker ventrikel en onmiddellijk injecteren van de rechter hartkamer met ongeveer 15 milliliter PBS over een periode van twee minuten. Een succesvolle perfusie zal resulteren in een lever kleur verandering van rood naar lichtroze.Wanneer alle PBS is geleverd, doorsneed het hart met ongeveer 10 milliliter van 4% paraformaldehyde in PBS gedurende twee minuten. Na het oogsten van het hoofd, gebruik een schaar om een middellijn incisie in de hoofdhuid te maken om de schedel bloot te leggen. Plaats een puntje van de schaar in de foramen magnum om de creatie van een laterale incisie in de schedel naar het oog te vergemakkelijken.Maak een soortgelijke incisie aan de andere kant van de schedel houden van het einde van de schaar zo oppervlakkig mogelijk en snijd het gebied van de schedel tussen de ogen en boven de neus van de muis. Gebruik tangen om voorzichtig schil de schedelbeenderen van de hersenhelften en gebruik een spatel om de hersenen te verheffen. Ontleden zorgvuldig de schedelzenuwvezels die de hersenen aan de schedel bevestigen en de hersenen in een plastic schotel plaatsen.Dan accijnzen de cerebellum en reukbollen. Om delen van het hersenweefsel te verkrijgen, eerst de hersenen vast te stellen in een 15 milliliter buis gevuld met 4% paraformaldehyde in PBS op vier graden Celsius 's nachts. De volgende ochtend, spoel het hersenweefsel ten minste drie keer gedurende vijf minuten op vier graden Celsius in verse PBS per wasbeurt.Na de laatste wasbeurt, verwijder de voorkant van elke hemisfeer met een schaar en tangen en plaats de monsters in gelabelde cryo-mallen voorkant naar beneden. Dompel elk weefsel onder in een optimaal snijtemperatuurmedium voordat de monsters in vloeibare stikstof worden ingevroren in een 10 millimeter plastic petrischaal voor min 80 graden Celsius opslag. Om xi reactivering te bepalen, dompel vijf tot zes micrometer hersenweefselsecties in antigeen retrieval oplossing gedurende vijf minuten op een 100 graden Celsius warmteblok.Aan het einde van de incubatie was je de glijbanen met vier wasbeurten van vijf minuten op kamertemperatuur met verse PBS per wasbeurt voordat je de glijbanen onderdompelt in een blokkeeroplossing. Na 20 minuten op kamertemperatuur, was de glijbanen drie keer gedurende vijf minuten in verse wasbuffer per wasbeurt. Bevlek de weefselmonsters met de juiste primaire antilichamen bij vier graden Celsius 's nachts.Beeld de dia's op een fluorescentiemicroscoop die het contrast en de helderheid aanpast om kwantificering van het aantal GFP positieve cellen voor zowel drug als voertuig behandelde muishersenhelften toe te staan. Om de haalbaarheid van het niet-willekeurige X-chromosoom inactivatie muismodel voor inactieve X-chromosoomreactivatiestudies aan te tonen, werden de genotypen van vrouwelijke transgene muisembryonal fibroblast bevestigd door genotyping PCR en flow cytometrie. Zoals beoordeeld door PCR, werd de uitdrukking van het GFP-gelabelde methyleen CPG-bindingeiwit twee gen of MECP2 gereactiveerd door drugs, maar niet door de behandeling van voertuigen.Niet-willekeurige X-chromosoom inactivatie muis model embryonale fibroblasten ook uitgedrukt nucleaire GFP na drug, maar niet voertuig behandeling waaruit blijkt dat de X-chromosoom inactivatie factor remmers reactiveren geïnactiveerd X chromosoom gekoppeld MECP2 in de muis embryonale fibroblasten. Medicamenteuze behandeling reactiveert geïnactiveerde X-chromosoom MECP2-GFP in ongeveer 30% van de cellen in drug geïnfundeerde hersenhelften, terwijl er geen reactivering wordt gedetecteerd in het voertuig geïnfundeerd hemisferen. Microtubuli-geassocieerde eiwit twee positieve neuronen zijn ook GFP positief in behandelde hemisfeer indicatief voor geïnactiveerde X chromosoom MECP2-GFP expressie.Het medicijnregime zal afhankelijk zijn van het doel en de werkzaamheid van de kleine molecuulremmers, zodat de dosis en behandeling in vitro worden geoptimaliseerd voordat ze in vivo worden getest. De niet-willekeurige muis model kan worden gebruikt om verschillende geneesmiddelen te testen, hetzij individueel of in combinatie. In feite hebben wij en anderen verschillende druggable X-chromosoom inactivatiefactoren geïdentificeerd.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Molecular Biology

Genetics

Unit 2

Mendelian Genetics

SCIENTISTS IN ACTION

Conjugative Mating Assays for Sequence-specific Analysis of Transfer Proteins Involved in Bacterial Conjugation

Conjugative Mating Testen voor sequentie-specifieke analyse van Transfer eiwitten die betrokken zijn in bacterieconjugatie

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia ...

Pooled shRNA Screen for Reactivation of MeCP2 on the Inactive X Chromosome

Gebundelde shRNA scherm voor de heractivering van het MeCP2 op het inactieve X-chromosoom

Forward genetic screens using reporter genes inserted into the heterochromatin have been extensively used to investigate mechanisms of epigenetic control ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

High-throughput identificatie van regelgevende gensequenties met behulp van Next-generation Sequencing van circulaire chromosoom conformatie Capture (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

Genetische manipulatie van Dictyostelium discoideum cellen op basis van de selectie en de groei van bacteriën

Dictyostelium discoideum is an intriguing model organism for the study of cell differentiation processes during development, cell signaling, and other ...

Mass Spectrometry-Based Proteomics Analyses Using the OpenProt Database to Unveil Novel Proteins Translated from Non-Canonical Open Reading Frames

Massa spectrometrie gebaseerde Proteomics Analyses met behulp van de OpenProt Database te onthullen nieuwe eiwitten vertaald uit niet-canonieke Open lezing Frames

Genome annotation is central to today's proteomic research as it draws the outlines of the proteomic landscape. Traditional models of open reading frame ...

A Robust Polymerase Chain Reaction-based Assay for Quantifying Cytosine-guanine-guanine Trinucleotide Repeats in Fragile X Mental Retardation-1 Gene

Een robuuste polymerase kettingreactie op basis van Cytosine-guanine-guanine Trinucleotide herhalingen in fragiele X mentale retardatie-1 gen

Fragile X syndrome (FXS) and associated disorders are caused by expansion of the cytosine-guanine-guanine (CGG) trinucleotide repeat in the 5&#8217; ...

A Screening Method for Identification of Heterochromatin-Promoting Drugs Using Drosophila

A Screening Method for Identification of Heterochromatin-Promoting Drugs Using Drosophila

Een screeningmethode voor de identificatie van heterochromatine-bevorderende drugs met drosophila

Drosophila is an excellent model organism that can be used to screen compounds that might be useful for cancer therapy. The method described here is a ...

Identification of Enhancer-Promoter Contacts in Embryoid Bodies by Quantitative Chromosome Conformation Capture (4C)

Identification of Enhancer-Promoter Contacts in Embryoid Bodies by Quantitative Chromosome Conformation Capture 4C

Identificatie van enhancer-promotor contacten in embryoïide lichamen door kwantitatieve chromosoomconformatie Capture (4C)

During mammalian development, cell fates are determined through the establishment of regulatory networks that define the specificity, timing, and spatial ...

Application of DNA Fingerprinting using the D1S80 Locus in Lab Classes

Application of DNA Fingerprinting using the D1S80 Locus in Lab Classes

Toepassing van DNA-vingerafdrukken met behulp van de D1S80 Locus in labklassen

In biological sciences, DNA fingerprinting has been widely used for paternity testing, forensic applications and phylogenetic studies. Here, we describe a ...

Investigating the Pathogenesis of MYH7 Mutation Gly823Glu in Familial Hypertrophic Cardiomyopathy using a Mouse Model

Onderzoek naar de pathogenese van MYH7-mutatie Gly823Glu bij familiaire hypertrofische cardiomyopathie met behulp van een muismodel

Familial hypertrophic cardiomyopathy (HCM, OMIM: 613690) is the most common cardiomyopathy in China. However, the underlying genetic etiology of HCM ...