Name: a non-random mouse model for pharmacological reactivation of mecp2 on the inactive x chromosome
Uploaded: 2019-05-22T14:00:00
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Gli autori ringraziano Antonio Bedalov per aver fornito reagenti; Università di Virginia tessuto istologia nucleo per criosettioning; Università di Virginia flusso citometria nucleo per analisi di citometria a flusso; Christian Blue e saloni Singh per l'assistenza tecnica con la genotipo. Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione di ricerca Double Hoo a Z.Z., e da un premio del programma di progetto pilota dell'Università di Virginia-Virginia Tech Seed Fund Award e dal premio individuale di ricerca biomedica di Hartwell Foundation a ente

Il lavoro che coinvolge i topi è stato approvato dal Comitato per la cura e l'uso degli animali dell'Università della Virginia (IACUC; #4112).
1. generare un modello di mouse XCI non casuale con MECP2 geneticamente etichettato su Xi
Nota: Ceppi di topo utilizzati nello studio sono stati i seguenti: MECP2-GFP/MECP2-GFP (MECP2TM 3.1 uccello, tabella dei materiali) e XIST/δxist (B6; 1...

<ol>
	<li>Lyon, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-chromosome+inactivation+as+a+system+of+gene+dosage+compensation+to+regulate+gene+expression.">X-chromosome inactivation as a system of gene dosage compensation to regulate gene expression.</a> Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology. 36, 119-130 (1989).</li><li>Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delving+into+the+diversity+of+facultative+heterochromatin:+the+epigenetics+of+the+inactive+X+chromosome.">Delving into the diversity of facultative heterochromatin: the epigenetics of the inactive X chromosome.</a> Current Opinion in Genetics Development. 15 (5), 482-489 (2005).</li><li>Augui, S., Nora, E. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Xist+lncRNA+interacts+directly+with+SHARP+to+silence+transcription+through+HDAC3.">The Xist lncRNA interacts directly with SHARP to silence transcription through HDAC3.</a> Nature. 521 (7551), 232-236 (2015).</li><li>Minajigi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomes.+A+comprehensive+Xist+interactome+reveals+cohesin+repulsion+and+an+RNA-directed+chromosome+conformation.">Chromosomes. A comprehensive Xist interactome reveals cohesin repulsion and an RNA-directed chromosome conformation.</a> Science. 349 (6245), (2015).</li><li>Mira-Bontenbal, H., Gribnau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Xist-Interacting+Proteins+in+X-Chromosome+Inactivation.">New Xist-Interacting Proteins in X-Chromosome Inactivation.</a> Current Biology. 26 (8), R338-R342 (2016).</li><li>Mira-Bontenbal, H., Gribnau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Xist-Interacting+Proteins+in+X-Chromosome+Inactivation.">New Xist-Interacting Proteins in X-Chromosome Inactivation.</a> Curren Biology. 26 (10), 1383 (2016).</li><li>Ridings-Figueroa, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nuclear+matrix+protein+CIZ1+facilitates+localization+of+Xist+RNA+to+the+inactive+X-chromosome+territory.">The nuclear matrix protein CIZ1 facilitates localization of Xist RNA to the inactive X-chromosome territory.</a> Genes and Development. 31 (9), 876-888 (2017).</li><li>Sunwoo, H., Colognori, D., Froberg, J. 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E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rett+syndrome+is+caused+by+mutations+in+X-linked+MECP2,+encoding+methyl-CpG-binding+protein+2.">Rett syndrome is caused by mutations in X-linked MECP2, encoding methyl-CpG-binding protein 2.</a> Nature Genetics. 23 (2), 185-188 (1999).</li><li>Przanowski, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+reactivation+of+inactive+X-linked+Mecp2+in+cerebral+cortical+neurons+of+living+mice.">Pharmacological reactivation of inactive X-linked Mecp2 in cerebral cortical neurons of living mice.</a> Proceedings of Natlional Academy of Sciences of the United States of America. 115 (31), 7991-7996 (2018).</li><li>Borensztein, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xist-dependent+imprinted+X+inactivation+and+the+early+developmental+consequences+of+its+failure.">Xist-dependent imprinted X inactivation and the early developmental consequences of its failure.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 24 (3), 226-233 (2017).</li><li>Jensen, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+histological+staining+and+fluorescence+using+ImageJ.">Quantitative analysis of histological staining and fluorescence using ImageJ.</a> Anatomical Record (Hoboken). 296 (3), 378-381 (2013).</li><li>Cseke, L. J., Talley, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+PCR-based+genotyping+method+to+distinguish+between+wild-type+and+ornamental+varieties+of+Imperata+cylindrica.">A PCR-based genotyping method to distinguish between wild-type and ornamental varieties of Imperata cylindrica.</a> Journal of Visualized Experiments. (60), (2012).</li></ol>

In precedenza, gli Xcif che sono selettivamente necessari per il silenziamento dei geni collegati a Xi nelle cellule femminili di mammiferi sono stati identificati12. Abbiamo ulteriormente ottimizzato potenti inibitori di piccole molecole per indirizzare gli Xcif, come ACVR1 e gli effettori a valle di PDPK1, che riattivano in modo efficiente i MECP2 collegati a Xi nelle linee cellulari di fibroblasti del topo, i neuroni corticali del topo e una cellula fibroblastica umana una linea deriva...

L'inattivazione cromosoma x (XCI) è un processo di compensazione del dosaggio che bilancia l'espressione genica legata all'X silenziando una copia del cromosoma X nelle femmine1. Di conseguenza, il cromosoma X inattivo (XI) accumula le caratteristiche tipiche dell'eterocromatina, inclusa la metilazione del DNA e le modifiche dell'istone inibitorio, come l'istone H3-lisina 27 trimetilazione (H3K27me3) e l'istone H2A ubiquitinazione (H2Aub) 2. il regolatore principale del silenziamento cromosomico x è la regione del centro di inattivazione x (XIC), intorno a 100 − 500 KB, che controlla il conteggio e l'accoppiamento dei cromosomi x, la scelta casuale del cromosoma x per l'inattivazione, e l'inizio e la diffusione del silenziamento lungo il cromosoma X3. Il processo di inattivazione X è iniziato dalla trascrizione specifica X inattiva (XIST) che ricopre il XI in CIS per mediare il silenziamento a livello cromosoma e rimodellare la struttura tridimensionale del cromosoma x4. Recentemente, diversi schermi proteomici e genetici hanno identificato ulteriori regolatori di XCI, come le proteine interagenti XIST 5,6,7,8,9 , 10 il , 11 il , 12. ad esempio, uno studio precedente che utilizza uno schermo di interferenza dell'RNA a livello di genoma imparziale ha identificato 13 fattori XCI transagionanti (xcif)12. Meccanisticamente, XCIFs regolano l'espressione XIST e quindi, interferendo con la funzione xcifs provoca XCI12difettoso. Insieme, i recenti progressi nel campo hanno fornito importanti approfondimenti sui macchinari molecolari che sono necessari per avviare e mantenere XCI.
L'identificazione dei regolatori XCI e la comprensione del loro meccanismo in XCI è direttamente rilevante per le malattie dell'uomo legate all'X, come la sindrome di Rett (RTT)13,14. La RTT è un raro disturbo dello sviluppo neurologico causato da una mutazione eterozigote nella proteina 2 (MECP2) legata al metil-CPG X-linked che colpisce prevalentemente le ragazze15. Poiché MECP2 si trova sul cromosoma X, le ragazze RTT sono eterozigoti per deficit di MECP2 con ~ 50% cellule che esprimono Wild-Type e ~ 50% esprimendo MECP2mutante. In particolare, le cellule mutanti RTT porto una copia dormiente ma Wild-Type di MECP2 sul XI, fornendo una fonte del gene funzionale, che se riattivato, potrebbe potenzialmente alleviare i sintomi della malattia. Oltre alla RTT, ci sono diverse altre malattie umane legate alla X, per le quali la riattivazione di XI rappresenta un potenziale approccio terapeutico, come la sindrome DDX3X.
L'inibizione di XCIFs, 3-fosfoinositide dipendente proteina chinasi-1 (PDPK1), e activina un recettore di tipo 1 (ACVR1), sia da RNA corto (shRNA) o piccoli inibitori di molecola, riattiva geni XI-Linked12. La riattivazione farmacologica dei geni collegati a XI è osservata in vari modelli ex vivo che includono linee cellulari di fibroblasti del topo, neuroni corticali di topi adulti, fibromi embrionali del topo e linee cellulari di fibroblast derivate da un paziente RTT12. Tuttavia, se la riattivazione farmacologica dei geni collegati a XI è fattibile in vivo rimane da dimostrare. Un fattore limitante è la mancanza di modelli animali efficaci per misurare accuratamente l'espressione dei geni da riattivato XI. Verso questo obiettivo, è stato generato un modello di mouse Xistδ: MECP2/XIST: MECP2-GFP che trasporta un MECP2 geneticamente etichettato su XI in tutte le cellule a causa dell'eliminazione eterozigote in XIST sul cromosoma X materno16. Utilizzando questo modello, l'espressione di MECP2 da XI è stata quantitata dopo il trattamento con inibitori di XCIFs nel cervello dei topi viventi. Qui è descritta la generazione del modello di mouse Xistδ: MECP2/XIST: MECP2-GFP e la metodologia per quantificare la riattivazione di XI nei neuroni corticali utilizzando saggi basati su immunofluorescenza.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >MICE</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mecp2tm3.1Bird</td>
			<td >The Jackson Laboratory</td>
			<td>#014610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >B6;129-Xist (tm5Sado)</td>
			<td>provided by Antonio Bedalov, Fred Hutchinson Cancer Center, Seattle</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >REAGENTS</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >22x22 mm coverslip</td>
			<td >FISHERfinest (Fisher Scientific)</td>
			<td >125488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >32% Paraformaldehyde</td>
			<td >Electron Microscopy Sciences</td>
			<td >15714-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >50 ml syringe</td>
			<td>Medline Industries</td>
			<td>NPMJD50LZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >60mm culture dish</td>
			<td >CellStar</td>
			<td >628160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >7-AAD </td>
			<td >BioLegend</td>
			<td >420403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ammonium chloride (NH4Cl)</td>
			<td >Fisher Chemical</td>
			<td >A661-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >anti-GFP-AlexaFluor647</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td >A-31852</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >anti-MAP2</td>
			<td >Aves Labs</td>
			<td >MAP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >BSA</td>
			<td >Promega</td>
			<td >R396D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Buprenorphine SR</td>
			<td >Zoopharm</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >citric acid </td>
			<td >Sigma</td>
			<td >C-1857</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DMSO</td>
			<td >Fisher Bioreagents</td>
			<td >BP231-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td >Corning Cellgro</td>
			<td >10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethanol</td>
			<td >Decon Labs</td>
			<td >2701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td >VWR Life Science</td>
			<td>89510-198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >gelatin</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >G9391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >glass slides</td>
			<td >Fisherbrand</td>
			<td >22-034-486</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >goat anti-chicken FITC-labeled secondary antibody </td>
			<td >Aves Labs</td>
			<td >F-1005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >GSK650394</td>
			<td >ApexBio</td>
			<td >B1051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >hamilton 10&#956;l syringe </td>
			<td >Hamilton Sigma-Aldrich</td>
			<td >28615-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >14025-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ketamine</td>
			<td>Ketaset</td>
			<td>NDC 0856-2013-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Large blunt/blunt curved scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14519-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >LDN193189</td>
			<td >Cayman Chemicals</td>
			<td >11802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >lodixanol</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >1343517</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >magnesium chloride (MgCl2)</td>
			<td >Fisher Chemical</td>
			<td >M35-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Methylcelulose</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >M0262-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >mounting medium with DAPI </td>
			<td >Vectashield</td>
			<td >H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Needle tip, 26 GA x 1.25&#34;</td>
			<td >PrecisionGlide</td>
			<td >305111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ophthalmic ointment </td>
			<td >Refresh Lacri-Lube</td>
			<td >93468</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >optimal cutting temperature (O.C.T.) </td>
			<td >ThermoFisher</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PCR mix</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep)</td>
			<td >Corning</td>
			<td >30-002-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Phosphate buffered saline pH 7.4 (PBS)</td>
			<td >Corning Cellgro</td>
			<td >46-103-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Potassium chloride (KCl)</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >P330-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >scalpel blades</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Shallow glass or plastic tray</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >skin glue/tissue adhesive</td>
			<td >3M Vetbond</td>
			<td >1469SB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >sodium azide</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >CAS 26628-22-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td >Fisher Chemical</td>
			<td >S642-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >standard hemostat forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>13013-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Standard tweezers</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11027-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Straight iris scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14058-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >sucrose</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >BP220-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tris-base</td>
			<td >Fisher Bioreagents</td>
			<td >BP152-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Triton X-100</td>
			<td >Fisher Bioreagents</td>
			<td >BP151-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypsin-EDTA </td>
			<td >Gibco</td>
			<td >15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Xylazine</td>
			<td >Akorn</td>
			<td>NDC: 59399-111-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EQUIPMENT</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Zeiss AxioObserver Live-Cell microscope </td>
			<td >Zeiss</td>
			<td >Zeiss AxioObserver</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.45mm burr</td>
			<td >IDEAL MicroDrill</td>
			<td >67-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >BD FACScalibur</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >centrifuge</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >glass homogenizer</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >cell culture incubator</td>
			<td >Thermo Scientific HERACELL VIOS 160i</td>
			<td >13-998-213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Leica 3050S research cryostat </td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >stereotactic platform </td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >thermocycler</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Timer</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ultracentrifuge</td>
			<td >Beckman Coulter Optima L-100 XP</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Water bath (37 &#186;C)</td>
			<td >Fisher Scientific Isotemp 2239</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a non-random mouse model for pharmacological reactivation of mecp2 on the inactive x chromosome

X inattivazione cromosoma (XCI) è il silenziamento casuale di un cromosoma X nelle femmine per raggiungere l'equilibrio di dosaggio genico tra i sessi. Di conseguenza, tutte le femmine sono eterozigoti per l'espressione genica legata alla X. Uno dei regolatori chiave di XCI è XIST, che è essenziale per l'avvio e la manutenzione di XCI. Studi precedenti hanno identificato 13 fattori di inattivazione del cromosoma X Trans-azione (XCIFs) utilizzando uno schermo genetico su larga scala e perdita di funzione. L'inibizione degli Xcif, come ACVR1 e PDPK1, mediante l'utilizzo di RNA a breve tornante o di piccoli inibitori delle molecole, riattiva i geni collegati al cromosoma X nelle cellule coltivate. Ma la fattibilità e la tollerabilità di riattivare il cromosoma X inattivo in vivo rimane da determinare. Verso questo obiettivo, un modello di mouse Xistδ: MECP2/XIST: MECP2-GFP è stato generato con XCI non casuali a causa della cancellazione di XIST su un cromosoma X. Utilizzando questo modello, l'estensione della riattivazione X inattiva è stata quantitata nel cervello del topo dopo il trattamento con inibitori XCIF. I risultati recentemente pubblicati mostrano, per la prima volta, che l'inibizione farmacologica di XCIFs riattiva MECP2 dal cromosoma X inattivo nei neuroni corticali del cervello del topo vivente.

Per dimostrare la fattibilità del modello di mouse Xistδ: MECP2/XIST: MECP2-GFP per gli studi di riattivazione XI, la riattivazione xcif inibitore-mediata di XI-Linked MECP2-GFP è stata testata nei fibroblasti embrionali di topo (MEFs). I MEF femminili sono stati isolati dal giorno 15,5 Xistδ: MECP2/XIST: MECP2-GFP embrioni come descritto nella sezione 3 (Figura 1a). I genotipi di Xistδ femminile: MECP2/XIST: MECP2-GFP MEFs sono st...

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A Non-random Mouse Model for Pharmacological Reactivation of Mecp2 on the Inactive X Chromosome

Qui, descriviamo un protocollo per generare un modello murino femminile vitale con inattivazione cromosomico X non casuale, cioè il cromosoma X ereditato dalla materna è inattivo nel 100% delle cellule. Descriviamo anche un protocollo per testare la fattibilità, la tollerabilità e la sicurezza della riattivazione farmacologica del cromosoma X inattivo in vivo.

Un modello di mouse non casuale per la riattivazione farmacologica di MECP2 sul cromosoma X inattivo

X chromosome inactivation (XCI) is the random silencing of one X chromosome in females to achieve gene dosage balance between the sexes. As a result, all ...

Questo protocollo può essere utilizzato per generare un modello di topo non casuale per testare e quantificare la riattivazione del cromosoma Mecp2 inattivo legato all'X nel cervello di un topo vivente. Questo modello può essere facilmente modificato per studiare la riattivazione di Xi in altri modelli di malattia legati all'X come la sindrome DDX3X. Sono un post doc nel laboratorio di Sanchita Bhatnagar e presenterò la procedura con Zeming Zheng.Inizia posizionando il mouse anestetizzato in una piattaforma stereotassiva con gli incisivi agganciati nella barra del morso del limitatore del muso. Stringere il morsetto del naso mantenendo la testa del mouse su un piano piana. Regolare l'altezza delle barre dell'orecchio per raggiungere la porzione caudale del condotto uditivo per mantenere la testa immobilizzata.Quindi disinfettare la testa con salviette alternate di un antisettico topico e 70%etanolo. Quando il mouse è pronto, utilizzare un bisturi sterile per fare un'incisione orizzontale di 0,75 centimetri nel cuoio capelluto medio. Utilizzare una bava di 0,45 millimetri per praticare due fori simmetrici sopra l'emisfero corticale destro e sinistro a due millimetri dalla sutura sagittale e la sutura lambdoide al centro approssimativo dell'osso parietale.Attaccare saldamente una siringa da 10 microlitri alla piattaforma stereotassiva e caricare 10 microlitri di inibitore chimico appena preparato nella siringa. Far avanzare l'ago nel primo foro di bava mantenendo l'ago perpendicolare al cranio. Quando l'ago attraversa il cranio, azzerare le coordinate sul display digitale stereotattico e far avanzare la punta dell'ago fino a raggiungere una profondità di 2,5 millimetri.Ritirare l'ago di 0,5 millimetri a una profondità di due millimetri e iniettare lentamente l'intero volume di 10 microlitri della soluzione per un periodo di un minuto. Dopo che tutto l'inibitore è stato consegnato, lasciare l'ago nel cervello per un altro minuto prima di ritirare l'ago. Ripetere l'iniezione nel secondo foro di bava utilizzando il veicolo solo come controllo e chiudere la pelle sull'incisione.Quindi trasferire il mouse dall'apparato stereotattico su una pastiglia riscaldante Celsius di 37 gradi con monitoraggio fino al pieno recupero. Alla fine del regime di dose, fissare il mouse su una pastiglia di sezionazione. Usa forbici e forcette per fare un'incisione laterale attraverso il tegumento e la parete addominale appena sotto la gabbia toracica.Separare accuratamente il fegato dal diaframma e tagliare il diaframma lungo l'intera lunghezza della gabbia toracica per esporre la cavità pleurica. Utilizzare le forbici per fare un'incisione all'estremità posteriore del ventricolo sinistro e iniettare immediatamente la camera cardiaca destra con circa 15 millilitri di PBS per un periodo di due minuti. Una perfusione di successo comporterà un cambiamento del colore del fegato dal rosso al rosa pallido.Una volta consegnato tutto il PBS, perfondere il cuore con circa 10 millilitri di paraformaldeide al 4% in PBS in due minuti. Dopo aver raccolto la testa, usa le forbici per fare un'incisione della linea mediana nel cuoio capelluto per esporre il cranio. Posizionare una punta delle forbici nel forame magnum per facilitare la creazione di un'incisione laterale nel cranio verso l'occhio.Fai un'incisione simile sull'altro lato del cranio mantenendo l'estremità delle forbici il più superficiale possibile e taglia la regione del cranio tra gli occhi e sopra il naso del topo. Usa le forcep per sbucciare delicatamente le ossa cranici dagli emisferi cerebrali e usa una spatola per elevare il cervello. Sezionare attentamente le fibre nervose cranici che fissano il cervello al cranio e posizionare il cervello in un piatto di plastica.Quindi asporta il cervelletto e i bulbi olfattivi. Per ottenere sezioni del tessuto cerebrale, prima fissare il cervello in un tubo da 15 millilitri riempito con paraformaldeide al 4% in PBS a quattro gradi Celsius durante la notte. La mattina seguente, sciacquare il tessuto cerebrale almeno tre volte per cinque minuti a quattro gradi Celsius in PBS fresco per lavaggio.Dopo l'ultimo lavaggio, rimuovere la parte anteriore di ogni emisfero con forbici e forcep e posizionare i campioni in crio-stampi etichettati lato anteriore verso il basso. Immergere ogni tessuto in un mezzo di temperatura di taglio ottimale prima di congelare i campioni in azoto liquido in una piastra di Petri di plastica da 10 millimetri per uno stoccaggio di meno 80 gradi Celsius. Per determinare la riattivazione di Xi, immergere da cinque a sei sezioni di tessuto cerebrale micrometrico in soluzione di recupero dell'antigene per cinque minuti su un blocco termico di 100 gradi Celsius.Al termine dell'incubazione, lavare gli scivoli con quattro lavaggi di cinque minuti a temperatura ambiente con PBS fresco per lavaggio prima di immergere gli scivoli in soluzione di blocco. Dopo 20 minuti a temperatura ambiente, lavare gli scivoli tre volte per cinque minuti in tampone di lavaggio fresco per lavaggio. Macchiare i campioni di tessuto con gli anticorpi primari appropriati a quattro gradi Celsius durante la notte.Immagini le diapositive su un microscopio a fluorescenza regolando il contrasto e la luminosità per consentire la quantificazione del numero di cellule positive GFP sia per gli emisferi cerebrali del topo trattati con farmaci che per veicoli. Per dimostrare la fattibilità del modello non casuale di topo di inattivazione cromosomico X per studi di riattivazione cromosomici X inattivi, i genotipi del fibroblasto embrionale di topo transgenico femminile sono stati confermati dalla genotipizzazione della PCR e dalla citometria del flusso. Come valutato dalla PCR, l'espressione della proteina legante GFP metilene CPG due geni o MECP2 è stata riattivata per farmaco ma non per trattamento con veicolo.I fibroblasti embrionali del modello di topo di inattivazione cromosoma X non casuale hanno anche espresso GFP nucleare dopo il farmaco, ma non il trattamento del veicolo dimostrando che gli inibitori del fattore di inattivazione cromosoma X X riattivano il CROMOSOMA X inattivato collegato MECP2 nei fibroblasti embrionali di topo. Il trattamento farmacologico riattiva il cromosoma X inattivato MECP2-GFP in circa il 30% delle cellule negli emisferi cerebrali infusi di farmaci, mentre non viene rilevata alcuna riattivazione negli emisferi infusi del veicolo. Proteina associata al microtubulo due neuroni positivi sono anche positivi alla GFP negli emisferi trattati con farmaci indicativi dell'espressione inattivata del cromosoma X MECP2-GFP.Il regime farmacologico dipenderà dal bersaglio e dall'efficacia degli inibitori delle piccole molecole, quindi ottimizza la dose e il trattamento in vitro prima di testare in vivo. Il modello di mouse non casuale può essere utilizzato per testare diversi farmaci singolarmente o in combinazione. In effetti, noi e altri abbiamo identificato diversi fattori di inattivazione cromosomici X farmacogabili.

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