Name: a non-random mouse model for pharmacological reactivation of mecp2 on the inactive x chromosome
Uploaded: 2019-05-22T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Non-random Mouse Model for Pharmacological Reactivation of Mecp2 on the Inactive X Chromosome at JoVE.com

저자는 시 약을 제공 하기 위한 안토니오 Bedalov 감사 합니다; 냉동 절편에 대 한 버지니아 조직 조직학 코어 대학; 유 세포 분석을 위한 버지니아 대학교 유 세포 분석기 코어; 크리스천 블루와 샐로 니 싱은 유전형 분석에 대 한 기술 지원을 제공 합니다. 이 작품은 Z.Z.에 더블 후 연구 보조금에 의해 지원 되었다, 및 S.B.에 대학 버지니아 테크 종자 펀드 상 및 Hartwell 재단 개별 생물 의학 연구 상에서 파일럿 프로젝트 프로그램 상 수상

마우스와 관련 된 작업 버지니아 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인 되었다 (IACUC; #4112).
1. Mecp2 에 유전으로 표시 된 비 랜덤 Xci 마우스 모델 생성
참고: 연구에 사용 되는 마우스 균 주는 다음과 같이 하였다: Mecp2-gfp/Mecp2-gfp (Mecp2 tm는 새, 물자의 테이블) 및 xist/δ xist (B6 > <;를 제공 합니다. 안토니오 베다로 브, 프레드 허 친 ?...

<ol>
	<li>Lyon, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-chromosome+inactivation+as+a+system+of+gene+dosage+compensation+to+regulate+gene+expression.">X-chromosome inactivation as a system of gene dosage compensation to regulate gene expression.</a> Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology. 36, 119-130 (1989).</li><li>Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delving+into+the+diversity+of+facultative+heterochromatin:+the+epigenetics+of+the+inactive+X+chromosome.">Delving into the diversity of facultative heterochromatin: the epigenetics of the inactive X chromosome.</a> Current Opinion in Genetics Development. 15 (5), 482-489 (2005).</li><li>Augui, S., Nora, E. P., Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+X-chromosome+inactivation+by+the+X-inactivation+centre.">Regulation of X-chromosome inactivation by the X-inactivation centre.</a> Nature Review Genetics. 12 (6), 429-442 (2011).</li><li>Pontier, D. 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A comprehensive Xist interactome reveals cohesin repulsion and an RNA-directed chromosome conformation.</a> Science. 349 (6245), (2015).</li><li>Mira-Bontenbal, H., Gribnau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Xist-Interacting+Proteins+in+X-Chromosome+Inactivation.">New Xist-Interacting Proteins in X-Chromosome Inactivation.</a> Current Biology. 26 (8), R338-R342 (2016).</li><li>Mira-Bontenbal, H., Gribnau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Xist-Interacting+Proteins+in+X-Chromosome+Inactivation.">New Xist-Interacting Proteins in X-Chromosome Inactivation.</a> Curren Biology. 26 (10), 1383 (2016).</li><li>Ridings-Figueroa, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nuclear+matrix+protein+CIZ1+facilitates+localization+of+Xist+RNA+to+the+inactive+X-chromosome+territory.">The nuclear matrix protein CIZ1 facilitates localization of Xist RNA to the inactive X-chromosome territory.</a> Genes and Development. 31 (9), 876-888 (2017).</li><li>Sunwoo, H., Colognori, D., Froberg, J. 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J., Fill, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+X+chromosome+inactivation+in+the+Rett+syndrome.">Patterns of X chromosome inactivation in the Rett syndrome.</a> Brain Development. 12 (1), 131-135 (1990).</li><li>Anvret, M., Wahlstrom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rett+syndrome:+random+X+chromosome+inactivation.">Rett syndrome: random X chromosome inactivation.</a> Clinical Genetics. 45 (5), 274-275 (1994).</li><li>Amir, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rett+syndrome+is+caused+by+mutations+in+X-linked+MECP2,+encoding+methyl-CpG-binding+protein+2.">Rett syndrome is caused by mutations in X-linked MECP2, encoding methyl-CpG-binding protein 2.</a> Nature Genetics. 23 (2), 185-188 (1999).</li><li>Przanowski, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+reactivation+of+inactive+X-linked+Mecp2+in+cerebral+cortical+neurons+of+living+mice.">Pharmacological reactivation of inactive X-linked Mecp2 in cerebral cortical neurons of living mice.</a> Proceedings of Natlional Academy of Sciences of the United States of America. 115 (31), 7991-7996 (2018).</li><li>Borensztein, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xist-dependent+imprinted+X+inactivation+and+the+early+developmental+consequences+of+its+failure.">Xist-dependent imprinted X inactivation and the early developmental consequences of its failure.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 24 (3), 226-233 (2017).</li><li>Jensen, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+histological+staining+and+fluorescence+using+ImageJ.">Quantitative analysis of histological staining and fluorescence using ImageJ.</a> Anatomical Record (Hoboken). 296 (3), 378-381 (2013).</li><li>Cseke, L. J., Talley, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+PCR-based+genotyping+method+to+distinguish+between+wild-type+and+ornamental+varieties+of+Imperata+cylindrica.">A PCR-based genotyping method to distinguish between wild-type and ornamental varieties of Imperata cylindrica.</a> Journal of Visualized Experiments. (60), (2012).</li></ol>

이전에, 포유동물 여성 세포에서 Xi-연결 된 유전자의 침묵을 위해 선택적으로 요구 되는 XCIFs는12를 동정 하였다. 우리는 마우스 섬유 아 세포 주, 마우스 대뇌 피 질의 뉴런 및 인간 섬유 모 세포에서 Xi-연결 된 Mecp2 을 효율적으로 재 활성화 하는 PDPK1의 ACVR1 및 다운스트림 이펙터와 같은 xcifs를 대상으로 하는 강력한 소 분자 억제제를 추가로 최적화 했습니다. RTT 환자에서 ...

X 염색체 불 활성화 (XCI)는 x 염색체의 1 카피를 여성에 게 침묵 시켜 서 X-연결 된 유전자 발현을 균형 조정하는 투약 보상의 과정 이다. 그 결과, 비활성 X 염색체 (Xi)는 히스톤 H3-리 신 27 trimethylation (H3K27me3) 및 히스톤 H2A 유비퀴틴 화와 같은 DNA 메 틸 화 및 억제 히스톤을 포함 하는 이종 염색 질의 특징을 축적 한다 (H2Aub) 2. x 염색체 침묵의 마스터 조절기는 x 염색체의 카운팅 및 쌍을 제어 하는 약 100500kb의 x-불 활성화 센터 (Xic) 영역, 비활성화를 위한 x 염색체의 무작위 선택 및 개시 및 X 염색체를 따라 침묵의 확산3. X 불 활성화의 과정은 x 염색체 전체의 침묵을 매개 하 고 3 차원 구조를 리 모델링 하 여 ci 에 Xi를 코팅 하는 비활성 특이 적 전사체 (xist) x에 의해개시 된다. 최근에, 몇몇 프로테오 믹 및 유전 성 스크리닝은 xci,예컨대 xist 상호작용 단백질5,6,8,9 등의 추가의 조절기를 동정 하였다 , 10 , 11 , 12. 예를 들어, 이전에는 편견 된 게놈 전체의 RNA 간섭 화면을 이용 하 여 13 개 트랜스-작용 Xci 팩터 (xci)12를 확인 하였다. 기계적으로 XCIFs는 Xist 표현식을 조절 하므로 xcifs 기능을 방해 하면 결함이 있는 xcifs12가 발생 합니다. 이 분야의 최근 진보는 XCI를 시작 하 고 유지 하는 데 필요한 분자 기계에 대 한 중요 한 통찰을 제공 했습니다.
Xci 레 귤 레이 터의 식별 및이의 메커니즘을 이해 하는 것은 rett 일으키는 증후군 (RTT)13과 같은 X 연결 인간 질병과 직접적으로 관련이 있습니다. RTT는 주로 여자15에 영향을 미치는 X-결합 메 틸-CpG 결합 단백질 2 (MECP2)에서의 이성애 변이에 의해 발생 하는 드문 신경 발달 장애입니다. MECP2 는 X 염색체에 위치 하기 때문에, RTT 소녀는 MECP2 변이 MECP2를 발현 하는 야생 형 및 ~ 50%를 발현 하는 세포 ~ 50%의 결핍에 의존 하 고 있다. 특히, RTT 돌연변이 세포는 시 Mecp2 의 휴면 하지만 야생 형 카피를 항구에 정박 하 여, 활성화 된 경우 잠재적으로 질병의 증상을 완화 시킬 수 있는 기능적 유전자의 공급원을 제공 합니다. RTT 외에도 Xi의 재 활성화는 DDX3X 증후군과 같은 잠재적인 치료 접근법을 나타내는 여러 가지 다른 X 연결 인간 질환이 있습니다.
XCIFs의 억제, 3 phosphoinositide 의존적인 단백질 키나 제 PDPK1) 및 액티 빈 수용 체 타입 1(ACVR1), 짧은 헤어핀 RNA (shRNA) 또는 소 분자 억제제에 의해, Xi-연결 된 유전자를 재 활성화 시킨다12. Xi-연결 된 유전자의 약리학 적 재 활성화는 RTT 환자 (12) 로부터 유래 된 마우스 섬유 아 세포 주, 성체 마우스 피 질 뉴런, 마우스 배아 섬유 모 세포 및 섬유 모 세포 주를 포함 하는 다양 한 전 생체 모델에서 관찰 된다. 그러나, Xi에 연결 된 유전자의 약리학 적 재 활성화 여부는 생체 내에서 입증 될 수 있다. 한 가지 제한 요인은 재 활성화 된 Xi에서 유전자의 발현을 정확 하 게 측정 하는 효과적인 동물 모델의 부족 이다. 이 목표를 향하여, Xistδ: Mecp2/Xist: Mecp2-Gfp 마우스 모형은 모계 X 염색체16에 있는 xist 에 있는 이성애에 있는 다 수 적 삭제 때문에 모든 세포에서 Xi에 유전자로 표지 된 Mecp2 를 운반 하는 생성 되었습니다. 이 모형을 사용 하 여, Xi에서 Mecp2 의 표현은 살아있는 쥐의 두뇌에 있는 xcifs 억제제를 가진 처리 다음에 정량화 되었습니다. 여기서, 상기 Xistδ의 생성은: Mecp2/Xist: Mecp2-Gfp 마우스 모델과 면역 형광 기반 분석 법을 사용 하 여 피 질 뉴런에서의 양자화 된 Xi 재 활성화 방법을 설명 한다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >MICE</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mecp2tm3.1Bird</td>
			<td >The Jackson Laboratory</td>
			<td>#014610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >B6;129-Xist (tm5Sado)</td>
			<td>provided by Antonio Bedalov, Fred Hutchinson Cancer Center, Seattle</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >REAGENTS</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >22x22 mm coverslip</td>
			<td >FISHERfinest (Fisher Scientific)</td>
			<td >125488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >32% Paraformaldehyde</td>
			<td >Electron Microscopy Sciences</td>
			<td >15714-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >50 ml syringe</td>
			<td>Medline Industries</td>
			<td>NPMJD50LZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >60mm culture dish</td>
			<td >CellStar</td>
			<td >628160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >7-AAD </td>
			<td >BioLegend</td>
			<td >420403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ammonium chloride (NH4Cl)</td>
			<td >Fisher Chemical</td>
			<td >A661-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >anti-GFP-AlexaFluor647</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td >A-31852</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >anti-MAP2</td>
			<td >Aves Labs</td>
			<td >MAP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >BSA</td>
			<td >Promega</td>
			<td >R396D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Buprenorphine SR</td>
			<td >Zoopharm</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >citric acid </td>
			<td >Sigma</td>
			<td >C-1857</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DMSO</td>
			<td >Fisher Bioreagents</td>
			<td >BP231-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td >Corning Cellgro</td>
			<td >10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethanol</td>
			<td >Decon Labs</td>
			<td >2701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td >VWR Life Science</td>
			<td>89510-198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >gelatin</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >G9391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >glass slides</td>
			<td >Fisherbrand</td>
			<td >22-034-486</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >goat anti-chicken FITC-labeled secondary antibody </td>
			<td >Aves Labs</td>
			<td >F-1005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >GSK650394</td>
			<td >ApexBio</td>
			<td >B1051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >hamilton 10&#956;l syringe </td>
			<td >Hamilton Sigma-Aldrich</td>
			<td >28615-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >14025-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ketamine</td>
			<td>Ketaset</td>
			<td>NDC 0856-2013-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Large blunt/blunt curved scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14519-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >LDN193189</td>
			<td >Cayman Chemicals</td>
			<td >11802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >lodixanol</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >1343517</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >magnesium chloride (MgCl2)</td>
			<td >Fisher Chemical</td>
			<td >M35-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Methylcelulose</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >M0262-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >mounting medium with DAPI </td>
			<td >Vectashield</td>
			<td >H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Needle tip, 26 GA x 1.25&#34;</td>
			<td >PrecisionGlide</td>
			<td >305111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ophthalmic ointment </td>
			<td >Refresh Lacri-Lube</td>
			<td >93468</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >optimal cutting temperature (O.C.T.) </td>
			<td >ThermoFisher</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PCR mix</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep)</td>
			<td >Corning</td>
			<td >30-002-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Phosphate buffered saline pH 7.4 (PBS)</td>
			<td >Corning Cellgro</td>
			<td >46-103-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Potassium chloride (KCl)</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >P330-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >scalpel blades</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Shallow glass or plastic tray</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >skin glue/tissue adhesive</td>
			<td >3M Vetbond</td>
			<td >1469SB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >sodium azide</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >CAS 26628-22-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td >Fisher Chemical</td>
			<td >S642-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >standard hemostat forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>13013-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Standard tweezers</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11027-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Straight iris scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14058-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >sucrose</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >BP220-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tris-base</td>
			<td >Fisher Bioreagents</td>
			<td >BP152-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Triton X-100</td>
			<td >Fisher Bioreagents</td>
			<td >BP151-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypsin-EDTA </td>
			<td >Gibco</td>
			<td >15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Xylazine</td>
			<td >Akorn</td>
			<td>NDC: 59399-111-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EQUIPMENT</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Zeiss AxioObserver Live-Cell microscope </td>
			<td >Zeiss</td>
			<td >Zeiss AxioObserver</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.45mm burr</td>
			<td >IDEAL MicroDrill</td>
			<td >67-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >BD FACScalibur</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >centrifuge</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >glass homogenizer</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >cell culture incubator</td>
			<td >Thermo Scientific HERACELL VIOS 160i</td>
			<td >13-998-213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Leica 3050S research cryostat </td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >stereotactic platform </td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >thermocycler</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Timer</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ultracentrifuge</td>
			<td >Beckman Coulter Optima L-100 XP</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Water bath (37 &#186;C)</td>
			<td >Fisher Scientific Isotemp 2239</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a non-random mouse model for pharmacological reactivation of mecp2 on the inactive x chromosome

X 염색체 불 활성화 (XCI)는 남녀 간의 유전자 투약 균형을 달성 하기 위해 암컷에서 1 개의 X 염색체의 랜덤 침묵 이다. 결과적으로, 모든 암컷은 X-연결 유전자 발현에 대 한 이종 접합 이다. XCI의 주요 규제 기관 중 하나는 XCI의 시작과 유지 보수에 필수적인 Xist입니다. 이전 연구는 큰 규모의 기능 손실 유전 화면을 사용 하 여 13 개의 트랜스 행 X 염색체 불 활성화 인자 (XCIFs)를 확인 했습니다. ACVR1 및 PDPK1와 같은 XCIFs의 억제는 짧은 헤어핀 RNA 또는 소 분자 억제제를 사용 하 여 배양 된 세포에서 X 염색체 연결 유전자를 재 활성화 합니다. 그러나 생체 내에서 비활성 X 염색체를 재 활성화 시키는 타당성 및 내성이 결정 될 수 있다. 이 목표를 향하여, Xistδ: Mecp2/Xist: Mecp2-Gfp 마우스 모형은 1 개의 X 염색체에 xist 의 삭제 때문에 비 랜덤 xci로 생성 되었습니다. 이 모델을 사용 하 여 비활성 X 재 활성화의 정도는 마우스 뇌에서 XCIF 억제제로 처리 된 다음에 양자화 되었다. 최근 발표 된 결과에 따르면, 처음으로 XCIFs의 약리학 적 저해는 살아있는 마우스 뇌의 대뇌 피 질의 뉴런에서의 비활성 X 염색체 로부터 Mecp2 을 재 활성화 시킨다.

Xistδ의 타당성을 입증 하기 위해 : Mecp2/Xist: xi 재 활성화 연구를 위한 Mecp2 마우스 모델, xcif 억제제-xi-연결 된 Mecp2-gfp 의 매개 된 재 활성화는 마우스 배아 섬유 아 세포 (mefs)에서 시험 되었다. 여성 MEFs는 제 3 항 (도 1a)에 기재 된 바와 같은 15.5 Xistδ: Mecp2/xist 에서 분리 되었다. 여성 Xistδ의 유전형: Mecp2/Xist: Mecp2-Gfp mefs는 앞서 설명한 ?...

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A Non-random Mouse Model for Pharmacological Reactivation of Mecp2 on the Inactive X Chromosome

여기서, 우리는 비-랜덤 X 염색체 불 활성화와 함께 실행 가능한 여성 뮤 린 모델을 생성 하는 프로토콜을 설명 하 고, 즉 임산부-상속 된 X 염색체는 세포의 100%에서 불활성 이다. 우리는 또한 생체 내에서 비활성 X 염색체의 약리학 적 재 활성화의 타당성, 내성 및 안전성을 테스트 하기 위한 프로토콜을 설명 합니다.

비활성 X 염색체에 대 한 Mecp2의 약리학 적 재 활성화를 위한 비 랜덤 마우스 모델

X chromosome inactivation (XCI) is the random silencing of one X chromosome in females to achieve gene dosage balance between the sexes. As a result, all ...

이 프로토콜은 살아있는 마우스의 뇌에서 비활성 X 연결 Mecp2 염색체의 재활성화를 테스트하고 정량화하기 위한 비무작위 마우스 모델을 생성하는 데 사용할 수 있다. 이 모델은 DDX3X 증후군과 같은 다른 X 연결 질병 모델에서 Xi 재활성화를 연구하기 위해 쉽게 변형될 수 있다. 나는 산치타 바트나가르의 실험실에서 게시물 문서이고 나는 Zeming Zheng와 절차를 시연 할 것입니다.주미 제지의 바이트 바에 매여 선명절과 스테레오전술 플랫폼에 마취 마우스를 배치하여 시작합니다. 마우스의 머리를 레벨 평면에 유지하면서 코 클램프를 조입니다. 이어바의 높이를 조정하여 외이도의 소들 부분에 도달하여 머리를 고정 상태로 유지합니다.그런 다음 국소 살균 및 70 %에탄올의 번갈아 닦아 머리를 소독합니다. 마우스가 준비되면 멸균 메스를 사용하여 중간 두피에 0.75센티미터의 수평 절개를 합니다. 0.45 밀리미터 버를 사용하여 좌측 피질 반구 의 두 개의 대칭 구멍을 주교하여 처진 봉합사에서 2밀리미터, 정수리 뼈의 대략적인 중간에 있는 람도이드 봉합사를 드릴수 있습니다.10 마이크로리터 주사기를 스테레오테전술 플랫폼에 단단히 부착하고 새로 준비된 화학 억제제 10마이크로리터를 주사기에 적재합니다. 바늘을 두개골에 수직으로 유지하면서 첫 번째 버 구멍으로 바늘을 전진시. 바늘이 두개골을 통과할 때, 스테레오전술 디지털 디스플레이의 좌표를 제로아웃하고 2.5밀리미터깊이에 도달할 때까지 바늘 끝을 전진시다.바늘을 0.5 밀리미터에서 2밀리미터 깊이로 인출하고 1분 동안 용액의 전체 10 마이크로리터 부피를 천천히 주입한다. 모든 억제제가 전달된 후 바늘을 철회하기 전에 뇌에 바늘을 1분 더 남겨 둡니다. 차량을 제어로 사용하여 두 번째 버 구멍에 주입을 반복하고 절개 시 피부를 닫습니다.그런 다음 전체 복구까지 모니터링과 37섭씨 가열 패드에 스테레오전술 장치에서 마우스를 전송합니다. 투여량 식이요법의 끝에서, 해부 패드에 마우스를 고정. 가위와 집게를 사용하여 흉곽 바로 아래 의 정립과 복벽을 통해 측면 절개를합니다.간을 다이어프램에서 조심스럽게 분리하고 흉막의 전체 길이를 따라 다이어프램을 잘라 흉막 구멍을 노출시합니다. 가위를 사용하여 왼쪽 심실의 후부 끝에 절개를 하고 즉시 2 분 동안 PBS의 약 15 밀리리터로 오른쪽 심장 챔버를 주입하십시오. 성공적인 관류는 간 색이 빨간색에서 옅은 분홍색으로 변하게 됩니다.모든 PBS가 전달되면 2 분 동안 PBS에서 약 10 밀리리터4 %의 파라 포름알데히드로 심장을 견딜 수 있습니다. 머리를 수확 한 후 가위를 사용하여 두개골을 노출시키기 위해 두피에 중간 선 절개를합니다. 두개골의 측면 절개를 눈으로 만드는 것을 용이하게하기 위해 가위의 한 끝을 포라멘 매그넘에 놓습니다.두개골의 반대편에 유사한 절개를 가능한 한 피상적으로 가위의 끝을 유지하고 눈과 마우스의 코 위에 두개골의 영역을 잘라. 집게를 사용하여 뇌 반구에서 두개골 뼈를 부드럽게 껍질을 벗기고 주걱을 사용하여 뇌를 상승시킵니다. 조심스럽게 두개골에 뇌를 고정하고 플라스틱 접시에 뇌를 배치 두개골 신경 섬유를 해부.그런 다음 소뇌와 후각 전구를 소비합니다. 뇌 조직의 섹션을 얻으려면, 먼저 하룻밤 4 섭씨에서 PBS에서 4 %의 파라 포름 알데히드로 채워진 15 밀리리터 튜브에서 뇌를 수정합니다. 다음 날 아침, 씻는 시간 당 신선한 PBS에서 섭씨 4도에서 5 분 동안 적어도 세 번 뇌 조직을 헹구는다.마지막 세척 후 가위와 집게로 각 반구의 전면을 제거하고 샘플을 라벨이 부착된 냉동 금형 전면에 배치합니다. 각 조직을 최적의 절삭 온도 매체에 담근 후 액체 질소로 샘플을 영하 80도의 플라스틱 페트리 접시에 고정시 섭씨 80도 까지 수납합니다. Xi재활성화를 결정하기 위해 항원 검색 용액에 5~6마이크로미터 뇌 조직 섹션을 100도 의 섭씨 열 블록에서 5분간 담급니다.인큐베이션이 끝나면 슬라이드를 실온에서 5분간 세척한 후 4분간 세척한 후 슬라이드를 블로킹 용액에 담급십시오. 실온에서 20분 후, 슬라이드를 세척당 신선한 세척 버퍼로 5분간 3회 세척합니다. 하룻밤 사이에 적절한 1 차 항체로 조직 샘플을 얼룩지게합니다.형광 현미경의 슬라이드를 이미지하여 대조와 밝기를 조정하여 약물 및 차량 치료 마우스 뇌 반구모두에 대한 GFP 양성 세포의 수를 정량화할 수 있도록 합니다. 비무작위 X 염색체 불활성화 연구의 타당성을 입증하기 위해, 여성 형질성 마우스 배아 섬유아세포의 유전자형은 PCR 및 유동 세포측정에 의해 확인되었다. PCR에 의해 평가된 바와 같이, GFP 태그메틸렌 CPG 결합 단백질 2유전자 또는 MECP2의 발현은 약물에 의해 재활성화되었지만 차량 치료는 아니고.비무작위 X 염색체 불활성화 마우스 모델 배아 섬유아세포는 또한 약물 후 핵 GFP를 발현하지만 X 염색체 불활성화 인자 억제제가 다시 활성화되지 않은 X 염색체를 보여주는 차량 치료는 마우스 배아 섬유아세포에서 MECP2를 연결했다. 약물 치료는 약물 주입 된 뇌 반구의 세포의 약 30 %에서 불활성화 X 염색체 MECP2-GFP를 다시 활성화하지만 차량 주입 반구에서 재활성화가 감지되지 않습니다. microtubule-관련 단백질 2 개의 양성 뉴런은 또한 불활성화 된 X 염색체 MECP2-GFP 발현을 나타내는 약물 처리 반구에서 양성이다.약물 요법은 생체 내에서 테스트하기 전에 시험관내 투여량과 치료를 최적화하므로 작은 분자 억제제의 표적 및 효능에 의존하게 될 것이다. 비무작위 마우스 모델은 개별적으로 또는 조합하여 다른 약물을 테스트하는 데 활용할 수 있다. 사실, 우리 와 다른 몇 가지 약물 X 염색체 불 활성화 요인을 확인 했습니다.

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SCIENTISTS IN ACTION

Conjugative Mating Assays for Sequence-specific Analysis of Transfer Proteins Involved in Bacterial Conjugation

접합에 참여 전송 단백질의 서열 별 분석을위한 공역 결합 분석 실험

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia ...

연구

유전학

Pooled shRNA Screen for Reactivation of MeCP2 on the Inactive X Chromosome

풀링된 shRNA MeCP2 재 활성화 비활성화 X 염색체에 대 한 화면

Forward genetic screens using reporter genes inserted into the heterochromatin have been extensively used to investigate mechanisms of epigenetic control ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

차세대 시퀀싱의 원형 염색체 구조를 사용 하 여 유전자 규제 시퀀스의 높은 처리량 Id (4 C-seq)를 캡처

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

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Dictyostelium discoideum 셀 선택에 따라 성장과 박테리아에서의 유전 공학

Dictyostelium discoideum is an intriguing model organism for the study of cell differentiation processes during development, cell signaling, and other ...

Mass Spectrometry-Based Proteomics Analyses Using the OpenProt Database to Unveil Novel Proteins Translated from Non-Canonical Open Reading Frames

질량 분석 기반 Proteomics 분석 소설 단백질을 공개할 OpenProt 데이터베이스를 사용 하 여 비 정식 열려있는 독서 프레임에서 번역

Genome annotation is central to today's proteomic research as it draws the outlines of the proteomic landscape. Traditional models of open reading frame ...

A Robust Polymerase Chain Reaction-based Assay for Quantifying Cytosine-guanine-guanine Trinucleotide Repeats in Fragile X Mental Retardation-1 Gene

깨지기 쉬운 X 정신 지체-1 유전자에서 시토신 구아닌-구아닌 트리뉴클레오티드 반복을 정량화하기 위한 견고한 폴리머라제 연쇄 반응 기반 분석

Fragile X syndrome (FXS) and associated disorders are caused by expansion of the cytosine-guanine-guanine (CGG) trinucleotide repeat in the 5&#8217; ...

A Screening Method for Identification of Heterochromatin-Promoting Drugs Using Drosophila

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초파리를 이용한 헤테로크로마틴 촉진 약물의 식별을 위한 스크리닝 방법

Drosophila is an excellent model organism that can be used to screen compounds that might be useful for cancer therapy. The method described here is a ...

Identification of Enhancer-Promoter Contacts in Embryoid Bodies by Quantitative Chromosome Conformation Capture (4C)

Identification of Enhancer-Promoter Contacts in Embryoid Bodies by Quantitative Chromosome Conformation Capture 4C

정량적 염색체 형성(4C)에 의한 배아체에서 증강-프로모터 접촉 식별

During mammalian development, cell fates are determined through the establishment of regulatory networks that define the specificity, timing, and spatial ...

Application of DNA Fingerprinting using the D1S80 Locus in Lab Classes

Application of DNA Fingerprinting using the D1S80 Locus in Lab Classes

실험실 클래스에서 D1S80 로커스를 사용하여 DNA 지문 응용 프로그램

In biological sciences, DNA fingerprinting has been widely used for paternity testing, forensic applications and phylogenetic studies. Here, we describe a ...

Investigating the Pathogenesis of MYH7 Mutation Gly823Glu in Familial Hypertrophic Cardiomyopathy using a Mouse Model

마우스 모델을 사용한 가족성 비후성 심근병증에서 MYH7 돌연변이 Gly823Glu의 발병기전 조사

Familial hypertrophic cardiomyopathy (HCM, OMIM: 613690) is the most common cardiomyopathy in China. However, the underlying genetic etiology of HCM ...