Name: a non-random mouse model for pharmacological reactivation of mecp2 on the inactive x chromosome
Uploaded: 2019-05-22T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Non-random Mouse Model for Pharmacological Reactivation of Mecp2 on the Inactive X Chromosome at JoVE.com

המחברים מודים אנטוניו בדפורלוב על מתן ריאגנטים; אוניברסיטת וירג היסטולוגיה רקמות הליבה להקפאה; האוניברסיטה של וירג זרימה Cyהליבה ליבה עבור הניתוח cy, הזרמת הזרימה; כריסטיאן בלו ו Saloni סינג לקבלת סיוע טכני עם הדפס. עבודה זו היתה נתמכת על ידי מענק כפול מחקר Z.Z., ואת התוכנית פיילוט פרויקט פרס מאוניברסיטת וירג-וירג טק הקרן הטכנולוגי הקרן הארטבאר בודדים במחקר ביו פרס על S.B.

עבודה מעורבים עכברים אושרה על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים של אוניברסיטת וירג (IACUC;4112).
1. ליצור מודל מסוג XCI עכבר שאינו אקראי עם התווית גנטית Mecp2 על Xi
הערה: זנים העכבר המשמשים במחקר היו כדלקמן: Mecp2-gfp/Mecp2-gfp (Mecp2tm 3.1 ציפור, שו?...

<ol>
	<li>Lyon, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-chromosome+inactivation+as+a+system+of+gene+dosage+compensation+to+regulate+gene+expression.">X-chromosome inactivation as a system of gene dosage compensation to regulate gene expression.</a> Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology. 36, 119-130 (1989).</li><li>Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delving+into+the+diversity+of+facultative+heterochromatin:+the+epigenetics+of+the+inactive+X+chromosome.">Delving into the diversity of facultative heterochromatin: the epigenetics of the inactive X chromosome.</a> Current Opinion in Genetics Development. 15 (5), 482-489 (2005).</li><li>Augui, S., Nora, E. P., Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+X-chromosome+inactivation+by+the+X-inactivation+centre.">Regulation of X-chromosome inactivation by the X-inactivation centre.</a> Nature Review Genetics. 12 (6), 429-442 (2011).</li><li>Pontier, D. B., Gribnau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xist+regulation+and+function+explored.">Xist regulation and function explored.</a> Human Genetics. 130 (2), 223-236 (2011).</li><li>Barnes, C., Kanhere, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+RNA-Protein+Interactions+Through+In+Vitro+RNA+Pull-Down+Assays.">Identification of RNA-Protein Interactions Through In Vitro RNA Pull-Down Assays.</a> Methods in Molecular Biology. 1480, 99-113 (2016).</li><li>McHugh, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Xist+lncRNA+interacts+directly+with+SHARP+to+silence+transcription+through+HDAC3.">The Xist lncRNA interacts directly with SHARP to silence transcription through HDAC3.</a> Nature. 521 (7551), 232-236 (2015).</li><li>Minajigi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomes.+A+comprehensive+Xist+interactome+reveals+cohesin+repulsion+and+an+RNA-directed+chromosome+conformation.">Chromosomes. A comprehensive Xist interactome reveals cohesin repulsion and an RNA-directed chromosome conformation.</a> Science. 349 (6245), (2015).</li><li>Mira-Bontenbal, H., Gribnau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Xist-Interacting+Proteins+in+X-Chromosome+Inactivation.">New Xist-Interacting Proteins in X-Chromosome Inactivation.</a> Current Biology. 26 (8), R338-R342 (2016).</li><li>Mira-Bontenbal, H., Gribnau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Xist-Interacting+Proteins+in+X-Chromosome+Inactivation.">New Xist-Interacting Proteins in X-Chromosome Inactivation.</a> Curren Biology. 26 (10), 1383 (2016).</li><li>Ridings-Figueroa, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nuclear+matrix+protein+CIZ1+facilitates+localization+of+Xist+RNA+to+the+inactive+X-chromosome+territory.">The nuclear matrix protein CIZ1 facilitates localization of Xist RNA to the inactive X-chromosome territory.</a> Genes and Development. 31 (9), 876-888 (2017).</li><li>Sunwoo, H., Colognori, D., Froberg, J. E., Jeon, Y., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repeat+E+anchors+Xist+RNA+to+the+inactive+X+chromosomal+compartment+through+CDKN1A-interacting+protein+(CIZ1).">Repeat E anchors Xist RNA to the inactive X chromosomal compartment through CDKN1A-interacting protein (CIZ1).</a> Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. , (2017).</li><li>Bhatnagar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+pharmacological+reactivation+of+the+mammalian+inactive+X+chromosome.">Genetic and pharmacological reactivation of the mammalian inactive X chromosome.</a> Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (35), 12591-12598 (2014).</li><li>Zoghbi, H. Y., Percy, A. K., Schultz, R. J., Fill, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+X+chromosome+inactivation+in+the+Rett+syndrome.">Patterns of X chromosome inactivation in the Rett syndrome.</a> Brain Development. 12 (1), 131-135 (1990).</li><li>Anvret, M., Wahlstrom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rett+syndrome:+random+X+chromosome+inactivation.">Rett syndrome: random X chromosome inactivation.</a> Clinical Genetics. 45 (5), 274-275 (1994).</li><li>Amir, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rett+syndrome+is+caused+by+mutations+in+X-linked+MECP2,+encoding+methyl-CpG-binding+protein+2.">Rett syndrome is caused by mutations in X-linked MECP2, encoding methyl-CpG-binding protein 2.</a> Nature Genetics. 23 (2), 185-188 (1999).</li><li>Przanowski, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+reactivation+of+inactive+X-linked+Mecp2+in+cerebral+cortical+neurons+of+living+mice.">Pharmacological reactivation of inactive X-linked Mecp2 in cerebral cortical neurons of living mice.</a> Proceedings of Natlional Academy of Sciences of the United States of America. 115 (31), 7991-7996 (2018).</li><li>Borensztein, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xist-dependent+imprinted+X+inactivation+and+the+early+developmental+consequences+of+its+failure.">Xist-dependent imprinted X inactivation and the early developmental consequences of its failure.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 24 (3), 226-233 (2017).</li><li>Jensen, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+histological+staining+and+fluorescence+using+ImageJ.">Quantitative analysis of histological staining and fluorescence using ImageJ.</a> Anatomical Record (Hoboken). 296 (3), 378-381 (2013).</li><li>Cseke, L. J., Talley, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+PCR-based+genotyping+method+to+distinguish+between+wild-type+and+ornamental+varieties+of+Imperata+cylindrica.">A PCR-based genotyping method to distinguish between wild-type and ornamental varieties of Imperata cylindrica.</a> Journal of Visualized Experiments. (60), (2012).</li></ol>

בעבר, XCIFs כי הם נדרשים באופן סלקטיבי עבור השתקה של גנים מקושרים Xi בתאי נשים ביונקים זוהו12. אנחנו עוד אופטימיזציה מולקולה קטנה חזקה מעכבי כדי XCIFs היעד, כגון ACVR1 ו המורד הזרם של PDPK1, אשר ביעילות הפעלה מחדש של Xi Mecp2 בעכבר פיברוההדף קווים תא, נוירונים בקליפת העכבר, ו תא האדם פיברו?...

כרומוזום x הפעלה (XCI) הוא תהליך של פיצוי המינון המאזן ביטוי גנים מקושר X על ידי השתקה עותק אחד של כרומוזום X אצל נקבות1. כתוצאה מכך, כרומוזום X לא פעיל (Xi) מצטבר תכונות אופייניות של הטרוכרוטין כולל מתילציה DNA ומעכבות שינויים היסטון, כגון היסטון H3-ליזין 27 הטריתילציה (H3K27me3) ו H2A ההיסטון (H2Aub) 2. הרגולטור הראשי של כרומוזום x השתקה הוא מרכז x-inactivation פעלה (Xic) אזור, סביב 100 לערך 500 kb, אשר שולט את הספירה ואת הזיווג של כרומוזומים X, הבחירה האקראית של כרומוזום x עבור inactivation פעלה, ואת החניכה ו הפצת שהשתקה לאורך כרומוזום X3. התהליך של הפעלת X מופעל על ידי תעתיק ספציפי X לא פעיל (Xist) כי מעילים את Xi ב- cis כדי לתווך כרומוזום-רחב השתקה לשפץ את המבנה תלת מימדי של כרומוזום X4. לאחרונה, כמה מסכי פרוטאומית וגנטית זיהו הרגולטורים נוספים של xci, כגון שישי אינטראקציה חלבונים5,6,7,8,9 , מיכל עשור , מיכל בן 11 , 12. למשל, מחקר הקודם באמצעות הגנום משוחדת כלל הפרעה RNA התערבות מזוהה 13 משחק טרנסמפעל גורמי Xci (xcifs)12. מכונאי, XCIFs להסדיר ביטוי Xist ולכן, הפרעה עם הפונקציה xcifs גורם לפגום xci12. יחד, ההתקדמות האחרונה בתחום סיפקו תובנות חשובות לתוך המנגנון המולקולרי הנדרש ליזום ולתחזק XCI.
זיהוי של הרגולטורים xci והבנת המנגנון שלהם ב-xci רלוונטי ישירות למחלות אנושיות המקושרות באמצעות X, כגון תסמונת רט (rtt)13,14. RTT היא הפרעה נוירוהתפתחותית נדירה הנגרמת על ידי מוטציה heterozygous בחלבון כריכת מתיל-CpG מקושר-X 2 (MECP2) המשפיעה בעיקר על בנות15. מכיוון MECP2 ממוקם על כרומוזום X, בנות rtt הם Heterozygous עבור MECP2 מחסור עם ~ 50% תאים המבטא פראי סוג ו ~ 50% להביע MECP2מוטציה. במיוחד, RTT תאי מוטציה הנמל העתק רדום אך פראי של Mecp2 על Xi, מתן מקור של הגן הפונקציונלי, אשר אם מופעל מראש, עלול להקל על סימפטומים של המחלה. בנוסף RTT, יש כמה מחלות אחרות הקשורות ל-X, שעבורן ההפעלה החוזרת של Xi מייצגת גישה טיפולית פוטנציאלית, כגון תסמונת DDX3X.
עיכוב של XCIFs, 3-פוספהונותזול חלבון קינאז-1 (PDPK1), ופעילות מסוג קולטן 1 (ACVR1), או על ידי מעכבי מולקולה קטנה (שרין) או מולקולת מולקולות קטנות, מפעיל מחדש את הגנים המקושרים Xi12. ההפעלה הפרמקולוגית של גנים מקושרים Xi הוא נצפתה בדגמי vivo ex שונים הכוללים את העכבר לתאי הפיצוץ קווים, נוירונים למבוגרים העכבר הקליפת המין, העכבר העובריים מתחלקים, ואת קווי התאים פיברובפיצוץ נגזר מחולה RTT12. עם זאת, אם ההפעלה הפרמקולוגית של גנים מקושרים Xi הוא אפשרי vivo שרידים להיות הפגינו. גורם מגביל אחד הוא חוסר של מודלים יעילים בעלי חיים כדי למדוד במדויק את הביטוי של גנים מופעל מראש Xi. לקראת מטרה זו, XistΔ: Mecp2/Xist: Mecp2-Gfp מודל העכבר נוצר כי נושאת גנטית מתויג Mecp2 על Xi בכל התאים בשל Heterozygous מחיקה ב Xist על כרומוזום X אימהי16. באמצעות מודל זה, הביטוי של Mecp2 מ Xi כבר כימות בעקבות הטיפול עם מעכבי XCIFs במוח של עכברים חיים. כאן, הדור של הXistΔ: Mecp2/Xist: Mecp2-Gfp מודל העכבר ומתודולוגיה כדי כימות ההפעלה הראשונה של נוירונים בקליפת הסביבה המבוססת על מבוססי immunofluorescence מבוססת מתוארת.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >MICE</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mecp2tm3.1Bird</td>
			<td >The Jackson Laboratory</td>
			<td>#014610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >B6;129-Xist (tm5Sado)</td>
			<td>provided by Antonio Bedalov, Fred Hutchinson Cancer Center, Seattle</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >REAGENTS</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >22x22 mm coverslip</td>
			<td >FISHERfinest (Fisher Scientific)</td>
			<td >125488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >32% Paraformaldehyde</td>
			<td >Electron Microscopy Sciences</td>
			<td >15714-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >50 ml syringe</td>
			<td>Medline Industries</td>
			<td>NPMJD50LZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >60mm culture dish</td>
			<td >CellStar</td>
			<td >628160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >7-AAD </td>
			<td >BioLegend</td>
			<td >420403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ammonium chloride (NH4Cl)</td>
			<td >Fisher Chemical</td>
			<td >A661-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >anti-GFP-AlexaFluor647</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td >A-31852</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >anti-MAP2</td>
			<td >Aves Labs</td>
			<td >MAP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >BSA</td>
			<td >Promega</td>
			<td >R396D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Buprenorphine SR</td>
			<td >Zoopharm</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >citric acid </td>
			<td >Sigma</td>
			<td >C-1857</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DMSO</td>
			<td >Fisher Bioreagents</td>
			<td >BP231-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td >Corning Cellgro</td>
			<td >10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethanol</td>
			<td >Decon Labs</td>
			<td >2701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td >VWR Life Science</td>
			<td>89510-198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >gelatin</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >G9391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >glass slides</td>
			<td >Fisherbrand</td>
			<td >22-034-486</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >goat anti-chicken FITC-labeled secondary antibody </td>
			<td >Aves Labs</td>
			<td >F-1005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >GSK650394</td>
			<td >ApexBio</td>
			<td >B1051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >hamilton 10&#956;l syringe </td>
			<td >Hamilton Sigma-Aldrich</td>
			<td >28615-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >14025-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ketamine</td>
			<td>Ketaset</td>
			<td>NDC 0856-2013-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Large blunt/blunt curved scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14519-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >LDN193189</td>
			<td >Cayman Chemicals</td>
			<td >11802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >lodixanol</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >1343517</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >magnesium chloride (MgCl2)</td>
			<td >Fisher Chemical</td>
			<td >M35-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Methylcelulose</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >M0262-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >mounting medium with DAPI </td>
			<td >Vectashield</td>
			<td >H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Needle tip, 26 GA x 1.25&#34;</td>
			<td >PrecisionGlide</td>
			<td >305111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ophthalmic ointment </td>
			<td >Refresh Lacri-Lube</td>
			<td >93468</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >optimal cutting temperature (O.C.T.) </td>
			<td >ThermoFisher</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PCR mix</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep)</td>
			<td >Corning</td>
			<td >30-002-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Phosphate buffered saline pH 7.4 (PBS)</td>
			<td >Corning Cellgro</td>
			<td >46-103-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Potassium chloride (KCl)</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >P330-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >scalpel blades</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Shallow glass or plastic tray</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >skin glue/tissue adhesive</td>
			<td >3M Vetbond</td>
			<td >1469SB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >sodium azide</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >CAS 26628-22-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td >Fisher Chemical</td>
			<td >S642-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >standard hemostat forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>13013-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Standard tweezers</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11027-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Straight iris scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14058-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >sucrose</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >BP220-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tris-base</td>
			<td >Fisher Bioreagents</td>
			<td >BP152-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Triton X-100</td>
			<td >Fisher Bioreagents</td>
			<td >BP151-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypsin-EDTA </td>
			<td >Gibco</td>
			<td >15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Xylazine</td>
			<td >Akorn</td>
			<td>NDC: 59399-111-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EQUIPMENT</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Zeiss AxioObserver Live-Cell microscope </td>
			<td >Zeiss</td>
			<td >Zeiss AxioObserver</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.45mm burr</td>
			<td >IDEAL MicroDrill</td>
			<td >67-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >BD FACScalibur</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >centrifuge</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >glass homogenizer</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >cell culture incubator</td>
			<td >Thermo Scientific HERACELL VIOS 160i</td>
			<td >13-998-213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Leica 3050S research cryostat </td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >stereotactic platform </td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >thermocycler</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Timer</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ultracentrifuge</td>
			<td >Beckman Coulter Optima L-100 XP</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Water bath (37 &#186;C)</td>
			<td >Fisher Scientific Isotemp 2239</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a non-random mouse model for pharmacological reactivation of mecp2 on the inactive x chromosome

כרומוזום x הפעלה (XCI) הוא אקראי השתקה של כרומוזום X אחד אצל נקבות כדי להשיג איזון המינון הגנטי בין המינים. כתוצאה מכך, כל הנקבות מheterozygous ביטוי גנטי מקושר ל-X. אחד הרגולטורים המפתח של XCI הוא Xist, אשר חיוני עבור ייזום ותחזוקה של xci. מחקרים קודמים זיהו 13 משחק טרנס כרומוזום X בכרומוזום הפעלה (XCIFs) באמצעות בקנה מידה גדול, אובדן הפונקציה של המסך הגנטי. עיכוב של XCIFs, כגון ACVR1 ו-PDPK1, באמצעות מעכבי מולקולת ה-RNA או מולקולה קטנה, מפעיל מחדש את הגנים המקושרים כרומוזום X בתאים מתורבתים. אבל הכדאיות והסבילות של הפעלה מחדש של כרומוזום X לא פעיל בvivo שרידים להיקבע. לקראת מטרה זו, XistΔ: Mecp2/Xist: Mecp2-Gfp מודל העכבר נוצר עם xci שאינם אקראיים בשל מחיקה של xist על כרומוזום X אחד. באמצעות מודל זה, היקף ההפעלה הפעילה של X לא פעיל היה כימות במוח העכבר לאחר הטיפול עם מעכבי XCIF. תוצאות שפורסמו לאחרונה להראות, בפעם הראשונה, כי עיכוב תרופתי של XCIFs מפעיל מחדש Mecp2 מן כרומוזום X לא פעיל בנוירונים בקליפת המוח של העכבר החי.

כדי להדגים את הכדאיות של XistΔ: Mecp2/Xist: Mecp2-Gfp מודל העכבר עבור לימודי ההפעלה מראש של XI, xcif מעכבי-בתיווך ההפעלה של xi מקושרים Mecp2-gfp נבדק העכבר מעובריים מתחלקים (mefs). הנקבה MEFs היו מבודדים מיום 15.5 XistΔ: Mecp2/Xist: Mecp2-Gfp העוברים כמתואר בסעיף 3 (איור 1a). הגנוטיפים של הנ...

Watch this Scientific Journal Video about A Non-random Mouse Model for Pharmacological Reactivation of Mecp2 on the Inactive X Chromosome at JoVE.com

A Non-random Mouse Model for Pharmacological Reactivation of Mecp2 on the Inactive X Chromosome

כאן, אנו מתארים פרוטוקול כדי ליצור מודל קיימא נשי מורטין עם כרומוזום לא אקראי הפעלה X, כלומר, maternally בירושה כרומוזום X אינו פעיל ב 100% של התאים. כמו כן, אנו מתארים פרוטוקול לבדיקת היתכנות, סבילות, ובטיחות של ההפעלה הפרמקולוגית של כרומוזום X לא פעיל ב vivo.

מודל עכבר שאינו אקראי עבור ההפעלה הפרמקולוגית של Mecp2 על כרומוזום X לא פעיל

X chromosome inactivation (XCI) is the random silencing of one X chromosome in females to achieve gene dosage balance between the sexes. As a result, all ...

פרוטוקול זה יכול לשמש ליצירת מודל עכבר לא אקראי לבדיקה וכמות של הפעלה מחדש של כרומוזום Mecp2 לא פעיל מקושר X במוחו של עכבר חי. מודל זה ניתן לשנות בקלות כדי ללמוד Xi הפעלה מחדש במודלים אחרים של מחלות הקשורות X כגון תסמונת DDX3X. אני פוסט דוק במעבדה של סנצ'יטה בהטנגר ואני אדגים את ההליך עם זמינג ז'נג.התחל על ידי מיקום העכבר ההרדמה בפלטפורמה סטראוטקטית עם החותכים מכורים מוט הנשיכה של מרסן חוטם. הדקו את מהדק האף תוך שמירה על ראש העכבר במישור מאוזן. התאימו את גובה האוזן כדי להגיע לחלק הקוודאלי של תעלת האוזן כדי לשמור על הראש משותק.לאחר מכן לחטא את הראש עם מגבונים לסירוגין של חיטוי אקטואלי 70%אתנול. כאשר העכבר מוכן, להשתמש אזמל סטרילי לעשות חתך אופקי 0.75 ס"מ בקרקפת האמצעית. השתמש 0.45 מילימטר בר לקדוח שני חורים סימטריים מעל ההמיספרות קליפת המוח הימנית והשמאלית שני מילימטרים מן התפר sagittal ואת התפר lambdoid באמצע המשוער של עצם קודקוד.חבר בחוזקה מזרק 10 microliter לפלטפורמה סטראוטקטית לטעון 10 microliters של מעכב כימי מוכן טרי לתוך המזרק. לקדם את המחט לתוך החור בר הראשון תוך שמירה על המחט בניצב לגולגולת. כאשר המחט חוצה את הגולגולת, אפס את הקואורדינטות על התצוגה הדיגיטלית הסטראוטקטית ולקדם את קצה המחט עד שהוא מגיע לעומק של 2.5 מילימטרים.משיכת המחט 0.5 מילימטרים לעומק של שני מילימטרים לאט להזריק את כל נפח 10 microliter של הפתרון על פני תקופה של דקה אחת. לאחר שכל המעכב נמסר, להשאיר את המחט במוח עוד דקה לפני משיכת המחט. חזור על ההזרקה לתוך חור בר השני באמצעות הרכב רק כפקד ולסגור את העור על החתך.לאחר מכן להעביר את העכבר מן המנגנון הסטראוטקטי על כרית חימום 37 מעלות צלזיוס עם ניטור עד התאוששות מלאה. בסוף משטר המינון, לאבטח את העכבר על כרית חיטוי. השתמש מספריים ומדפים לעשות חתך צידי דרך ההסתייגות ואת דופן הבטן ממש מתחת לבית החזה.בזהירות להפריד את הכבד מן הסרעפת לחתוך דרך הסרעפת לאורך כל הצלעות כדי לחשוף את החלל pleural. השתמש במספריים כדי להפוך חתך לקצה האחורי של החדר השמאלי מיד להזריק את תא הלב הימני עם כ 15 מיליליטר של PBS על פני תקופה של שתי דקות. תחליף מוצלח יגרום לשינוי בצבע הכבד מ אדום לוורוד חיוור.כאשר כל PBS נמסר, לבלבל את הלב עם כ 10 מיליליטר של 4% paraformaldehyde ב PBS במשך שתי דקות. לאחר קצירת הראש, השתמש במספריים כדי לבצע חתך קו האמצע בקרקפת כדי לחשוף את הגולגולת. מניחים קצה אחד של המספריים לתוך מגנום foramen כדי להקל על יצירת חתך בצלבי בגולגולת לכיוון העין.בצע חתך דומה בצד השני של הגולגולת שמירה על קצה המספריים שטחי ככל האפשר לחתוך את האזור של הגולגולת בין העיניים ומעל האף של העכבר. השתמש במקלפים כדי לקלף בעדינות את עצמות הגולגולת מחצי הכדור במוח ולהשתמש מרית כדי לרומם את המוח. בזהירות לנתח את סיבי עצב הגולגולת לתקן את המוח לגולגולת וממקמים את המוח לתוך צלחת פלסטיק.ואז בלו את המוח הקטן ונורות הריח. כדי להשיג חלקים של רקמת המוח, תחילה לתקן את המוח בצינור 15 מיליליטר מלא 4% paraformaldehyde ב PBS בארבע מעלות צלזיוס לילה. למחרת בבוקר, לשטוף את רקמת המוח לפחות שלוש פעמים במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס PBS טרי לכל לשטוף.לאחר הכביסה האחרונה, להסיר את החלק הקדמי של כל חצי הכדור עם מספריים ומדפים ולמקום את הדגימות לתוך ההקפאה שכותרתו cryo-תבניות בצד הקדמי למטה. טביעה כל רקמה בטמפרטורת חיתוך אופטימלית בינונית לפני הצמד הקפאת הדגימות חנקן נוזלי בצלחת פטרי פלסטיק 10 מילימטר עבור מינוס 80 מעלות צלזיוס אחסון. כדי לקבוע הפעלה מחדש של Xi, לטבול חמישה עד שישה מקטעי רקמת המוח מיקרומטר בתתברית אחזור אנטיגן במשך חמש דקות על בלוק חום 100 מעלות צלזיוס.בסוף הדגירה, לשטוף את המגלשות עם ארבע חמש דקות שטיפה בטמפרטורת החדר עם PBS טרי לכל לשטוף לפני שקוע את השקופיות בתסימת חסימה. לאחר 20 דקות בטמפרטורת החדר, לשטוף את המגלשות שלוש פעמים במשך חמש דקות במאגר לשטוף טרי לכל לשטוף. הכתם את דגימות הרקמה בנוגדנים הראשוניים המתאימים בארבע מעלות צלזיוס במהלך הלילה.תמונה השקופיות על מיקרוסקופ פלואורסצנטי התאמת הניגודיות והבהירות כדי לאפשר כימות של מספר התאים החיוביים GFP עבור שניהם סמים ורכב מטופלים ההמיספרות המוח העכבר. כדי להדגים את ההיתכנות של מודל עכבר איון כרומוזום X לא אקראי עבור מחקרי הפעלה מחדש כרומוזום X לא פעיל, הגנוטיפים של פיברובלסט עוברי עכבר מהופנט נקבה אושרו על ידי genotyping PCR ו cytometry זרימה. כפי שהוערך על ידי PCR, הביטוי של GFP מתויג מתילן CPG חלבון מחייב שני גן או MECP2 הופעל מחדש על ידי תרופה אבל לא טיפול ברכב.לא אקראי X כרומוזום איון עכבר מודל פיברובלסטים עובריים גם הביע GFP גרעיני לאחר טיפול תרופתי אבל לא רכב המדגים את מעכבי גורם איון כרומוזום X להפעיל מחדש כרומוזום X לא מופעל מקושר MECP2 ב fibroblasts עוברי העכבר. טיפול תרופתי הפעלה מחדש של כרומוזום X מ-MECP2-GFP בכ-30% מהתאים בהמיספרות מוח חדורים בסמים, בעוד שלא זוהתה הפעלה מחדש בהמיספרות חדורים ברכב. חלבון הקשורים Microtubule שני נוירונים חיוביים הם גם GFP חיובי בהמיספרות שטופלו בסמים המעידים על ביטוי כרומוזום X מושבת MECP2-GFP.משטר התרופה יהיה תלוי במטרה ואת היעילות של מעכבי מולקולה קטנה כדי לייעל את המינון והטיפול במבחנה לפני הבדיקה במבחנה. מודל העכבר הלא אקראי יכול להיות מנוצל כדי לבדוק תרופות שונות בנפרד או בשילוב. למעשה, אנו ואחרים זיהינו מספר גורמי איון כרומוזום X מסוממים.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Molecular Biology

Genetics

Unit 2

Mendelian Genetics

SCIENTISTS IN ACTION

Conjugative Mating Assays for Sequence-specific Analysis of Transfer Proteins Involved in Bacterial Conjugation

מבחני מזווג Conjugative עבור ניתוח רצף ספציפי של חלבוני העברה מעורבים קוניוגציה

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia ...

Pooled shRNA Screen for Reactivation of MeCP2 on the Inactive X Chromosome

במאגר shRNA מסך עבור הפעלה מחדש של MeCP2 על כרומוזום X לא פעיל

Forward genetic screens using reporter genes inserted into the heterochromatin have been extensively used to investigate mechanisms of epigenetic control ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

זיהוי תפוקה גבוהה של ג'ין רצפים תקינה באמצעות רצף הדור הבא של כרומוזום מעגלי קונפורמציה ללכוד (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

הנדסה גנטית של Dictyostelium discoideum תאים בהתבסס על הבחירה וצמיחה על חיידקים

Dictyostelium discoideum is an intriguing model organism for the study of cell differentiation processes during development, cell signaling, and other ...

Mass Spectrometry-Based Proteomics Analyses Using the OpenProt Database to Unveil Novel Proteins Translated from Non-Canonical Open Reading Frames

ניתוחים פרוטאומיקס מבוססי ספקטרומטר מסה משימוש במסד הנתונים OpenProt לחשוף את הרומן חלבונים מתורגם ממסגרות קאנונית קריאה פתוחה

Genome annotation is central to today's proteomic research as it draws the outlines of the proteomic landscape. Traditional models of open reading frame ...

A Robust Polymerase Chain Reaction-based Assay for Quantifying Cytosine-guanine-guanine Trinucleotide Repeats in Fragile X Mental Retardation-1 Gene

בסיס מבוסס על תגובת שרשרת פולימראז חזקה עבור כימות ציטוסינוס-גואנין-גואנין Trinucleotide גאות חוזר בצורה שברירית X פיגור-1 גן

Fragile X syndrome (FXS) and associated disorders are caused by expansion of the cytosine-guanine-guanine (CGG) trinucleotide repeat in the 5&#8217; ...

A Screening Method for Identification of Heterochromatin-Promoting Drugs Using Drosophila

A Screening Method for Identification of Heterochromatin-Promoting Drugs Using Drosophila

שיטת הקרנה לזיהוי הטרוכרומטין-קידום תרופות באמצעות דרוזוהילה

Drosophila is an excellent model organism that can be used to screen compounds that might be useful for cancer therapy. The method described here is a ...

Identification of Enhancer-Promoter Contacts in Embryoid Bodies by Quantitative Chromosome Conformation Capture (4C)

Identification of Enhancer-Promoter Contacts in Embryoid Bodies by Quantitative Chromosome Conformation Capture 4C

זיהוי אנשי קשר של משפר-יזם ב Embryoid גופים על-ידי לכידת כרומוזום קונפורמציה כמותית (4C)

During mammalian development, cell fates are determined through the establishment of regulatory networks that define the specificity, timing, and spatial ...

Application of DNA Fingerprinting using the D1S80 Locus in Lab Classes

Application of DNA Fingerprinting using the D1S80 Locus in Lab Classes

יישום של טביעת אצבע DNA באמצעות לוקוס D1S80 בשיעורי מעבדה

In biological sciences, DNA fingerprinting has been widely used for paternity testing, forensic applications and phylogenetic studies. Here, we describe a ...

Investigating the Pathogenesis of MYH7 Mutation Gly823Glu in Familial Hypertrophic Cardiomyopathy using a Mouse Model

חקירת הפתוגנזה של מוטציית MYH7 Gly823Glu בקרדיומיופתיה היפרטרופית משפחתית באמצעות מודל עכבר

Familial hypertrophic cardiomyopathy (HCM, OMIM: 613690) is the most common cardiomyopathy in China. However, the underlying genetic etiology of HCM ...