Name: a non-random mouse model for pharmacological reactivation of mecp2 on the inactive x chromosome
Uploaded: 2019-05-22T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Non-random Mouse Model for Pharmacological Reactivation of Mecp2 on the Inactive X Chromosome at JoVE.com

Forfatterne takker Antonio Bedalov for å gi reagenser; University of Virginia tissue histologi kjerne for kryosnitt; University of Virginia Flow flowcytometri Core for Flow flowcytometri analyse; Christian Blue og saloni Singh for teknisk assistanse med genotyperingteknologi. Dette arbeidet ble støttet av en Double hoo Research Grant til Z.Z., og en pilot Project program Award fra University of Virginia-Virginia Tech Seed Fund Award og Hartwell Foundation Individual Biomedical Research Award til S.B.

Arbeid med mus ble godkjent av University of Virginia institusjonelle Animal Care og use Committee (IACUC; #4112).
1. Generer en ikke-tilfeldig XCI Mouse modell med genetisk merket Mecp2 på XI
Merk: Mouse stammer som brukes i studien var som følger: Mecp2-Gfp/Mecp2-Gfp (Mecp2TM 3.1 Bird, tabell over materialer) og Xist/ΔXist (B6; 129-Xist < tm5Sado >; levert av Antonio Bedalov...

<ol>
	<li>Lyon, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-chromosome+inactivation+as+a+system+of+gene+dosage+compensation+to+regulate+gene+expression.">X-chromosome inactivation as a system of gene dosage compensation to regulate gene expression.</a> Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology. 36, 119-130 (1989).</li><li>Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delving+into+the+diversity+of+facultative+heterochromatin:+the+epigenetics+of+the+inactive+X+chromosome.">Delving into the diversity of facultative heterochromatin: the epigenetics of the inactive X chromosome.</a> Current Opinion in Genetics Development. 15 (5), 482-489 (2005).</li><li>Augui, S., Nora, E. P., Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+X-chromosome+inactivation+by+the+X-inactivation+centre.">Regulation of X-chromosome inactivation by the X-inactivation centre.</a> Nature Review Genetics. 12 (6), 429-442 (2011).</li><li>Pontier, D. B., Gribnau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xist+regulation+and+function+explored.">Xist regulation and function explored.</a> Human Genetics. 130 (2), 223-236 (2011).</li><li>Barnes, C., Kanhere, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+RNA-Protein+Interactions+Through+In+Vitro+RNA+Pull-Down+Assays.">Identification of RNA-Protein Interactions Through In Vitro RNA Pull-Down Assays.</a> Methods in Molecular Biology. 1480, 99-113 (2016).</li><li>McHugh, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Xist+lncRNA+interacts+directly+with+SHARP+to+silence+transcription+through+HDAC3.">The Xist lncRNA interacts directly with SHARP to silence transcription through HDAC3.</a> Nature. 521 (7551), 232-236 (2015).</li><li>Minajigi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomes.+A+comprehensive+Xist+interactome+reveals+cohesin+repulsion+and+an+RNA-directed+chromosome+conformation.">Chromosomes. A comprehensive Xist interactome reveals cohesin repulsion and an RNA-directed chromosome conformation.</a> Science. 349 (6245), (2015).</li><li>Mira-Bontenbal, H., Gribnau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Xist-Interacting+Proteins+in+X-Chromosome+Inactivation.">New Xist-Interacting Proteins in X-Chromosome Inactivation.</a> Current Biology. 26 (8), R338-R342 (2016).</li><li>Mira-Bontenbal, H., Gribnau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Xist-Interacting+Proteins+in+X-Chromosome+Inactivation.">New Xist-Interacting Proteins in X-Chromosome Inactivation.</a> Curren Biology. 26 (10), 1383 (2016).</li><li>Ridings-Figueroa, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nuclear+matrix+protein+CIZ1+facilitates+localization+of+Xist+RNA+to+the+inactive+X-chromosome+territory.">The nuclear matrix protein CIZ1 facilitates localization of Xist RNA to the inactive X-chromosome territory.</a> Genes and Development. 31 (9), 876-888 (2017).</li><li>Sunwoo, H., Colognori, D., Froberg, J. E., Jeon, Y., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repeat+E+anchors+Xist+RNA+to+the+inactive+X+chromosomal+compartment+through+CDKN1A-interacting+protein+(CIZ1).">Repeat E anchors Xist RNA to the inactive X chromosomal compartment through CDKN1A-interacting protein (CIZ1).</a> Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. , (2017).</li><li>Bhatnagar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+pharmacological+reactivation+of+the+mammalian+inactive+X+chromosome.">Genetic and pharmacological reactivation of the mammalian inactive X chromosome.</a> Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (35), 12591-12598 (2014).</li><li>Zoghbi, H. Y., Percy, A. K., Schultz, R. J., Fill, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+X+chromosome+inactivation+in+the+Rett+syndrome.">Patterns of X chromosome inactivation in the Rett syndrome.</a> Brain Development. 12 (1), 131-135 (1990).</li><li>Anvret, M., Wahlstrom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rett+syndrome:+random+X+chromosome+inactivation.">Rett syndrome: random X chromosome inactivation.</a> Clinical Genetics. 45 (5), 274-275 (1994).</li><li>Amir, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rett+syndrome+is+caused+by+mutations+in+X-linked+MECP2,+encoding+methyl-CpG-binding+protein+2.">Rett syndrome is caused by mutations in X-linked MECP2, encoding methyl-CpG-binding protein 2.</a> Nature Genetics. 23 (2), 185-188 (1999).</li><li>Przanowski, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+reactivation+of+inactive+X-linked+Mecp2+in+cerebral+cortical+neurons+of+living+mice.">Pharmacological reactivation of inactive X-linked Mecp2 in cerebral cortical neurons of living mice.</a> Proceedings of Natlional Academy of Sciences of the United States of America. 115 (31), 7991-7996 (2018).</li><li>Borensztein, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xist-dependent+imprinted+X+inactivation+and+the+early+developmental+consequences+of+its+failure.">Xist-dependent imprinted X inactivation and the early developmental consequences of its failure.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 24 (3), 226-233 (2017).</li><li>Jensen, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+histological+staining+and+fluorescence+using+ImageJ.">Quantitative analysis of histological staining and fluorescence using ImageJ.</a> Anatomical Record (Hoboken). 296 (3), 378-381 (2013).</li><li>Cseke, L. J., Talley, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+PCR-based+genotyping+method+to+distinguish+between+wild-type+and+ornamental+varieties+of+Imperata+cylindrica.">A PCR-based genotyping method to distinguish between wild-type and ornamental varieties of Imperata cylindrica.</a> Journal of Visualized Experiments. (60), (2012).</li></ol>

Tidligere identifiserte XCIFs som er selektivt nødvendige for å stanse av XI-koblede gener i pattedyr kvinnelige celler,12. Vi videre optimalisert potente små molekyl hemmere å målrette XCIFs, slik som ACVR1 og nedstrøms effekt Orer av PDPK1, som effektivt reaktivere XI-koblet Mecp2 i mus Fibroblast cellelinjer, mus kortikale neurons, og en menneskelig Fibroblast celle linje avledet fra en RTT-pasient. Disse resultatene tyder på at XI reaktivering er en sannsynlig terapeutisk tiln?...

X kromosom deaktivering (XCI) er en prosess med dosering kompensasjon som balanserer X-bundet genuttrykk ved å stanse en kopi av X-kromosom i kvinner1. Som et resultat, den inaktive X-kromosom (XI) akkumulerer karakteristiske trekk ved heterochromatin inkludert DNA metylering og hemmende histone modifikasjoner, for eksempel histone H3-lysin 27 trimethylation (H3K27me3) og histone H2A ubiqitinering (H2Aub) 2. The Master regulator av x-kromosom deaktivering er x-deaktivering Center (Xic) regionen, rundt 100 − 500 kB, som styrer telling og sammenkobling av x-kromosomer, tilfeldig valg av x-kromosom for inaktive, og initiering og spredning av demping langs X-kromosom3. Prosessen med X inaktive er initiert av X inaktiv spesifikk transkripsjon (Xist) som strøk XI i CIS for å megle kromosom hele stanse og renovere den tredimensjonale strukturen i X-kromosom4. Nylig har flere Proteomikk og genetiske skjermer identifisert flere regulatorer av XCI, sliksom Xist samspill proteiner5,6,7,8,9 , 10 andre , 11 flere , 12. for eksempel, en tidligere studie ved hjelp av en upartisk Genova-Wide RNA forstyrrelser skjermen identifisert 13 trans-fungerende XCI faktorer (XCIFs)12. Mechanistically, XCIFs regulere Xist uttrykk og derfor forstyrrer XCIFs funksjonen forårsaker defekt XCI12. Sammen har nylige fremskritt i feltet gitt viktig innsikt i molekyl maskineriet som kreves for å initiere og vedlikeholde XCI.
Identifisering av XCI regulatorer og forstå deres mekanisme i XCI er direkte relevant for X-tilknyttede menneskelige sykdommer, som rett syndrom (RTT)13,14. RTT er en sjelden neurodevelopmental lidelse forårsaket av en heterozygot mutasjon i X-tilknyttede metyl-CpG bindende protein 2 (MECP2) som rammer overveiende jenter15. Fordi MECP2 ligger på X-KROMOSOM, RTT jenter er heterozygot for MECP2 mangel med ~ 50% celler uttrykker vill-type og ~ 50% uttrykker mutant MECP2. Spesielt RTT mutant celler havn en sovende men vill-type kopi av Mecp2 på XI, som gir en kilde til funksjonell genet, som hvis reaktivert, potensielt kan lindre symptomer på sykdommen. I tillegg til RTT, er det flere andre X-tilknyttede menneskelige sykdommer, som reaktivering av XI representerer en potensiell terapeutisk tilnærming, for eksempel DDX3X syndrom.
Hemming av XCIFs, 3-fosfoinositid avhengige protein kinase-1 (PDPK1), og activin A reseptor type 1 (ACVR1), enten ved korte hæler RNA (shRNA) eller små molekyl hemmere, reaktiverer XI-koblede gener12. Farmakologisk reaktivering av XI-tilknyttede gener er observert i ulike ex vivo-modeller som inkluderer muse Fibroblast cellelinjer, voksen mus kortikale neurons, mus embryonale fibroblaster, og Fibroblast cellelinjer avledet fra en RTT pasient12. Men hvorvidt farmakologisk reaktivering av XI-koblede gener er gjennomførbart i vivo gjenstår å bli demonstrert. En begrensende faktor er mangelen på effektive dyremodeller for å nøyaktig måle uttrykk for gener fra reaktivert XI. Mot dette målet, en XistΔ: Mecp2/Xist: Mecp2-Gfp mus modellen har blitt generert som bærer en genetisk merket Mecp2 på XI i alle cellene på grunn av heterozygot sletting i Xist på mors X-kromosom16. Ved hjelp av denne modellen har uttrykket Mecp2 fra Xi blitt quantitated etter behandling med XCIFs-hemmere i hjernen til levende mus. Her beskrives genereringen av XistΔ: Mecp2/Xist: Mecp2-Gfp musemodell og metodikk for å quantitate XI reaktivering i kortikale neurons med immunofluorescence-baserte analyser.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >MICE</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mecp2tm3.1Bird</td>
			<td >The Jackson Laboratory</td>
			<td>#014610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >B6;129-Xist (tm5Sado)</td>
			<td>provided by Antonio Bedalov, Fred Hutchinson Cancer Center, Seattle</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >REAGENTS</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >22x22 mm coverslip</td>
			<td >FISHERfinest (Fisher Scientific)</td>
			<td >125488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >32% Paraformaldehyde</td>
			<td >Electron Microscopy Sciences</td>
			<td >15714-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >50 ml syringe</td>
			<td>Medline Industries</td>
			<td>NPMJD50LZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >60mm culture dish</td>
			<td >CellStar</td>
			<td >628160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >7-AAD </td>
			<td >BioLegend</td>
			<td >420403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ammonium chloride (NH4Cl)</td>
			<td >Fisher Chemical</td>
			<td >A661-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >anti-GFP-AlexaFluor647</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td >A-31852</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >anti-MAP2</td>
			<td >Aves Labs</td>
			<td >MAP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >BSA</td>
			<td >Promega</td>
			<td >R396D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Buprenorphine SR</td>
			<td >Zoopharm</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >citric acid </td>
			<td >Sigma</td>
			<td >C-1857</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DMSO</td>
			<td >Fisher Bioreagents</td>
			<td >BP231-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td >Corning Cellgro</td>
			<td >10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethanol</td>
			<td >Decon Labs</td>
			<td >2701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td >VWR Life Science</td>
			<td>89510-198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >gelatin</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >G9391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >glass slides</td>
			<td >Fisherbrand</td>
			<td >22-034-486</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >goat anti-chicken FITC-labeled secondary antibody </td>
			<td >Aves Labs</td>
			<td >F-1005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >GSK650394</td>
			<td >ApexBio</td>
			<td >B1051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >hamilton 10&#956;l syringe </td>
			<td >Hamilton Sigma-Aldrich</td>
			<td >28615-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >14025-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ketamine</td>
			<td>Ketaset</td>
			<td>NDC 0856-2013-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Large blunt/blunt curved scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14519-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >LDN193189</td>
			<td >Cayman Chemicals</td>
			<td >11802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >lodixanol</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >1343517</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >magnesium chloride (MgCl2)</td>
			<td >Fisher Chemical</td>
			<td >M35-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Methylcelulose</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >M0262-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >mounting medium with DAPI </td>
			<td >Vectashield</td>
			<td >H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Needle tip, 26 GA x 1.25&#34;</td>
			<td >PrecisionGlide</td>
			<td >305111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ophthalmic ointment </td>
			<td >Refresh Lacri-Lube</td>
			<td >93468</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >optimal cutting temperature (O.C.T.) </td>
			<td >ThermoFisher</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PCR mix</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep)</td>
			<td >Corning</td>
			<td >30-002-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Phosphate buffered saline pH 7.4 (PBS)</td>
			<td >Corning Cellgro</td>
			<td >46-103-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Potassium chloride (KCl)</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >P330-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >scalpel blades</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Shallow glass or plastic tray</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >skin glue/tissue adhesive</td>
			<td >3M Vetbond</td>
			<td >1469SB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >sodium azide</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >CAS 26628-22-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td >Fisher Chemical</td>
			<td >S642-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >standard hemostat forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>13013-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Standard tweezers</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11027-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Straight iris scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14058-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >sucrose</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >BP220-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tris-base</td>
			<td >Fisher Bioreagents</td>
			<td >BP152-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Triton X-100</td>
			<td >Fisher Bioreagents</td>
			<td >BP151-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypsin-EDTA </td>
			<td >Gibco</td>
			<td >15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Xylazine</td>
			<td >Akorn</td>
			<td>NDC: 59399-111-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EQUIPMENT</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Zeiss AxioObserver Live-Cell microscope </td>
			<td >Zeiss</td>
			<td >Zeiss AxioObserver</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.45mm burr</td>
			<td >IDEAL MicroDrill</td>
			<td >67-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >BD FACScalibur</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >centrifuge</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >glass homogenizer</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >cell culture incubator</td>
			<td >Thermo Scientific HERACELL VIOS 160i</td>
			<td >13-998-213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Leica 3050S research cryostat </td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >stereotactic platform </td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >thermocycler</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Timer</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ultracentrifuge</td>
			<td >Beckman Coulter Optima L-100 XP</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Water bath (37 &#186;C)</td>
			<td >Fisher Scientific Isotemp 2239</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a non-random mouse model for pharmacological reactivation of mecp2 on the inactive x chromosome

X kromosom inaktive (XCI) er tilfeldig demping av ett X-kromosom i kvinner for å oppnå gen dosering balanse mellom kjønnene. Som et resultat, er alle kvinner heterozygot for X-bundet genuttrykk. En av de viktigste regulatorer av XCI er Xist, som er avgjørende for initiering og vedlikehold av XCI. Tidligere studier har identifisert 13 trans fungerende X-kromosom inaktive faktorer (XCIFs) ved hjelp av en stor skala, tap-of-Function genetisk skjerm. Hemming av XCIFs, slik som ACVR1 og PDPK1, ved bruk av kort-eller små molekyl hemmere, reaktiverer X kromosom-tilknyttede gener i kultivert celler. Men gjennomførbarhet og toleranse for reaktivering av inaktive X-kromosom in vivo gjenstår å bestemmes. Mot dette målet har en XistΔ: Mecp2/Xist: Mecp2-Gfp musemodell blitt generert med ikke-tilfeldige XCI på grunn av sletting av Xist på ett X-kromosom. Ved hjelp av denne modellen, omfanget av inaktive X reaktivering ble quantitated i musen hjernen etter behandling med XCIF-hemmere. Nylig publiserte resultater viser, for første gang, at farmakologisk hemming av XCIFs reaktiverer Mecp2 fra inaktive X-kromosom i kortikale neurons av levende mus hjernen.

For å demonstrere muligheten for XistΔ: Mecp2/Xist: Mecp2-Gfp mus modell for XI reaktivering studier, XCIF inhibitor-mediert reaktivering av XI-koblet Mecp2-Gfp ble testet i mus embryonale fibroblaster (MEFs). Kvinnelige MEFs ble isolert fra dag 15,5 XistΔ: Mecp2/Xist: Mecp2-Gfp embryo som beskrevet i avsnitt 3 (figur 1a). Genotyper av kvinnelige XistΔ: Mecp2/Xist: Mecp2-Gfp MEFs ble bekreftet av GENOTYPERINGTEKNOLOGI-PCR, som beskr...

Watch this Scientific Journal Video about A Non-random Mouse Model for Pharmacological Reactivation of Mecp2 on the Inactive X Chromosome at JoVE.com

A Non-random Mouse Model for Pharmacological Reactivation of Mecp2 on the Inactive X Chromosome

Her beskriver vi en protokoll for å generere en levedyktig kvinnelig murine modell med ikke-tilfeldig X-kromosom inaktive, det vil si at moderskap X-kromosom er inaktiv i 100% av cellene. Vi beskriver også en protokoll for å teste gjennomførbarhet, toleranse og sikkerhet for farmakologisk reaktivering av det inaktive X-kromosom in vivo.

En ikke-tilfeldig Mouse modell for farmakologisk reaktivering av Mecp2 på inaktiv X-kromosom

X chromosome inactivation (XCI) is the random silencing of one X chromosome in females to achieve gene dosage balance between the sexes. As a result, all ...

Denne protokollen kan brukes til å generere en ikke-tilfeldig musemodell for testing og kvantifisering av reaktivering av det inaktive X-koblede Mecp2-kromosomet i hjernen til en levende mus. Denne modellen kan enkelt endres for å studere Xi reaktivering i andre X-koblede sykdomsmodeller som DDX3X syndrom. Jeg er en post doc i Sanchita Bhatnagar laboratorium og jeg vil demonstrere prosedyren med Zeming Zheng.Begynn med å plassere den bedøvede musen i en stereotaktisk plattform med fortennene hekta i bitebaren på snuteholdsholderet. Stram neseklemmen mens du holder musens hode på et plan. Juster høyden på ørestengene for å nå den halende delen av øregangen for å holde hodet immobilisert.Desinfiser deretter hodet med vekslende kluter av et aktuelt antiseptisk middel og 70% etanol. Når musen er klar, bruk en steril skalpell for å lage et 0, 75 centimeter horisontalt snitt i midt hodebunnen. Bruk en 0,45 millimeter burr for å bore to symmetriske hull over høyre og venstre kortikale halvkuler to millimeter fra sagittal sutur og lambdoid sutur på omtrentlig midten av parietal bein.Fest en 10 mikrolitersprøyte fast i stereotaktisk plattform og last 10 mikroliter nyforberedt kjemisk hemmer inn i sprøyten. Før nålen inn i det første burr hullet mens du holder nålen vinkelrett på skallen. Når nålen krysser skallen, null ut koordinatene på stereotaktisk digital skjerm og gå spissen av nålen til den når en dybde på 2,5 millimeter.Trekk nålen 0,5 millimeter til en dybde på to millimeter og injiser sakte hele 10 mikrolitervolumet av løsningen over en periode på ett minutt. Etter at alle hemmerne er levert, la nålen stå i hjernen i et minutt før du trekker nålen tilbake. Gjenta injeksjonen i det andre graders hullet ved hjelp av kjøretøy bare som en kontroll og lukk huden over snittet.Overfør deretter musen fra det stereotaktiske apparatet til en 37 graders Celsius varmepute med overvåking til full gjenoppretting. På slutten av doseringsregimet, fest musen på en disseksjonspute. Bruk saks og tang for å gjøre et lateralt snitt gjennom integument og bukveggen like under brystkassen.Separer leveren forsiktig fra membranen og skjær gjennom membranen langs hele brystkassens lengde for å eksponere pleuralhulen. Bruk saksen til å gjøre et snitt til den bakre enden av venstre ventrikkel og umiddelbart injisere høyre hjertekammer med ca 15 milliliter PBS over en to-minutters periode. En vellykket perfusjon vil resultere i en leverfargeendring fra rød til blek rosa.Når hele PBS er levert, perfuse hjertet med ca 10 milliliter av 4% paraformaldehyd i PBS over to minutter. Etter høsting av hodet, bruk saks for å lage et midtlinjet snitt i hodebunnen for å avsløre skallen. Plasser en spiss av saksen i foramen magnum for å lette opprettelsen av et lateralt snitt i skallen mot øyet.Gjør et lignende snitt på den andre siden av skallen holde enden av saksen så overfladisk som mulig og kutte regionen av skallen mellom øynene og over nesen på musen. Bruk tang til å forsiktig skrelle kraniale bein fra hjernens halvkule og bruke en slikkepott for å heve hjernen. Disseker forsiktig kraniale nervefibre som fikser hjernen til skallen og plasserer hjernen i en plastfat.Deretter forbruker cerebellum og olfaktoriske pærer. For å få deler av hjernevevet, må du først fikse hjernen i et 15 milliliter rør fylt med 4% paraformaldehyd i PBS ved fire grader Celsius over natten. Neste morgen, skyll hjernevevet minst tre ganger i fem minutter ved fire grader Celsius i fersk PBS per vask.Etter den siste vasken, fjern forsiden av hver halvkule med saks og tang og legg prøvene i merkede kryoformer foran ned. Senk hvert vev i optimalt skjæretemperaturmedium før du klikker fryse prøvene i flytende nitrogen i en 10 millimeter plast Petriskål for minus 80 grader Celsius lagring. For å bestemme Xi reaktivering, dypp fem til seks mikrometer hjernevev seksjoner i antigen gjenfinning løsning i fem minutter på en 100 grader Celsius varmeblokk.På slutten av inkubasjonen vasker du lysbildene med fire fem minutters vask ved romtemperatur med frisk PBS per vask før du senker lysbildene i blokkeringsløsning. Etter 20 minutter ved romtemperatur, vask lysbildene tre ganger i fem minutter i frisk vaskebuffer per vask. Flekk vevsprøvene med de riktige primære antistoffene ved fire grader Celsius over natten.Bilde lysbildene på et fluorescensmikroskop som justerer kontrasten og lysstyrken for å tillate kvantifisering av antall GFP-positive celler for både stoff- og kjøretøybehandlet musehjernehalvkuler. For å demonstrere muligheten for den ikke-tilfeldige X-kromosominaktiveringsmusmodellen for inaktive X-kromosomreaktiveringsstudier, ble genotypene av kvinnelig transgen mus embryonisk fibroblast bekreftet ved genotyping PCR og strømningscytometri. Som vurdert av PCR, uttrykket av GFP merket metylen CPG bindende protein to genet eller MECP2 ble reaktivert av narkotika, men ikke kjøretøy behandling.Ikke-tilfeldige X-kromosominaktiveringsmusmodell embryonale fibroblaster uttrykte også kjernefysisk GFP etter legemiddel, men ikke kjøretøybehandling som viser X-kromosominaktiveringsfaktorhemmerne reaktiverer inaktiverte X-kromosom knyttet MECP2 i mus embryonale fibroblaster. Medikamentbehandling reaktiverer inaktivert X-kromosom MECP2-GFP i ca 30% av cellene i narkotika infundert hjernehalvkuler mens ingen reaktivering oppdages i kjøretøy infunderte halvkuler. Mikrotubuli-assosiert protein to positive nevroner er også GFP positive i legemidler behandlet halvkuler som indikerer inaktivert X kromosom MECP2-GFP uttrykk.Legemiddelregimet vil være avhengig av målet og effekten av de små molekylhemmerne, så optimaliser dosen og behandlingen in vitro før du tester in vivo. Den ikke-tilfeldige musemodellen kan brukes til å teste forskjellige stoffer enten individuelt eller i kombinasjon. Faktisk har vi og andre identifisert flere druggable X kromosom inaktiveringsfaktorer.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Molecular Biology

Genetics

Unit 2

Mendelian Genetics

SCIENTISTS IN ACTION

Conjugative Mating Assays for Sequence-specific Analysis of Transfer Proteins Involved in Bacterial Conjugation

Konjugerbare Mating Analyser for sekvens-spesifikk analyse av Transfer proteiner involvert i Konjugasjon

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia ...

Pooled shRNA Screen for Reactivation of MeCP2 on the Inactive X Chromosome

Grupperte shRNA skjermen for aktivering av MeCP2 på inaktive X-kromosomet

Forward genetic screens using reporter genes inserted into the heterochromatin have been extensively used to investigate mechanisms of epigenetic control ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

Høy gjennomstrømming identifikasjon av regulatoriske gensekvenser med neste generasjons sekvensering av runde kromosom konformasjon fange (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

Genteknologi Dictyostelium discoideum cellene basert på valget og vekst på bakterier

Dictyostelium discoideum is an intriguing model organism for the study of cell differentiation processes during development, cell signaling, and other ...

Mass Spectrometry-Based Proteomics Analyses Using the OpenProt Database to Unveil Novel Proteins Translated from Non-Canonical Open Reading Frames

Masse massespektrometri-baserte Proteomikk analyser bruker OpenProt databasen å avsløre romanen proteiner oversatt fra ikke-kanoniske åpent lesing rammer

Genome annotation is central to today's proteomic research as it draws the outlines of the proteomic landscape. Traditional models of open reading frame ...

A Robust Polymerase Chain Reaction-based Assay for Quantifying Cytosine-guanine-guanine Trinucleotide Repeats in Fragile X Mental Retardation-1 Gene

En robust polymerase Kjedere reaksjon-basert analyse for kvantifisere Cytosin-Guanin-Guanin Trinucleotide gjentar i skjøre X mental retardasjon-1 Gene

Fragile X syndrome (FXS) and associated disorders are caused by expansion of the cytosine-guanine-guanine (CGG) trinucleotide repeat in the 5&#8217; ...

A Screening Method for Identification of Heterochromatin-Promoting Drugs Using Drosophila

A Screening Method for Identification of Heterochromatin-Promoting Drugs Using Drosophila

En screeningmetode for identifisering av heterochromatinfremmende legemidler ved hjelp av drosofil

Drosophila is an excellent model organism that can be used to screen compounds that might be useful for cancer therapy. The method described here is a ...

Identification of Enhancer-Promoter Contacts in Embryoid Bodies by Quantitative Chromosome Conformation Capture (4C)

Identification of Enhancer-Promoter Contacts in Embryoid Bodies by Quantitative Chromosome Conformation Capture 4C

Identifikasjon av enhancer-promoter kontakter i embryoid organer av kvantitative kromosom conformation capture (4C)

During mammalian development, cell fates are determined through the establishment of regulatory networks that define the specificity, timing, and spatial ...

Application of DNA Fingerprinting using the D1S80 Locus in Lab Classes

Application of DNA Fingerprinting using the D1S80 Locus in Lab Classes

Påføring av DNA-fingeravtrykk ved hjelp av D1S80 Locus i laboratorieklasser

In biological sciences, DNA fingerprinting has been widely used for paternity testing, forensic applications and phylogenetic studies. Here, we describe a ...

Investigating the Pathogenesis of MYH7 Mutation Gly823Glu in Familial Hypertrophic Cardiomyopathy using a Mouse Model

Undersøkelse av patogenesen av MYH7-mutasjonen Gly823Glu i familiær hypertrofisk kardiomyopati ved hjelp av en musemodell

Familial hypertrophic cardiomyopathy (HCM, OMIM: 613690) is the most common cardiomyopathy in China. However, the underlying genetic etiology of HCM ...