Name: a non-random mouse model for pharmacological reactivation of mecp2 on the inactive x chromosome
Uploaded: 2019-05-22T14:00:00
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लेखकों अभिकर्मक प्रदान करने के लिए एंटोनियो Bedalov धंयवाद; Cryosectioning के लिए वर्जीनिया ऊतक हिस्टोलोजी कोर के विश्वविद्यालय; वर्जीनिया के प्रवाह कोशिका मिति प्रवाह के लिए Cytometry कोर के विश्वविद्यालय के विश्लेषण; जेनोटाइपिंग के साथ तकनीकी सहायता के लिए क्रिश्चियन ब्लू और सलोनी सिंह । इस काम का समर्थन किया गया था एक डबल हू अनुसंधान अनुदान के लिए Z.Z., और एक पायलट परियोजना कार्यक्रम पुरस्कार से वर्जीनिया विश्वविद्यालय-वर्जीनिया टेक बीज कोष पुरस्कार और Hartwell फाउंडेशन व्यक्तिगत जैव चिकित्सा अनुसंधान पुरस्कार के लिए एसबी चव्हाण

चूहों से जुड़े कार्य को वर्जीनिया इंस्टीट्यूशनल एनिमल केयर एंड यूज कमेटी (IACUC; #4112) द्वारा अनुमोदित किया गया ।
1. उत्पंन एक गैर यादृच्छिक XCI माउस मॉडल के साथ आनुवंशिक रूप से लेबल Mecp2 पर ग्यारहवीं<...

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	<li>Lyon, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-chromosome+inactivation+as+a+system+of+gene+dosage+compensation+to+regulate+gene+expression.">X-chromosome inactivation as a system of gene dosage compensation to regulate gene expression.</a> Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology. 36, 119-130 (1989).</li><li>Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delving+into+the+diversity+of+facultative+heterochromatin:+the+epigenetics+of+the+inactive+X+chromosome.">Delving into the diversity of facultative heterochromatin: the epigenetics of the inactive X chromosome.</a> Current Opinion in Genetics Development. 15 (5), 482-489 (2005).</li><li>Augui, S., Nora, E. P., Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+X-chromosome+inactivation+by+the+X-inactivation+centre.">Regulation of X-chromosome inactivation by the X-inactivation centre.</a> Nature Review Genetics. 12 (6), 429-442 (2011).</li><li>Pontier, D. B., Gribnau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xist+regulation+and+function+explored.">Xist regulation and function explored.</a> Human Genetics. 130 (2), 223-236 (2011).</li><li>Barnes, C., Kanhere, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+RNA-Protein+Interactions+Through+In+Vitro+RNA+Pull-Down+Assays.">Identification of RNA-Protein Interactions Through In Vitro RNA Pull-Down Assays.</a> Methods in Molecular Biology. 1480, 99-113 (2016).</li><li>McHugh, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Xist+lncRNA+interacts+directly+with+SHARP+to+silence+transcription+through+HDAC3.">The Xist lncRNA interacts directly with SHARP to silence transcription through HDAC3.</a> Nature. 521 (7551), 232-236 (2015).</li><li>Minajigi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomes.+A+comprehensive+Xist+interactome+reveals+cohesin+repulsion+and+an+RNA-directed+chromosome+conformation.">Chromosomes. A comprehensive Xist interactome reveals cohesin repulsion and an RNA-directed chromosome conformation.</a> Science. 349 (6245), (2015).</li><li>Mira-Bontenbal, H., Gribnau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Xist-Interacting+Proteins+in+X-Chromosome+Inactivation.">New Xist-Interacting Proteins in X-Chromosome Inactivation.</a> Current Biology. 26 (8), R338-R342 (2016).</li><li>Mira-Bontenbal, H., Gribnau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Xist-Interacting+Proteins+in+X-Chromosome+Inactivation.">New Xist-Interacting Proteins in X-Chromosome Inactivation.</a> Curren Biology. 26 (10), 1383 (2016).</li><li>Ridings-Figueroa, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nuclear+matrix+protein+CIZ1+facilitates+localization+of+Xist+RNA+to+the+inactive+X-chromosome+territory.">The nuclear matrix protein CIZ1 facilitates localization of Xist RNA to the inactive X-chromosome territory.</a> Genes and Development. 31 (9), 876-888 (2017).</li><li>Sunwoo, H., Colognori, D., Froberg, J. E., Jeon, Y., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repeat+E+anchors+Xist+RNA+to+the+inactive+X+chromosomal+compartment+through+CDKN1A-interacting+protein+(CIZ1).">Repeat E anchors Xist RNA to the inactive X chromosomal compartment through CDKN1A-interacting protein (CIZ1).</a> Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. , (2017).</li><li>Bhatnagar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+pharmacological+reactivation+of+the+mammalian+inactive+X+chromosome.">Genetic and pharmacological reactivation of the mammalian inactive X chromosome.</a> Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (35), 12591-12598 (2014).</li><li>Zoghbi, H. Y., Percy, A. K., Schultz, R. J., Fill, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+X+chromosome+inactivation+in+the+Rett+syndrome.">Patterns of X chromosome inactivation in the Rett syndrome.</a> Brain Development. 12 (1), 131-135 (1990).</li><li>Anvret, M., Wahlstrom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rett+syndrome:+random+X+chromosome+inactivation.">Rett syndrome: random X chromosome inactivation.</a> Clinical Genetics. 45 (5), 274-275 (1994).</li><li>Amir, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rett+syndrome+is+caused+by+mutations+in+X-linked+MECP2,+encoding+methyl-CpG-binding+protein+2.">Rett syndrome is caused by mutations in X-linked MECP2, encoding methyl-CpG-binding protein 2.</a> Nature Genetics. 23 (2), 185-188 (1999).</li><li>Przanowski, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+reactivation+of+inactive+X-linked+Mecp2+in+cerebral+cortical+neurons+of+living+mice.">Pharmacological reactivation of inactive X-linked Mecp2 in cerebral cortical neurons of living mice.</a> Proceedings of Natlional Academy of Sciences of the United States of America. 115 (31), 7991-7996 (2018).</li><li>Borensztein, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xist-dependent+imprinted+X+inactivation+and+the+early+developmental+consequences+of+its+failure.">Xist-dependent imprinted X inactivation and the early developmental consequences of its failure.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 24 (3), 226-233 (2017).</li><li>Jensen, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+histological+staining+and+fluorescence+using+ImageJ.">Quantitative analysis of histological staining and fluorescence using ImageJ.</a> Anatomical Record (Hoboken). 296 (3), 378-381 (2013).</li><li>Cseke, L. J., Talley, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+PCR-based+genotyping+method+to+distinguish+between+wild-type+and+ornamental+varieties+of+Imperata+cylindrica.">A PCR-based genotyping method to distinguish between wild-type and ornamental varieties of Imperata cylindrica.</a> Journal of Visualized Experiments. (60), (2012).</li></ol>

पहले, XCIFs कि चुनिन्दा स्तनधारी महिला कोशिकाओं में ग्यारहवीं से जुड़े जीन के लिए चयन की आवश्यकता है12की पहचान की गई । हम आगे ACVR1 और PDPK1 के बहाव effectors, जो कुशलतापूर्वक ग्यारहवीं माउस फाइकोब्लास्ट सेल ला...

एक्स क्रोमोसोम इनएक्टिवेशन (XCI) खुराक क्षतिपूर्ति की एक प्रक्रिया है जो एक्स-लिंक्ड जीन एक्सप्रेशन को महिलाओं में एक्स क्रोमोसोम की एक प्रति कोसाइलैंसिंग करके संतुलित करता है | एक परिणाम के रूप में, निष्क्रिय एक्स गुणसूत्र (Xi) में डीएनए मेथिलन और निरोधात्मक हिस्टोन संशोधनों, जैसे हिस्टोन H3-lysine 27 trimethylation (H3K27me3) और हिस्टोन H2A सर्वव्यापी (H2Aub) सहित विषमवर्णक की विशिष्ट सुविधाओं जमा 2. एक्स गुणसूत्र मुंह बंद के मास्टर नियामक एक्स-inactivation केंद्र (xic) क्षेत्र, लगभग 100 − 500 केबी, जो गिनती और एक्स क्रोमोसोम के युग्मन, inactivation के लिए एक्स गुणसूत्र के यादृच्छिक चयन को नियंत्रित करता है, और दीक्षा और 3क्रोमोसोम के साथ साइलैंसिंग का फैलाव. एक्स inactivation की प्रक्रिया एक्स निष्क्रिय विशिष्ट प्रतिलिपि (Xist) है कि सीआईएस में ग्यारहवीं कोट करने के लिए गुणसूत्र व्यापक मुंह में और फिर से तैयार की तीन आयामी संरचना एक्स गुणसूत्र4के द्वारा शुरू की है । हाल ही में, कई proteomic और आनुवंशिक स्क्रीन xci के अतिरिक्त नियामकों की पहचान की है, जैसे xci के रूप में बातचीत प्रोटीन5,6,7,8,9 , 10 , 11 , 12. उदाहरण के लिए, एक निष्पक्ष जीनोम व्यापक आरएनए हस्तक्षेप स्क्रीन का उपयोग कर पिछले एक अध्ययन 13 पारXci कारकों (xcifs)12की पहचान की । यंत्रवत्, XCIFs Xist अभिव्यक्ति को विनियमित और इसलिए, xci समारोह के साथ हस्तक्षेप दोषपूर्ण xसीआई12का कारण बनता है । साथ में, क्षेत्र में हाल ही में अग्रिमों आणविक मशीनरी है कि शुरू करने और XCI बनाए रखने के लिए आवश्यक है में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान की है ।
Xci नियामकों की पहचान और उनके तंत्र को समझना एक्स-लिंक्ड मानव रोगों, जैसे rett सिंड्रोम (rtt)13,14के लिए सीधे प्रासंगिक है । Rtt एक दुर्लभ neurodevelopmental विकार एक्स में एक विषम युग्मज उत्परिवर्तन की वजह से जुड़े methyl-cpg बाध्यकारी प्रोटीन 2 (MECP2) है कि मुख्य रूप से लड़कियों को प्रभावित करता है15। MECP2 एक्स गुणसूत्र पर स्थित है, क्योंकि rtt लड़कियों ~ ५०% कोशिकाओं जंगली प्रकार व्यक्त करने और ~ ५०% उत्परिवर्ती MECP2व्यक्त करने के साथ MECP2 की कमी के लिए विषम युग्मज हैं । विशेष रूप से, RTT उत्परिवर्ती कोशिकाओं को ग्यारहवीं पर Mecp2 के एक निष्क्रिय लेकिन जंगली प्रकार की प्रतिलिपि, कार्यात्मक जीन है, जो अगर फिर से सक्रिय, संभवतः रोग के लक्षणों को कम कर सकता का एक स्रोत प्रदान हार्बर । RTT के अलावा, वहाँ रहे हैं कई अन्य एक्स से जुड़े मानव रोगों, जिसके लिए ग्यारहवीं के पुनः सक्रियण ऐसे DDX3X सिंड्रोम के रूप में एक संभावित चिकित्सीय दृष्टिकोण, का प्रतिनिधित्व करता है.
XCIFs का निषेध, 3-फ़ॉसफोनोसिटाइड आश्रित प्रोटीन kinase-1 (PDPK1), और activin एक रिसेप्टर प्रकार 1 (ACVR1), या तो शॉर्ट हेयरपिन आरएनए (एसएचएनए) या छोटे अणु निरोधक द्वारा, Xi-लिंक्ड जीन को पुनः सक्रिय करता है12. ग्यारहवीं से जुड़े जीन के औषधीय पुनः सक्रियण विभिन्न पूर्व vivo मॉडल है कि माउस फाइब्रोब्लास्ट सेल लाइनों, वयस्क माउस वल्कुट ंयूरॉंस, माउस भ्रूणीय रेशकोरक, और एक rtt रोगी12से व्युत्पंन फाइब्रोब्लास्ट सेल लाइनों को शामिल में मनाया जाता है । तथापि, क्या vivo में ग्यारहवीं से जुड़े जीन के औषधीय पुनर्सक्रियन संभव है कि प्रदर्शन किया जाना है । एक सीमित कारक प्रभावी पशु मॉडल की कमी को सही ढंग से पुनः सक्रिय ग्यारहवीं से जीन की अभिव्यक्ति को मापने के लिए है । इस लक्ष्य की ओर, एक xistδ: Mecp2/xist: Mecp2-gfp माउस मॉडल है कि ग्यारहवीं पर आनुवंशिक रूप से लेबल Mecp2 xist में मातृक एक्स गुणसूत्र16पर विषम युग्मज विलोपन के कारण सभी कोशिकाओं में किया जाता है । इस मॉडल का उपयोग करना, ग्यारहवीं से Mecp2 की अभिव्यक्ति जीवित चूहों के मस्तिष्क में XCIFs inhibitors के साथ उपचार के बाद quantitated किया गया है. यहाँ, xistδ की पीढ़ी : Mecp2/xist: Mecp2-gfp माउस मॉडल और विधि immunofluorescence-आधारित assays हैं का उपयोग कर वल्कुट ंयूरॉंस में quantitate ग्यारहवीं रिनोवेशन करने के लिए वर्णित है ।

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	<tbody>
		<tr >
			<td >MICE</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mecp2tm3.1Bird</td>
			<td >The Jackson Laboratory</td>
			<td>#014610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >B6;129-Xist (tm5Sado)</td>
			<td>provided by Antonio Bedalov, Fred Hutchinson Cancer Center, Seattle</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >REAGENTS</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >22x22 mm coverslip</td>
			<td >FISHERfinest (Fisher Scientific)</td>
			<td >125488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >32% Paraformaldehyde</td>
			<td >Electron Microscopy Sciences</td>
			<td >15714-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >50 ml syringe</td>
			<td>Medline Industries</td>
			<td>NPMJD50LZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >60mm culture dish</td>
			<td >CellStar</td>
			<td >628160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >7-AAD </td>
			<td >BioLegend</td>
			<td >420403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ammonium chloride (NH4Cl)</td>
			<td >Fisher Chemical</td>
			<td >A661-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >anti-GFP-AlexaFluor647</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td >A-31852</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >anti-MAP2</td>
			<td >Aves Labs</td>
			<td >MAP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >BSA</td>
			<td >Promega</td>
			<td >R396D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Buprenorphine SR</td>
			<td >Zoopharm</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >citric acid </td>
			<td >Sigma</td>
			<td >C-1857</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DMSO</td>
			<td >Fisher Bioreagents</td>
			<td >BP231-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td >Corning Cellgro</td>
			<td >10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethanol</td>
			<td >Decon Labs</td>
			<td >2701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td >VWR Life Science</td>
			<td>89510-198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >gelatin</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >G9391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >glass slides</td>
			<td >Fisherbrand</td>
			<td >22-034-486</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >goat anti-chicken FITC-labeled secondary antibody </td>
			<td >Aves Labs</td>
			<td >F-1005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >GSK650394</td>
			<td >ApexBio</td>
			<td >B1051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >hamilton 10&#956;l syringe </td>
			<td >Hamilton Sigma-Aldrich</td>
			<td >28615-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >14025-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ketamine</td>
			<td>Ketaset</td>
			<td>NDC 0856-2013-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Large blunt/blunt curved scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14519-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >LDN193189</td>
			<td >Cayman Chemicals</td>
			<td >11802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >lodixanol</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >1343517</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >magnesium chloride (MgCl2)</td>
			<td >Fisher Chemical</td>
			<td >M35-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Methylcelulose</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >M0262-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >mounting medium with DAPI </td>
			<td >Vectashield</td>
			<td >H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Needle tip, 26 GA x 1.25&#34;</td>
			<td >PrecisionGlide</td>
			<td >305111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ophthalmic ointment </td>
			<td >Refresh Lacri-Lube</td>
			<td >93468</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >optimal cutting temperature (O.C.T.) </td>
			<td >ThermoFisher</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PCR mix</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep)</td>
			<td >Corning</td>
			<td >30-002-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Phosphate buffered saline pH 7.4 (PBS)</td>
			<td >Corning Cellgro</td>
			<td >46-103-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Potassium chloride (KCl)</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >P330-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >scalpel blades</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Shallow glass or plastic tray</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >skin glue/tissue adhesive</td>
			<td >3M Vetbond</td>
			<td >1469SB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >sodium azide</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >CAS 26628-22-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td >Fisher Chemical</td>
			<td >S642-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >standard hemostat forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>13013-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Standard tweezers</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11027-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Straight iris scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14058-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >sucrose</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >BP220-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tris-base</td>
			<td >Fisher Bioreagents</td>
			<td >BP152-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Triton X-100</td>
			<td >Fisher Bioreagents</td>
			<td >BP151-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypsin-EDTA </td>
			<td >Gibco</td>
			<td >15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Xylazine</td>
			<td >Akorn</td>
			<td>NDC: 59399-111-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EQUIPMENT</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Zeiss AxioObserver Live-Cell microscope </td>
			<td >Zeiss</td>
			<td >Zeiss AxioObserver</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.45mm burr</td>
			<td >IDEAL MicroDrill</td>
			<td >67-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >BD FACScalibur</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >centrifuge</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >glass homogenizer</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >cell culture incubator</td>
			<td >Thermo Scientific HERACELL VIOS 160i</td>
			<td >13-998-213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Leica 3050S research cryostat </td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >stereotactic platform </td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >thermocycler</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Timer</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ultracentrifuge</td>
			<td >Beckman Coulter Optima L-100 XP</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Water bath (37 &#186;C)</td>
			<td >Fisher Scientific Isotemp 2239</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a non-random mouse model for pharmacological reactivation of mecp2 on the inactive x chromosome

X गुणसूत्र निष्क्रियण (xci) लिंगों के बीच जीन खुराक संतुलन को प्राप्त करने के लिए महिलाओं में एक एक्स गुणसूत्र के यादृच्छिक मुंह बंद है । नतीजतन, सभी महिलाओं एक्स से जुड़े जीन अभिव्यक्ति के लिए विषमयुग्मज हैं । XCI के प्रमुख नियामकों में से एक Xciहै, जो दीक्षा और xci के रखरखाव के लिए आवश्यक है । पिछले अध्ययनों से 13 ट्रांस अभिनय एक्स गुणसूत्र inactivation कारक (XCIFs) एक बड़े पैमाने पर, समारोह आनुवंशिक स्क्रीन के नुकसान का उपयोग कर की पहचान की है । इस तरह के ACVR1 और PDPK1 के रूप में XCIFs, का निषेध, छोटी हेयरपिन आरएनए या छोटे अणु inhibition का उपयोग, सुसंस्कृत कोशिकाओं में एक्स गुणसूत्र से जुड़े जीन को सक्रिय करता है । लेकिन विवो में निष्क्रिय एक्स क्रोमोसोम को फिर से सक्रिय करने की व्यवहार्यता और सहनशीलता का निर्धारण किया जाना बाकी है । इस लक्ष्य की ओर, एक xistδ: Mecp2/xist: Mecp2-Gfp माउस मॉडल एक एक्स गुणसूत्र पर xist के विलोपन के कारण गैर यादृच्छिक xist के साथ उत्पंन किया गया है । इस मॉडल का उपयोग करना, निष्क्रिय एक्स रिनोवेशन की हद तक xcif inhibitors के साथ उपचार के बाद माउस मस्तिष्क में quantitated था । हाल ही में प्रकाशित परिणाम दिखाने के लिए, पहली बार के लिए, कि xcifs के औषधीय निषेध Mecp2 जीवित माउस मस्तिष्क के वल्कुट ंयूरॉंस में निष्क्रिय एक्स गुणसूत्र से पुनः सक्रिय ।

Xistδ की व्यवहार्यता का प्रदर्शन करने के लिए : Mecp2/Xist: Mecp2-gfp माउस मॉडल ग्यारहवीं पुनः सक्रियण अध्ययन के लिए, XCIF अवरोध करनेवाला-ग्यारहवीं से जुड़े Mecp2 के mediated पुनः सक्रियण -gfp माउस भ्रूणीय फाइब्रो...

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A Non-random Mouse Model for Pharmacological Reactivation of Mecp2 on the Inactive X Chromosome

यहां, हम एक प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए गैर यादृच्छिक एक्स गुणसूत्र inactivation के साथ एक व्यवहार्य महिला murine मॉडल उत्पंन, अर्थात्, मातृत्व-वंशानुगत एक्स गुणसूत्र कोशिकाओं के १००% में निष्क्रिय है । हम भी एक प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए व्यवहार्यता परीक्षण, सहनशीलता, और vivo में निष्क्रिय एक्स गुणसूत्र के औषधीय पुनः सक्रियण की सुरक्षा ।

निष्क्रिय एक्स गुणसूत्र पर Mecp2 के औषधीय पुनः सक्रियण के लिए एक गैर यादृच्छिक माउस मॉडल

X chromosome inactivation (XCI) is the random silencing of one X chromosome in females to achieve gene dosage balance between the sexes. As a result, all ...

इस प्रोटोकॉल का उपयोग एक जीवित माउस के मस्तिष्क में निष्क्रिय एक्स-लिंक्ड Mecp2 गुणसूत्र के पुनर्सक्रियण के परीक्षण और मात्रा के लिए एक गैर-यादृच्छिक माउस मॉडल उत्पन्न करने के लिए किया जा सकता है। इस मॉडल को आसानी से DDX3X सिंड्रोम जैसे अन्य एक्स-लिंक्ड डिजीज मॉडल्स में शी रिएक्टिवेशन का अध्ययन करने के लिए संशोधित किया जा सकता है । मैं संचिता भटनागर की प्रयोगशाला में एक पोस्ट डॉक्टर हूं और मैं जेमिंग झेंग के साथ प्रक्रिया का प्रदर्शन करूंगा ।थूथन निरोधक के काटने के बार में कांटे की शकल के साथ एक स्टीरियोटैक्टिक प्लेटफॉर्म में एनेस्थेटाइज्ड माउस को पोजिशनिंग करके शुरू करें। माउस के सिर को लेवल प्लेन पर रखते हुए नाक का क्लैंप कस लें। सिर को स्थिर रखने के लिए कान नहर के कौडल भाग तक पहुंचने के लिए कान की सलाखों की ऊंचाई को समायोजित करें।फिर एक सामयिक एंटीसेप्टिक और 70% इथेनॉल के बारी-बारी से पोंछे के साथ सिर को कीटाणुरहित करें। जब माउस तैयार हो जाता है, तो मध्य खोपड़ी में 0.75 सेंटीमीटर क्षैतिज चीरा बनाने के लिए बाँझ स्केलपेल का उपयोग करें। दाएं और बाएं कॉर्टिकल गोलार्द्धों के ऊपर दो सममित छेद ड्रिल करने के लिए 0.45 मिलीमीटर बर्र का उपयोग करें, जो सगितल सीवन से दो मिलीमीटर और पार्श्व हड्डी के अनुमानित मध्य में लैम्ब्डॉइड सीवन है।मजबूती से स्टीरियोटैक्टिक प्लेटफॉर्म पर 10 माइक्रोलीटर सिरिंज संलग्न करें और सिरिंज में ताजा तैयार रासायनिक अवरोधक के 10 माइक्रोलीटर लोड करें। खोपड़ी के लिए लंबवत सुई रखते हुए पहले burr छेद में सुई अग्रिम। जब सुई खोपड़ी को पार करती है, तो स्टीरियोटैक्टिक डिजिटल डिस्प्ले पर निर्देशांक को शून्य करें और सुई की नोक को तब तक आगे बढ़ाएं जब तक कि यह 2.5 मिलीमीटर की गहराई तक न पहुंच जाए।सुई 0.5 मिलीमीटर को दो मिलीमीटर की गहराई तक वापस लें और धीरे-धीरे एक मिनट की अवधि में समाधान की पूरी 10 माइक्रोलीटर मात्रा इंजेक्ट करें। अवरोधक के सभी दिया गया है के बाद, सुई वापस लेने से पहले एक और मिनट के लिए मस्तिष्क में सुई छोड़ दें । इंजेक्शन को केवल एक नियंत्रण के रूप में वाहन का उपयोग करके दूसरे बर्र छेद में दोहराएं और चीरा पर त्वचा को बंद करें।फिर पूर्ण वसूली तक निगरानी के साथ स्टीरियोटाटिक उपकरण से माउस को 37 डिग्री सेल्सियस हीटिंग पैड पर स्थानांतरित करें। खुराक आहार के अंत में, एक विच्छेदन पैड पर माउस को सुरक्षित करें। रिबकेज के ठीक नीचे इंटीमेसी और पेट की दीवार के माध्यम से पार्श्व चीरा लगाने के लिए कैंची और संदंश का प्रयोग करें।ध्यान से डायाफ्राम से जिगर को अलग करें और प्ल्युरल गुहा को बेनकाब करने के लिए रिबकेज की पूरी लंबाई के साथ डायाफ्राम के माध्यम से काटें। बाएं वेंट्रिकल के पीछे के छोर पर चीरा लगाने के लिए कैंची का उपयोग करें और तुरंत दो मिनट की अवधि में पीबीएस के लगभग 15 मिलीलीटर के साथ दाहिने दिल के चैंबर को इंजेक्ट करें। एक सफल पर्फ्यूजन के परिणामस्वरूप लाल से पीला गुलाबी रंग में जिगर का रंग बदल जाएगा।जब सभी पीबीएस वितरित किए गए हैं, तो दो मिनट से अधिक पीबीएस में 4% पैराफॉर्मल्डिहाइड के लगभग 10 मिलीलीटर के साथ दिल को छिद्रित करें। सिर की कटाई के बाद, खोपड़ी को बेनकाब करने के लिए खोपड़ी में मिडलाइन चीरा बनाने के लिए कैंची का उपयोग करें। आंख की ओर खोपड़ी में एक पार्श्व चीरा के निर्माण की सुविधा के लिए foramen मैग्नम में कैंची की एक टिप रखें।खोपड़ी के दूसरी तरफ एक समान चीरा बनाएं कैंची के अंत को यथासंभव सतही रूप से रखें और खोपड़ी के क्षेत्र को आंखों के बीच और माउस की नाक के ऊपर काट दें। मस्तिष्क गोलार्द्धों से कपाल हड्डियों को धीरे से छीलने के लिए संदंश का उपयोग करें और मस्तिष्क को ऊंचा करने के लिए एक स्पैटुला का उपयोग करें। कपाल तंत्रिका फाइबर को सावधानी से विच्छेदन करें जो मस्तिष्क को खोपड़ी में ठीक करते हैं और मस्तिष्क को प्लास्टिक के पकवान में रखते हैं।इसके बाद सेरिबैलम और घ्राण बल्ब को एक्साइज करें। मस्तिष्क के ऊतकों के वर्गों को प्राप्त करने के लिए, पहले एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में मस्तिष्क को ठीक करें जो पीबीएस में 4% पैराफॉर्मल्डिहाइड से भरी हुई चार डिग्री सेल्सियस पर रात भर। अगली सुबह, मस्तिष्क के ऊतकों को प्रति वॉश ताजा पीबीएस में चार डिग्री सेल्सियस पर पांच मिनट के लिए कम से तीन बार कुल्ला ।अंतिम धोने के बाद, प्रत्येक गोलार्द्ध के सामने कैंची और संदंश के साथ हटा दें और नमूनों को लेबल वाले क्रायो-मोल्ड्स फ्रंट साइड में नीचे रखें। प्रत्येक ऊतक को इष्टतम काटने के तापमान माध्यम में डूबने से पहले स्नैप फ्रीजिंग तरल नाइट्रोजन में नमूनों को शून्य से ८० डिग्री सेल्सियस भंडारण के लिए 10 मिलीमीटर प्लास्टिक पेट्री डिश में । ग्यारहवीं पुनः सक्रियण निर्धारित करने के लिए, एक १०० डिग्री सेल्सियस हीट ब्लॉक पर पांच मिनट के लिए एंटीजन पुनः प्राप्ति समाधान में पांच से छह माइक्रोमीटर मस्तिष्क ऊतक वर्गों विसर्जित कर दिया ।इनक्यूबेशन के अंत में, ब्लॉकिंग समाधान में स्लाइड विसर्जित करने से पहले प्रति वॉश ताजा पीबीएस के साथ कमरे के तापमान पर चार पांच मिनट की धोती के साथ स्लाइड धोएं। कमरे के तापमान पर 20 मिनट के बाद, स्लाइड ्स को पांच मिनट के लिए तीन बार ताजा वॉश बफर प्रति वॉश में धोएं । रात भर चार डिग्री सेल्सियस पर उपयुक्त प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ ऊतक के नमूनों को दाग दें।छवि एक फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप पर स्लाइड इसके विपरीत और चमक को समायोजित करने के लिए दोनों दवा और वाहन इलाज माउस मस्तिष्क गोलार्द्धों के लिए GFP सकारात्मक कोशिकाओं की संख्या की मात्रा की अनुमति । निष्क्रिय एक्स गुणसूत्र पुनर्सक्रियण अध्ययनों के लिए गैर-यादृच्छिक एक्स गुणसूत्र निष्क्रियता माउस मॉडल की व्यवहार्यता को प्रदर्शित करने के लिए, जेनोटीपिंग पीसीआर और फ्लो साइटोमेट्री द्वारा महिला ट्रांसजेनिक माउस भ्रूणीय फाइब्रोब्लास्ट के जीनोटाइप की पुष्टि की गई थी। जैसा कि पीसीआर द्वारा मूल्यांकन किया गया है, जीएफपी टैग मेथिलीन सीपीजी बाइंडिंग प्रोटीन दो जीन या एमईसीपी 2 की अभिव्यक्ति को दवा द्वारा फिर से सक्रिय किया गया था लेकिन वाहन उपचार नहीं ।गैर-यादृच्छिक एक्स गुणसूत्र निष्क्रियता माउस मॉडल भ्रूणीय फाइब्रोब्लास्ट्स ने भी दवा के बाद परमाणु जीएफपी व्यक्त किया लेकिन एक्स गुणसूत्र निष्क्रियता कारक अवरोधकों का प्रदर्शन करने वाले वाहन उपचार माउस भ्रूणीय फाइब्रोब्लास्ट में निष्क्रिय एक्स गुणसूत्र लिंक्ड MECP2 को फिर से सक्रिय करते हैं। दवा उपचार निष्क्रिय एक्स गुणसूत्र MECP2-GFP दवा संचार मस्तिष्क गोलार्द्धों में कोशिकाओं के बारे में 30% में फिर से सक्रिय जबकि वाहन संचार गोलार्द्धों में कोई पुनः सक्रियता का पता चला है । माइक्रोट्यूबुल से जुड़े प्रोटीन दो सकारात्मक न्यूरॉन्स भी निष्क्रिय एक्स गुणसूत्र MECP2-GFP अभिव्यक्ति का संकेत दवा इलाज गोलार्द्धों में GFP सकारात्मक हैं ।दवा आहार लक्ष्य और छोटे अणु अवरोधकों की प्रभावकारिता पर निर्भर होगा तो वीवो में परीक्षण से पहले विट्रो में खुराक और उपचार का अनुकूलन । गैर-यादृच्छिक माउस मॉडल का उपयोग व्यक्तिगत रूप से या संयोजन में विभिन्न दवाओं का परीक्षण करने के लिए किया जा सकता है। वास्तव में, हमने और अन्य लोगों ने कई नशा करने योग्य एक्स गुणसूत्र निष्क्रियता कारकों की पहचान की है।

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SCIENTISTS IN ACTION

Conjugative Mating Assays for Sequence-specific Analysis of Transfer Proteins Involved in Bacterial Conjugation

बैक्टीरियल संयुग्मन में शामिल स्थानांतरण प्रोटीन के अनुक्रम विशिष्ट विश्लेषण के लिए संयुग्मी संभोग Assays

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia ...

Pooled shRNA Screen for Reactivation of MeCP2 on the Inactive X Chromosome

निष्क्रिय एक्स गुणसूत्र पर MeCP2 के पुनः सक्रिय करने के लिए परित shRNA स्क्रीन

Forward genetic screens using reporter genes inserted into the heterochromatin have been extensively used to investigate mechanisms of epigenetic control ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

परिपत्र गुणसूत्र अनुरूप कब्जा की अगली पीढ़ी के अनुक्रमण का उपयोग जीन विनियामक अनुक्रम का उच्च प्रवाह पहचान (4c-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

बैक्टीरिया पर चयन और विकास के आधार पर Dictyostelium discoideum कोशिकाओं की जेनेटिक इंजीनियरिंग

Dictyostelium discoideum is an intriguing model organism for the study of cell differentiation processes during development, cell signaling, and other ...

Mass Spectrometry-Based Proteomics Analyses Using the OpenProt Database to Unveil Novel Proteins Translated from Non-Canonical Open Reading Frames

मास स्पेक्ट्रोमेट्री-आधारित Proteomics विश्लेषण OpenProt डेटाबेस का उपयोग कर उपन्यास प्रोटीन गैर-विहित ओपन रीडिंग फ्रेम्स से अनुवादित

Genome annotation is central to today's proteomic research as it draws the outlines of the proteomic landscape. Traditional models of open reading frame ...

A Robust Polymerase Chain Reaction-based Assay for Quantifying Cytosine-guanine-guanine Trinucleotide Repeats in Fragile X Mental Retardation-1 Gene

एक मजबूत पॉलिमरेज चेन रिएक्शन-आधारित परख के लिए क्वांटाइज़िंग साइटोसाइन-गुआनीन-गुआनीन ट्राइन्यूक्लिओटाइड नाजुक एक्स मानसिक सुधार-1 जीन में दोहराता है

Fragile X syndrome (FXS) and associated disorders are caused by expansion of the cytosine-guanine-guanine (CGG) trinucleotide repeat in the 5&#8217; ...

A Screening Method for Identification of Heterochromatin-Promoting Drugs Using Drosophila

A Screening Method for Identification of Heterochromatin-Promoting Drugs Using Drosophila

ड्रोसोफिला का उपयोग करके हेट्रोक्रोमेंटिन-को बढ़ावा देने वाली दवाओं की पहचान के लिए एक स्क्रीनिंग विधि

Drosophila is an excellent model organism that can be used to screen compounds that might be useful for cancer therapy. The method described here is a ...

Identification of Enhancer-Promoter Contacts in Embryoid Bodies by Quantitative Chromosome Conformation Capture (4C)

Identification of Enhancer-Promoter Contacts in Embryoid Bodies by Quantitative Chromosome Conformation Capture 4C

मात्रात्मक गुणसूत्र संरचना कैप्चर (4C) द्वारा भ्रूण निकायों में एन्हांस्ड-प्रमोटर संपर्कों की पहचान

During mammalian development, cell fates are determined through the establishment of regulatory networks that define the specificity, timing, and spatial ...

Application of DNA Fingerprinting using the D1S80 Locus in Lab Classes

Application of DNA Fingerprinting using the D1S80 Locus in Lab Classes

लैब कक्षाओं में D1S80 लोकस का उपयोग कर डीएनए फिंगरप्रिंटिंग का आवेदन

In biological sciences, DNA fingerprinting has been widely used for paternity testing, forensic applications and phylogenetic studies. Here, we describe a ...

Investigating the Pathogenesis of MYH7 Mutation Gly823Glu in Familial Hypertrophic Cardiomyopathy using a Mouse Model

माउस मॉडल का उपयोग करके पारिवारिक हाइपरट्रॉफिक कार्डियोमायोपैथी में MYH7 उत्परिवर्तन Gly823Glu के रोगजनन की जांच करना

Familial hypertrophic cardiomyopathy (HCM, OMIM: 613690) is the most common cardiomyopathy in China. However, the underlying genetic etiology of HCM ...