Name: a non-random mouse model for pharmacological reactivation of mecp2 on the inactive x chromosome
Uploaded: 2019-05-22T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Non-random Mouse Model for Pharmacological Reactivation of Mecp2 on the Inactive X Chromosome at JoVE.com

Die Autoren danken Antonio Bedalov für die Bereitstellung von Reagenzien; University of Virginia Tissue Histology Core for Kryosectioning; University of Virginia Flow Cytometry Core für Fließzytometrie-Analyse; Christian Blue und Saloni Singh für technische Hilfe bei der Genotypisierung. Diese Arbeit wurde unterstützt durch einen Doppel-Hoo-Forschungsstipendium an Z.Z. und einen Pilot-Projektprogramm-Award von der University of Virginia-Virginia Tech Seed Fund Award und den Hartwell Foundation Individual Biomedical Research Award an S.B.

Die Arbeiten mit Mäusen wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC; #4112) der University of Virginia genehmigt.
1. Generieren Sie ein nicht zufälliges XCI-Maus-Modell mit genetisch gekennzeichnetem Mecp2 auf Xi
NOTE: Die in der Studie verwendeten Mäusestämme waren: Mecp2-Gfp/Mecp2-Gfp (Mecp2tm3.1Bird, Materialtisch) und Xist/-Xist (B6;129-Xist<tm5Sado>; zu...

<ol>
	<li>Lyon, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-chromosome+inactivation+as+a+system+of+gene+dosage+compensation+to+regulate+gene+expression.">X-chromosome inactivation as a system of gene dosage compensation to regulate gene expression.</a> Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology. 36, 119-130 (1989).</li><li>Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delving+into+the+diversity+of+facultative+heterochromatin:+the+epigenetics+of+the+inactive+X+chromosome.">Delving into the diversity of facultative heterochromatin: the epigenetics of the inactive X chromosome.</a> Current Opinion in Genetics Development. 15 (5), 482-489 (2005).</li><li>Augui, S., Nora, E. P., Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+X-chromosome+inactivation+by+the+X-inactivation+centre.">Regulation of X-chromosome inactivation by the X-inactivation centre.</a> Nature Review Genetics. 12 (6), 429-442 (2011).</li><li>Pontier, D. B., Gribnau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xist+regulation+and+function+explored.">Xist regulation and function explored.</a> Human Genetics. 130 (2), 223-236 (2011).</li><li>Barnes, C., Kanhere, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+RNA-Protein+Interactions+Through+In+Vitro+RNA+Pull-Down+Assays.">Identification of RNA-Protein Interactions Through In Vitro RNA Pull-Down Assays.</a> Methods in Molecular Biology. 1480, 99-113 (2016).</li><li>McHugh, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Xist+lncRNA+interacts+directly+with+SHARP+to+silence+transcription+through+HDAC3.">The Xist lncRNA interacts directly with SHARP to silence transcription through HDAC3.</a> Nature. 521 (7551), 232-236 (2015).</li><li>Minajigi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomes.+A+comprehensive+Xist+interactome+reveals+cohesin+repulsion+and+an+RNA-directed+chromosome+conformation.">Chromosomes. A comprehensive Xist interactome reveals cohesin repulsion and an RNA-directed chromosome conformation.</a> Science. 349 (6245), (2015).</li><li>Mira-Bontenbal, H., Gribnau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Xist-Interacting+Proteins+in+X-Chromosome+Inactivation.">New Xist-Interacting Proteins in X-Chromosome Inactivation.</a> Current Biology. 26 (8), R338-R342 (2016).</li><li>Mira-Bontenbal, H., Gribnau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Xist-Interacting+Proteins+in+X-Chromosome+Inactivation.">New Xist-Interacting Proteins in X-Chromosome Inactivation.</a> Curren Biology. 26 (10), 1383 (2016).</li><li>Ridings-Figueroa, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nuclear+matrix+protein+CIZ1+facilitates+localization+of+Xist+RNA+to+the+inactive+X-chromosome+territory.">The nuclear matrix protein CIZ1 facilitates localization of Xist RNA to the inactive X-chromosome territory.</a> Genes and Development. 31 (9), 876-888 (2017).</li><li>Sunwoo, H., Colognori, D., Froberg, J. E., Jeon, Y., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repeat+E+anchors+Xist+RNA+to+the+inactive+X+chromosomal+compartment+through+CDKN1A-interacting+protein+(CIZ1).">Repeat E anchors Xist RNA to the inactive X chromosomal compartment through CDKN1A-interacting protein (CIZ1).</a> Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. , (2017).</li><li>Bhatnagar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+pharmacological+reactivation+of+the+mammalian+inactive+X+chromosome.">Genetic and pharmacological reactivation of the mammalian inactive X chromosome.</a> Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (35), 12591-12598 (2014).</li><li>Zoghbi, H. Y., Percy, A. K., Schultz, R. J., Fill, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+X+chromosome+inactivation+in+the+Rett+syndrome.">Patterns of X chromosome inactivation in the Rett syndrome.</a> Brain Development. 12 (1), 131-135 (1990).</li><li>Anvret, M., Wahlstrom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rett+syndrome:+random+X+chromosome+inactivation.">Rett syndrome: random X chromosome inactivation.</a> Clinical Genetics. 45 (5), 274-275 (1994).</li><li>Amir, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rett+syndrome+is+caused+by+mutations+in+X-linked+MECP2,+encoding+methyl-CpG-binding+protein+2.">Rett syndrome is caused by mutations in X-linked MECP2, encoding methyl-CpG-binding protein 2.</a> Nature Genetics. 23 (2), 185-188 (1999).</li><li>Przanowski, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+reactivation+of+inactive+X-linked+Mecp2+in+cerebral+cortical+neurons+of+living+mice.">Pharmacological reactivation of inactive X-linked Mecp2 in cerebral cortical neurons of living mice.</a> Proceedings of Natlional Academy of Sciences of the United States of America. 115 (31), 7991-7996 (2018).</li><li>Borensztein, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xist-dependent+imprinted+X+inactivation+and+the+early+developmental+consequences+of+its+failure.">Xist-dependent imprinted X inactivation and the early developmental consequences of its failure.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 24 (3), 226-233 (2017).</li><li>Jensen, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+histological+staining+and+fluorescence+using+ImageJ.">Quantitative analysis of histological staining and fluorescence using ImageJ.</a> Anatomical Record (Hoboken). 296 (3), 378-381 (2013).</li><li>Cseke, L. J., Talley, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+PCR-based+genotyping+method+to+distinguish+between+wild-type+and+ornamental+varieties+of+Imperata+cylindrica.">A PCR-based genotyping method to distinguish between wild-type and ornamental varieties of Imperata cylindrica.</a> Journal of Visualized Experiments. (60), (2012).</li></ol>

Zuvor wurden XCIFs identifiziert, die selektiv für das Schweigen von Xi-verknüpften Genen in Säugetierzellen benötigt werden. Wir haben weitere potente kleine Molekül-Inhibitoren optimiert, um XCIFs, wie ACVR1 und nachgelagerte Effekte von PDPK1, die Xi-linked Mecp2 in Maus-Fischblastzelllinien, Mauskortikalneuronen und einer menschlichen Fibroblast effektiv reaktivieren Zeile abgeleitet von einem RTT-Patienten. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Xi-Reaktivierung ein plausi...

X-Chromosomen-Inaktivierung (XCI) ist ein Prozess der Dosierkompensation, der X-verknüpfte Genexpression ausgleicht, indem eine Kopie des X-Chromosoms bei Frauen1zum Schweigen gebracht wird. Das inaktive X-Chromosom (Xi) sammelt daher charakteristische Merkmale von Heterochromatin, darunter die DNA-Methylierung und hemmende Histonmodifikationen, wie die Histon-H3-Lysin 27-Trimethylation (H3K27me3) und die Histon-H2A-Ubiquitation (H2A) 2. Der Hauptregler des X-Chromosomenschliakings ist die X-Inaktivierungs-Region (Xic), etwa 100 − 500 kb, die das Zählen und Paarung der X-Chromosomen, die zufällige Wahl des X-Chromosoms für die Inaktivierung und die Initiation und Ausbreitung von Schweigen entlang des X-Chromosoms 3. Der Prozess der X-Inaktivierung wird durch X-inaktive spezifische Transkription (Xist) eingeleitet, die den Xi in cis beschichtet, um Chromosomen-Sichern zu vermitteln und die dreidimensionale Struktur des X-Chromosoms4 neu zu modellieren. In jüngster Zeit haben mehrere proteomische und genetische Bildschirme zusätzliche Regulatoren von XCI identifiziert, wie zum Beispiel Xist interagierende Proteine 5,6,7,8, 9 , 10 , 11 , 12. Zum Beispiel hat eine frühere Studie mit einem unvoreingenommenen genom-weiten RNA-Interferenzbildschirm 13 Trans-wirkende XCI-Faktoren(XCIFs) 12 identifiziert. Mechanisch regulieren XCIFs den Xist-Ausdruck und führen daher zu defekten XCI12, die die XCIFs-Funktion stören. Zusammen haben die jüngsten Fortschritte auf diesem Gebiet wichtige Einblicke in die molekularen Maschinen gegeben, die für die Initiierung und Aufrechterhaltung von XCI erforderlich sind.
Die Identifizierung der XCI-Regulatoren und das Verständnis ihres Mechanismus in XCI sind für X-gebundene menschliche Krankheiten wie das Rett-Syndrom (RTT) 13,14direkt relevant. RTT ist eine seltene Neuroentwicklungsstörung, die durch eine heterozygöse Mutation im X-verknüpften Methyl-CpG-Bindungsprotein 2 (MECP2) verursacht wird, das vorwiegend Mädchen 15 betrifft. Da sich MECP2 auf dem X-Chromosom befindet, sind RTT-Mädchen heterozygös für MECP2 -Mangel mit ~ 50% Zellen, die Wild-Typ und ~ 50% Ausdruck der Mutant MECP2ausdrücken. Vor allem die RTT-Mutantzellen beherbergen eine ruhende, aber wilde Kopie von Mecp2 auf dem Xi, die eine Quelle des funktionellen Gens darstellt, das, wenn es reaktiviert wird, möglicherweise Symptome der Krankheit lindern könnte. Neben RTT gibt es noch einige andere X-gebundene menschliche Krankheiten, für die die Reaktivierung von Xi einen möglichen therapeutischen Ansatz darstellt, wie das DDX3X-Syndrom.
Hemmung von XCIFs, 3-phosphoinositid-abhängigem Protein Kinase-1 (PDPK1) und Aktivierung von A-Rezeptor Typ 1 (ACVR1), entweder durch kurze Haarnadel-RNA (shRNA) oder kleine Molekül-Inhibitoren, reaktiviert Xi-verknüpfte 12. Die pharmakologische Reaktivierung von Xi-verknüpften Genen wird in verschiedenen Ex-vivo-Modellen beobachtet, die Maus-Fischblätter-Linien, erwachsene Maus-kortikale Neuronen, Mäuse-Embryonalfibroblasten und Fibroblast-Zelllinien, die von einem RTT-Patienten12abgeleitet werden, umfassen. Ob in vivo eine pharmakologische Reaktivierung von Xi-gebundenen Genen möglich ist, bleibt jedoch abzuwarten. Ein begrenzender Faktor ist das Fehlen wirksamer Tiermodelle, um die Expression von Genen aus reaktivierten Xi genau zu messen. Zu diesem Ziel wurde ein Xist-: Mecp2/Xist: Mecp2-Gfp-Maus-Modell erstellt, das in allen Zellen ein genetisch beschriftetes Mecp2 auf Xi in allen Zellen trägt, da es im Xist auf dem mütterlichen X-Chromosom 16 eine heterozygöse Löschung gibt. Mit diesem Modell wurde der Ausdruck von Mecp2 von Xi nach der Behandlung mit XCIFs-Inhibitoren im Gehirn lebender Mäuse quantitativ behandelt. Hier wird die Generation der Xist-: Mecp2/Xist: Mecp2-Gfp-Maus-Modell und-Methodik zur Quantisierung der Xi-Recaktivierung in kortikalen Neuronen mit immunluoreszenalen Assays beschrieben.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >MICE</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mecp2tm3.1Bird</td>
			<td >The Jackson Laboratory</td>
			<td>#014610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >B6;129-Xist (tm5Sado)</td>
			<td>provided by Antonio Bedalov, Fred Hutchinson Cancer Center, Seattle</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >REAGENTS</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >22x22 mm coverslip</td>
			<td >FISHERfinest (Fisher Scientific)</td>
			<td >125488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >32% Paraformaldehyde</td>
			<td >Electron Microscopy Sciences</td>
			<td >15714-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >50 ml syringe</td>
			<td>Medline Industries</td>
			<td>NPMJD50LZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >60mm culture dish</td>
			<td >CellStar</td>
			<td >628160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >7-AAD </td>
			<td >BioLegend</td>
			<td >420403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ammonium chloride (NH4Cl)</td>
			<td >Fisher Chemical</td>
			<td >A661-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >anti-GFP-AlexaFluor647</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td >A-31852</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >anti-MAP2</td>
			<td >Aves Labs</td>
			<td >MAP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >BSA</td>
			<td >Promega</td>
			<td >R396D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Buprenorphine SR</td>
			<td >Zoopharm</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >citric acid </td>
			<td >Sigma</td>
			<td >C-1857</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DMSO</td>
			<td >Fisher Bioreagents</td>
			<td >BP231-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td >Corning Cellgro</td>
			<td >10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethanol</td>
			<td >Decon Labs</td>
			<td >2701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td >VWR Life Science</td>
			<td>89510-198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >gelatin</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >G9391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >glass slides</td>
			<td >Fisherbrand</td>
			<td >22-034-486</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >goat anti-chicken FITC-labeled secondary antibody </td>
			<td >Aves Labs</td>
			<td >F-1005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >GSK650394</td>
			<td >ApexBio</td>
			<td >B1051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >hamilton 10&#956;l syringe </td>
			<td >Hamilton Sigma-Aldrich</td>
			<td >28615-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >14025-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ketamine</td>
			<td>Ketaset</td>
			<td>NDC 0856-2013-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Large blunt/blunt curved scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14519-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >LDN193189</td>
			<td >Cayman Chemicals</td>
			<td >11802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >lodixanol</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >1343517</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >magnesium chloride (MgCl2)</td>
			<td >Fisher Chemical</td>
			<td >M35-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Methylcelulose</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >M0262-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >mounting medium with DAPI </td>
			<td >Vectashield</td>
			<td >H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Needle tip, 26 GA x 1.25&#34;</td>
			<td >PrecisionGlide</td>
			<td >305111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ophthalmic ointment </td>
			<td >Refresh Lacri-Lube</td>
			<td >93468</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >optimal cutting temperature (O.C.T.) </td>
			<td >ThermoFisher</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PCR mix</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep)</td>
			<td >Corning</td>
			<td >30-002-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Phosphate buffered saline pH 7.4 (PBS)</td>
			<td >Corning Cellgro</td>
			<td >46-103-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Potassium chloride (KCl)</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >P330-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >scalpel blades</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Shallow glass or plastic tray</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >skin glue/tissue adhesive</td>
			<td >3M Vetbond</td>
			<td >1469SB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >sodium azide</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >CAS 26628-22-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td >Fisher Chemical</td>
			<td >S642-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >standard hemostat forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>13013-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Standard tweezers</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11027-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Straight iris scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14058-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >sucrose</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >BP220-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tris-base</td>
			<td >Fisher Bioreagents</td>
			<td >BP152-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Triton X-100</td>
			<td >Fisher Bioreagents</td>
			<td >BP151-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypsin-EDTA </td>
			<td >Gibco</td>
			<td >15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Xylazine</td>
			<td >Akorn</td>
			<td>NDC: 59399-111-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EQUIPMENT</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Zeiss AxioObserver Live-Cell microscope </td>
			<td >Zeiss</td>
			<td >Zeiss AxioObserver</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.45mm burr</td>
			<td >IDEAL MicroDrill</td>
			<td >67-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >BD FACScalibur</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >centrifuge</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >glass homogenizer</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >cell culture incubator</td>
			<td >Thermo Scientific HERACELL VIOS 160i</td>
			<td >13-998-213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Leica 3050S research cryostat </td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >stereotactic platform </td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >thermocycler</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Timer</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ultracentrifuge</td>
			<td >Beckman Coulter Optima L-100 XP</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Water bath (37 &#186;C)</td>
			<td >Fisher Scientific Isotemp 2239</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a non-random mouse model for pharmacological reactivation of mecp2 on the inactive x chromosome

X-Chromosomin-Inaktivierung (XCI) ist die zufällige Abschaltung eines X-Chromosoms bei Frauen, um das Gleichgewicht zwischen den Geschlechtern zu erreichen. Damit sind alle Weibchen heterozygös für die X-gebundene Genexpression. Einer der wichtigsten Regulatoren von XCI ist Xist,der für die Initiierung und Wartung von XCI unerlässlich ist. Frühere Studien haben 13 Trans, die X-Chromosom-Inaktivierungsfaktoren (XCIFs) verwenden, anhand eines großformatigen, funktionslosen genetischen Bildschirms identifiziert. Hemmung von XCIFs, wie ACVR1 und PDPK1, mit Kurzhaarnadel-RNA oder kleinen Molekül-Inhibitoren, reaktiviert X-Chromosomen-verknüpfte Gene in kultivierten Zellen. Doch die Machbarkeit und Verträglichkeit der Reaktivierung des inaktiven X-Chromosoms in vivo bleibt abzuwarten. Zu diesem Zweck wurde ein Xist-: Mecp2/Xist: Mecp2-Gfp-Mausmodell mit nicht zufälligem XCI erzeugt, da Xist auf einem X-Chromosom gelöscht wurde. Mit diesem Modell wurde das Ausmaß der inaktiven X-Reaktivierung im Maushirn nach der Behandlung mit XCIF-Inhibitoren quantitiert. Vor kurzem veröffentlichte Ergebnisse zeigen erstmals, dass die pharmakologische Hemmung von XCIFs Mecp2 aus dem inaktiven X-Chromosom in kortikalen Neuronen des lebenden Maushirns reaktiviert.

Um die Machbarkeit der Xist-: Mecp2/Xist: Mecp2-Gfp-Maus für Xi-Reaktivierungsstudien zu demonstrieren, wurde die XCIF-Inhibitor-vermittelte Reaktivierung der Xi-verknüpften Mecp2 -Gfp in Mäuse-Embryonalfibroblasten (MEFs) getestet. Weibliche MEFs wurden ab dem Tag 15.5 Xistin: Mecp2/Xist: Mecp2-Gfp Embryonen isoliert, wie in Abschnitt 3 (Abbildung 1A) beschrieben. Die Genotypen der weiblichen Xist-: Mecp2/Xist: Mecp2-Gfp MEFs wurden...

Watch this Scientific Journal Video about A Non-random Mouse Model for Pharmacological Reactivation of Mecp2 on the Inactive X Chromosome at JoVE.com

A Non-random Mouse Model for Pharmacological Reactivation of Mecp2 on the Inactive X Chromosome

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Generierung eines lebensfähigen weiblichen Murinmodells mit nicht zufälliger X-Chromosomeninaktivierung, d.h. das mütterlich vererbte X-Chromosom ist in 100% der Zellen inaktiv. Wir beschreiben auch ein Protokoll zur Prüfung der Machbarkeit, Verträglichkeit und Sicherheit der pharmakologischen Reaktivierung des inaktiven X-Chromosoms in vivo.

Ein nicht zufälliges Mausmodell zur pharmakologischen Reaktivierung von Mecp2 auf dem inaktiven X-Chromosom

X chromosome inactivation (XCI) is the random silencing of one X chromosome in females to achieve gene dosage balance between the sexes. As a result, all ...

Dieses Protokoll kann verwendet werden, um ein nicht zufälliges Mausmodell zum Testen und Quantifizieren der Reaktivierung des inaktiven X-verknüpften Mecp2-Chromosoms im Gehirn einer lebenden Maus zu generieren. Dieses Modell kann leicht geändert werden, um Xi Reaktivierung in anderen X-verknüpften Krankheitsmodellen wie DDX3X-Syndrom zu studieren. Ich bin Postdoktorand in Sanchita Bhatnagars Labor und werde das Verfahren mit Zeming Zheng demonstrieren.Beginnen Sie mit der Positionierung der anästhesierten Maus in einer stereotaktischen Plattform mit den Schneidezähnen, die in der Bissstange des Schnartrainers eingehakt sind. Ziehen Sie die Nasenklemme fest, während Sie den Kopf der Maus auf einer Ebenenebene halten. Passen Sie die Höhe der Ohrbügel an, um den kaudalen Teil des Gehörgangs zu erreichen, um den Kopf immobilisiert zu halten.Dann desinfizieren Sie den Kopf mit abwechselnden Tüchern eines topischen Antiseptikums und 70%Ethanol. Wenn die Maus bereit ist, verwenden Sie ein steriles Skalpell, um einen 0,75 Zentimeter großen horizontalen Schnitt in der mittleren Kopfhaut zu machen. Verwenden Sie einen 0,45 Millimeter Grat, um zwei symmetrische Löcher über der rechten und linken kortikalen Halbkugel zwei Millimeter von der sagittalen Naht und der Lambdoid-Naht in der ungefähren Mitte des parietalen Knochens zu bohren.Befestigen Sie eine 10-Mikroliter-Spritze an der stereotaktischen Plattform und laden Sie 10 Mikroliter frisch zubereiteten chemischen Inhibitor in die Spritze. Fördern Sie die Nadel in das erste Gratloch, während Sie die Nadel senkrecht zum Schädel halten. Wenn die Nadel den Schädel durchquert, nulln Sie die Koordinaten auf dem stereotaktischen digitalen Display und leiten Sie die Spitze der Nadel an, bis sie eine Tiefe von 2,5 Millimetern erreicht.Ziehen Sie die Nadel 0,5 Millimeter auf eine Tiefe von zwei Millimetern zurück und injizieren Sie langsam das gesamte 10-Mikroliter-Volumen der Lösung über einen Zeitraum von einer Minute. Nachdem der gesamte Inhibitor abgegeben wurde, lassen Sie die Nadel im Gehirn für eine weitere Minute, bevor Sie die Nadel zurückziehen. Wiederholen Sie die Injektion in das zweite Gratloch mit dem Fahrzeug nur als Kontrolle und schließen Sie die Haut über den Schnitt.Dann übertragen Sie die Maus aus dem stereotaktischen Gerät auf ein 37 Grad Celsius Heizkissen mit Überwachung bis zur vollständigen Erholung. Am Ende des Dosisschemas, sichern Sie die Maus auf einem Sezieren Pad. Verwenden Sie Schere und Zange, um einen seitlichen Schnitt durch die Integument und die Bauchwand direkt unter dem Brustkorb zu machen.Trennen Sie vorsichtig die Leber von der Membran und schneiden Sie das Zwerchfell entlang der gesamten Länge des Brustkorbs durch, um die Pleurahöhle freizulegen. Verwenden Sie die Schere, um einen Schnitt an das hintere Ende der linken Herzkammer zu machen und sofort die rechte Herzkammer mit etwa 15 Milliliter PBS über einen Zeitraum von zwei Minuten zu injizieren. Eine erfolgreiche Perfusion führt zu einem Leberfarbwechsel von Rot zu blassrosa.Wenn alle PBS geliefert wurden, durchdringen Sie das Herz mit etwa 10 Millilitern 4%Paraformaldehyd in PBS über zwei Minuten. Nach der Ernte des Kopfes, verwenden Sie eine Schere, um einen Mittellinienschnitt in der Kopfhaut zu machen, um den Schädel zu belichten. Legen Sie eine Spitze der Schere in das Foramen magnum, um die Bildung eines seitlichen Schnitts im Schädel zum Auge zu erleichtern.Machen Sie einen ähnlichen Schnitt auf der anderen Seite des Schädels halten das Ende der Schere so oberflächlich wie möglich und schneiden Sie den Bereich des Schädels zwischen den Augen und über der Nase der Maus. Verwenden Sie Zangen, um die Schädelknochen sanft von den Gehirnhälften zu schälen und verwenden Sie einen Spachtel, um das Gehirn zu erhöhen. Sezieren Sie vorsichtig die Hirnnervenfasern, die das Gehirn am Schädel fixieren, und legen Sie das Gehirn in eine Plastikschale.Dann verbrauchen Sie das Kleinhirn und olfaktorische Glühbirnen. Um Abschnitte des Hirngewebes zu erhalten, fixieren Sie zuerst das Gehirn in einer 15-Milliliter-Röhre, die mit 4% Paraformaldehyd in PBS bei vier Grad Celsius über Nacht gefüllt ist. Am nächsten Morgen spülen Sie das Hirngewebe mindestens dreimal für fünf Minuten bei vier Grad Celsius in frischen PBS pro Wäsche.Nach der letzten Wäsche die Vorderseite jeder Hemisphäre mit Schere und Zange entfernen und die Proben in beschriftete Kryoformen vorne nach unten legen. Tauchen Sie jedes Gewebe in ein optimales Schnitttemperaturmedium, bevor Sie die Proben in flüssigem Stickstoff in einer 10-Millimeter-Kunststoff-Petrischale für minus 80 Grad Celsius einfrieren. Um die Xi-Reaktivierung zu bestimmen, tauchen Sie fünf bis sechs Mikrometer Hirngewebeabschnitte für fünf Minuten in Antigen-Retrieval-Lösung auf einen 100 Grad Celsius-Wärmeblock ein.Waschen Sie die Dias am Ende der Inkubation mit vier fünfminütigen Wäschen bei Raumtemperatur mit frischen PBS pro Wäsche, bevor Sie die Dias in die Blockierlösung eintauchen. Nach 20 Minuten bei Raumtemperatur die Dias dreimal fünf Minuten in frischem Waschpuffer pro Waschgang waschen. Färben Sie die Gewebeproben mit den entsprechenden Primärantikörpern bei vier Grad Celsius über Nacht.Stellen Sie die Dias auf einem Fluoreszenzmikroskop auf, das den Kontrast und die Helligkeit anpasst, um die Quantifizierung der Anzahl der GFP-positiven Zellen sowohl für die medikamentös als auch für die fahrzeugbehandelte Maushirnhälfte nmöglich zu quantifizieren. Um die Durchführbarkeit des nicht zufälligen X-Chromosom-Inaktivierungsmausmodells für inaktive X-Chromosom-Reaktivierungsstudien zu demonstrieren, wurden die Genotypen weiblicher transgener Maus-Embryonal-Fibroblasten durch genotypisierende PCR- und Durchflusszytometrie bestätigt. Nach DER von PCR bewerteten Expression des GFP-getaggten Methylen-CPG-bindenden Proteins zwei Gen- oder MECP2-Gen wurde durch medikamentöse, aber nicht durch Fahrzeugbehandlung reaktiviert.Nicht zufällige X-Chromosom-Inaktivierungs-Mausmodell embryonale Fibroblasten exprimiert auch nukleare GFP nach Medikament, aber nicht Fahrzeugbehandlung, die die X-Chromosom-Inaktivierungsfaktor-Inhibitoren reaktivieren inaktivierte X-Chromosom-verknüpfte MECP2 in Maus embryonalen Fibroblasten. Die medikamentöse Behandlung reaktiviert das inaktivierte X-Chromosom MECP2-GFP in etwa 30% der Zellen in medikamentös infundierten Gehirnhälften, während keine Reaktivierung in fahrzeuginfundierten Hemisphären nachgewiesen wird. Mikrotubule-assoziiertes Protein zwei positive Neuronen sind auch GFP-positiv in medikamentös behandelten Hemisphären, die auf inaktivierte X-Chromosom-MECP2-GFP-Expression hinweisen.Das Arzneimittelregime wird vom Ziel und der Wirksamkeit der kleinen Molekülinhibitoren abhängen, so optimieren Sie die Dosis und Behandlung in vitro vor dem Testen in vivo. Das nicht zufällige Mausmodell kann verwendet werden, um verschiedene Medikamente einzeln oder in Kombination zu testen. Tatsächlich haben wir und andere mehrere medikamentöse X-Chromosom-Inaktivierungsfaktoren identifiziert.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Molecular Biology

Genetics

Unit 2

Mendelian Genetics

SCIENTISTS IN ACTION

Conjugative Mating Assays for Sequence-specific Analysis of Transfer Proteins Involved in Bacterial Conjugation

Konjugative Mating Assays für sequenzspezifische Analyse der Übertragung beteiligten Proteine ​​in bakteriellen Konjugation

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia ...

Forschung

Genetik

Pooled shRNA Screen for Reactivation of MeCP2 on the Inactive X Chromosome

Gepoolte ShRNA Bildschirm für die Reaktivierung des MeCP2 auf dem inaktiven X-Chromosom

Forward genetic screens using reporter genes inserted into the heterochromatin have been extensively used to investigate mechanisms of epigenetic control ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

Hochdurchsatz-Identifizierung des Gens regulatorischen Sequenzen mit Next-Generation Sequenzierung der kreisförmigen Chromosom Konformation erfassen (4C-Seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

Gentechnische Veränderung von Dictyostelium Discoideum Zellen basierend auf Auswahl und das Wachstum von Bakterien

Dictyostelium discoideum is an intriguing model organism for the study of cell differentiation processes during development, cell signaling, and other ...

Mass Spectrometry-Based Proteomics Analyses Using the OpenProt Database to Unveil Novel Proteins Translated from Non-Canonical Open Reading Frames

Massenspektrometrie-basierte Proteomics Analysen mithilfe der OpenProt-Datenbank zu enthüllen neue Proteine übersetzt aus dem nicht-kanonischen Open Reading Frames

Genome annotation is central to today's proteomic research as it draws the outlines of the proteomic landscape. Traditional models of open reading frame ...

A Robust Polymerase Chain Reaction-based Assay for Quantifying Cytosine-guanine-guanine Trinucleotide Repeats in Fragile X Mental Retardation-1 Gene

Ein robuster Polymerase-Kettenreaktions-basierter Assay zur Quantifizierung von Cytosin-Guanin-Guanin-Trinukleotid-Wiederholungen in fragilen X Mental Retardation-1 Gen

Fragile X syndrome (FXS) and associated disorders are caused by expansion of the cytosine-guanine-guanine (CGG) trinucleotide repeat in the 5&#8217; ...

A Screening Method for Identification of Heterochromatin-Promoting Drugs Using Drosophila

A Screening Method for Identification of Heterochromatin-Promoting Drugs Using Drosophila

Eine Screening-Methode zur Identifizierung von Heterochromatin-fördernden Medikamenten mit Drosophila

Drosophila is an excellent model organism that can be used to screen compounds that might be useful for cancer therapy. The method described here is a ...

Identification of Enhancer-Promoter Contacts in Embryoid Bodies by Quantitative Chromosome Conformation Capture (4C)

Identification of Enhancer-Promoter Contacts in Embryoid Bodies by Quantitative Chromosome Conformation Capture 4C

Identifizierung von Enhancer-Promoter-Kontakten in embryoiden Körpern durch quantitative Chromosomenkonformationserfassung (4C)

During mammalian development, cell fates are determined through the establishment of regulatory networks that define the specificity, timing, and spatial ...

Application of DNA Fingerprinting using the D1S80 Locus in Lab Classes

Application of DNA Fingerprinting using the D1S80 Locus in Lab Classes

Anwendung von DNA Fingerprinting mit dem D1S80 Locus in Laborklassen

In biological sciences, DNA fingerprinting has been widely used for paternity testing, forensic applications and phylogenetic studies. Here, we describe a ...

Investigating the Pathogenesis of MYH7 Mutation Gly823Glu in Familial Hypertrophic Cardiomyopathy using a Mouse Model

Untersuchung der Pathogenese der MYH7-Mutation Gly823Glu bei familiärer hypertropher Kardiomyopathie anhand eines Mausmodells

Familial hypertrophic cardiomyopathy (HCM, OMIM: 613690) is the most common cardiomyopathy in China. However, the underlying genetic etiology of HCM ...