Name: a non-random mouse model for pharmacological reactivation of mecp2 on the inactive x chromosome
Uploaded: 2019-05-22T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Non-random Mouse Model for Pharmacological Reactivation of Mecp2 on the Inactive X Chromosome at JoVE.com

Авторы благодарят Антонио Бедалов за предоставление реагентов; Университет Вирджинии ткань гистологии ядро для криосекционирования; Университет Вирджинии поток Цитометрическая основа для анализа потока цитометрии; Кристиан Блю и Салони Сингх за техническую помощь в генотипирования. Эта работа была поддержана Грант двойного Ху исследований в З.З., и Пилотная программа премии проекта от Университета Вирджинии-Вирджиния Tech семенной фонд премии и Хартвелл фонда индивидуальные биомедицинских исследований премии С.Б.

Работа с участием мышей была одобрена университетом Вирджинии институциональных Комитета по уходу за животными и использования (ЯКУЦ; #4112).
1. генерировать Неслучайные XCI мышь модель с генетически помечены Mecp2 на XI
Примечание: Мыши штаммов, испо...

<ol>
	<li>Lyon, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-chromosome+inactivation+as+a+system+of+gene+dosage+compensation+to+regulate+gene+expression.">X-chromosome inactivation as a system of gene dosage compensation to regulate gene expression.</a> Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology. 36, 119-130 (1989).</li><li>Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delving+into+the+diversity+of+facultative+heterochromatin:+the+epigenetics+of+the+inactive+X+chromosome.">Delving into the diversity of facultative heterochromatin: the epigenetics of the inactive X chromosome.</a> Current Opinion in Genetics Development. 15 (5), 482-489 (2005).</li><li>Augui, S., Nora, E. P., Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+X-chromosome+inactivation+by+the+X-inactivation+centre.">Regulation of X-chromosome inactivation by the X-inactivation centre.</a> Nature Review Genetics. 12 (6), 429-442 (2011).</li><li>Pontier, D. B., Gribnau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xist+regulation+and+function+explored.">Xist regulation and function explored.</a> Human Genetics. 130 (2), 223-236 (2011).</li><li>Barnes, C., Kanhere, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+RNA-Protein+Interactions+Through+In+Vitro+RNA+Pull-Down+Assays.">Identification of RNA-Protein Interactions Through In Vitro RNA Pull-Down Assays.</a> Methods in Molecular Biology. 1480, 99-113 (2016).</li><li>McHugh, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Xist+lncRNA+interacts+directly+with+SHARP+to+silence+transcription+through+HDAC3.">The Xist lncRNA interacts directly with SHARP to silence transcription through HDAC3.</a> Nature. 521 (7551), 232-236 (2015).</li><li>Minajigi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomes.+A+comprehensive+Xist+interactome+reveals+cohesin+repulsion+and+an+RNA-directed+chromosome+conformation.">Chromosomes. A comprehensive Xist interactome reveals cohesin repulsion and an RNA-directed chromosome conformation.</a> Science. 349 (6245), (2015).</li><li>Mira-Bontenbal, H., Gribnau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Xist-Interacting+Proteins+in+X-Chromosome+Inactivation.">New Xist-Interacting Proteins in X-Chromosome Inactivation.</a> Current Biology. 26 (8), R338-R342 (2016).</li><li>Mira-Bontenbal, H., Gribnau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Xist-Interacting+Proteins+in+X-Chromosome+Inactivation.">New Xist-Interacting Proteins in X-Chromosome Inactivation.</a> Curren Biology. 26 (10), 1383 (2016).</li><li>Ridings-Figueroa, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nuclear+matrix+protein+CIZ1+facilitates+localization+of+Xist+RNA+to+the+inactive+X-chromosome+territory.">The nuclear matrix protein CIZ1 facilitates localization of Xist RNA to the inactive X-chromosome territory.</a> Genes and Development. 31 (9), 876-888 (2017).</li><li>Sunwoo, H., Colognori, D., Froberg, J. E., Jeon, Y., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repeat+E+anchors+Xist+RNA+to+the+inactive+X+chromosomal+compartment+through+CDKN1A-interacting+protein+(CIZ1).">Repeat E anchors Xist RNA to the inactive X chromosomal compartment through CDKN1A-interacting protein (CIZ1).</a> Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. , (2017).</li><li>Bhatnagar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+pharmacological+reactivation+of+the+mammalian+inactive+X+chromosome.">Genetic and pharmacological reactivation of the mammalian inactive X chromosome.</a> Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (35), 12591-12598 (2014).</li><li>Zoghbi, H. Y., Percy, A. K., Schultz, R. J., Fill, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+X+chromosome+inactivation+in+the+Rett+syndrome.">Patterns of X chromosome inactivation in the Rett syndrome.</a> Brain Development. 12 (1), 131-135 (1990).</li><li>Anvret, M., Wahlstrom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rett+syndrome:+random+X+chromosome+inactivation.">Rett syndrome: random X chromosome inactivation.</a> Clinical Genetics. 45 (5), 274-275 (1994).</li><li>Amir, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rett+syndrome+is+caused+by+mutations+in+X-linked+MECP2,+encoding+methyl-CpG-binding+protein+2.">Rett syndrome is caused by mutations in X-linked MECP2, encoding methyl-CpG-binding protein 2.</a> Nature Genetics. 23 (2), 185-188 (1999).</li><li>Przanowski, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+reactivation+of+inactive+X-linked+Mecp2+in+cerebral+cortical+neurons+of+living+mice.">Pharmacological reactivation of inactive X-linked Mecp2 in cerebral cortical neurons of living mice.</a> Proceedings of Natlional Academy of Sciences of the United States of America. 115 (31), 7991-7996 (2018).</li><li>Borensztein, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xist-dependent+imprinted+X+inactivation+and+the+early+developmental+consequences+of+its+failure.">Xist-dependent imprinted X inactivation and the early developmental consequences of its failure.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 24 (3), 226-233 (2017).</li><li>Jensen, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+histological+staining+and+fluorescence+using+ImageJ.">Quantitative analysis of histological staining and fluorescence using ImageJ.</a> Anatomical Record (Hoboken). 296 (3), 378-381 (2013).</li><li>Cseke, L. J., Talley, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+PCR-based+genotyping+method+to+distinguish+between+wild-type+and+ornamental+varieties+of+Imperata+cylindrica.">A PCR-based genotyping method to distinguish between wild-type and ornamental varieties of Imperata cylindrica.</a> Journal of Visualized Experiments. (60), (2012).</li></ol>

Ранее, XCIFs, которые выборочно необходимы для глушителей XI связанных генов в млекопитающих женских клеток были выявлены12. Мы дополнительно оптимизированы мощные малые ингибиторы молекул целевой XCIFs, таких, как ACVR1 и вниз по течению эффекторы PDPK1, который эффективно активиров...

X-хромосома инактивации (XCI) является процесс дозировки компенсации, которая уравновешивает X-сцеженно экспрессии генов, глушителей одной копии х-хромосоме у самок1. В результате неактивная х-хромосома (XI) накапливает характерные особенности гетьхроматина, включая метилирование ДНК и ингибирующие гистоун модификации, такие как гистоун Н3-лизин 27 триметилирования (H3K27me3) и гистоун Н2А убиквителинация (H2Aub) 2. Мастер регулятор глушителей x-хромосомы является x-инактивации центр (XIC) область, вокруг 100 − 500 КБ, который контролирует подсчет и спаривание х-хромосом, случайный выбор х-хромосомы для инактивации, и инициирования и распространение глушителей по X хромосоме3. Процесс х инактивации инициируется X неактивные конкретные Стенограмма (Xist), что пальто XI в СНГ , чтобы посредничать хромосомы всей глушителей и переделывать трехмерную структуру х-хромосоме4. В последнее время несколько протеомических и генетических экранов выявили дополнительные регуляторы xci, такие как xci взаимодействующие белки5,6,7,8,9 , 10 , 11 , 12. Например, в предыдущем исследовании с использованием беспристрастного генома на экране РНК-интерференции были определены 13 трансдействующих факторов Xci (xcifs)12. Механистично, XCIFs регулирует Xist выражение и поэтому, вмешиваясь в функции xcifs вызывает ДЕФЕКТНЫЙ xci12. В совокупности недавние достижения в этой области обеспечили важное понимание молекулярного механизма, необходимого для инициирования и поддержания XCI.
Идентификация регуляторов xci и понимание их механизма в xci напрямую связаны с х-связанными заболеваниями человека, такими как синдром Ретта (RTT)13,14. RTT является редким нейроразвития расстройство вызвано гетерозиготной мутации в X-связанной метил-CpG связывающий белок 2 (MECP2), который затрагивает преимущественно девочек15. Потому что MECP2 находится на х-хромосоме, RTT девушки гетерозиготных для MECP2 дефицита с ~ 50% клеток, выражающих дикого типа и ~ 50% выражения мутант MECP2. Примечательно, что клетки мутанта RTT гавани спящие, но дикого типа копия Mecp2 на XI, обеспечивая источник функционального гена, который, если возобновлена, потенциально может облегчить симптомы болезни. В дополнение к RTT, есть несколько других х-связанных заболеваний человека, для которых реактивации XI представляет потенциальный терапевтический подход, таких как синдром DDX3X.
Ингибирование XCIFs, 3-фосфоиноситиде зависимых протеинкиназы-1 (PDPK1), и Активо рецептор типа 1 (ACVR1), либо короткой РНК-шпилька (Шрана), либо малых ингибиторов молекул, активирует XI-сцеживание генов12. Фармакологическая Реактивация XI связанных генов наблюдается в различных бывших моделях в естественных условиях, которые включают клеточные линии фиброза мыши, Взрослый корковых нейронов мыши, мышь эмбриональных фибробласты, и фиброза клеточных линий, полученных от пациента RTT12. Однако, является ли Фармакологическое возобновление XI связанных генов возможно в естественных условиях еще предстоит продемонстрировать. Одним из ограничивающих факторов является отсутствие эффективных моделей животных, позволяющих точно измерить экспрессию генов у активированным XI. К этой цели, ксистδ: Mecp2/Xist: Mecp2-GFP мышь модель была сгенерирована, что несет генетически помечены Mecp2 на XI во всех клетках из-за гетерозиготного удаления в Xist на материнской X хромосоме16. С помощью этой модели, выражение Mecp2 из XI было кванцирован после лечения ингибиторами XCIFs в мозге живых мышей. Здесь описывается генерация модели мыши ксистδ: Mecp2/Xist: Mecp2-GFP и методология Квантета Си реактивации в корковых нейронами с использованием метода иммунофлуоресцентного анализа.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >MICE</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mecp2tm3.1Bird</td>
			<td >The Jackson Laboratory</td>
			<td>#014610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >B6;129-Xist (tm5Sado)</td>
			<td>provided by Antonio Bedalov, Fred Hutchinson Cancer Center, Seattle</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >REAGENTS</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >22x22 mm coverslip</td>
			<td >FISHERfinest (Fisher Scientific)</td>
			<td >125488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >32% Paraformaldehyde</td>
			<td >Electron Microscopy Sciences</td>
			<td >15714-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >50 ml syringe</td>
			<td>Medline Industries</td>
			<td>NPMJD50LZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >60mm culture dish</td>
			<td >CellStar</td>
			<td >628160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >7-AAD </td>
			<td >BioLegend</td>
			<td >420403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ammonium chloride (NH4Cl)</td>
			<td >Fisher Chemical</td>
			<td >A661-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >anti-GFP-AlexaFluor647</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td >A-31852</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >anti-MAP2</td>
			<td >Aves Labs</td>
			<td >MAP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >BSA</td>
			<td >Promega</td>
			<td >R396D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Buprenorphine SR</td>
			<td >Zoopharm</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >citric acid </td>
			<td >Sigma</td>
			<td >C-1857</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DMSO</td>
			<td >Fisher Bioreagents</td>
			<td >BP231-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td >Corning Cellgro</td>
			<td >10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethanol</td>
			<td >Decon Labs</td>
			<td >2701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td >VWR Life Science</td>
			<td>89510-198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >gelatin</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >G9391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >glass slides</td>
			<td >Fisherbrand</td>
			<td >22-034-486</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >goat anti-chicken FITC-labeled secondary antibody </td>
			<td >Aves Labs</td>
			<td >F-1005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >GSK650394</td>
			<td >ApexBio</td>
			<td >B1051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >hamilton 10&#956;l syringe </td>
			<td >Hamilton Sigma-Aldrich</td>
			<td >28615-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >14025-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ketamine</td>
			<td>Ketaset</td>
			<td>NDC 0856-2013-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Large blunt/blunt curved scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14519-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >LDN193189</td>
			<td >Cayman Chemicals</td>
			<td >11802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >lodixanol</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >1343517</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >magnesium chloride (MgCl2)</td>
			<td >Fisher Chemical</td>
			<td >M35-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Methylcelulose</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >M0262-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >mounting medium with DAPI </td>
			<td >Vectashield</td>
			<td >H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Needle tip, 26 GA x 1.25&#34;</td>
			<td >PrecisionGlide</td>
			<td >305111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ophthalmic ointment </td>
			<td >Refresh Lacri-Lube</td>
			<td >93468</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >optimal cutting temperature (O.C.T.) </td>
			<td >ThermoFisher</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PCR mix</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep)</td>
			<td >Corning</td>
			<td >30-002-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Phosphate buffered saline pH 7.4 (PBS)</td>
			<td >Corning Cellgro</td>
			<td >46-103-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Potassium chloride (KCl)</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >P330-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >scalpel blades</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Shallow glass or plastic tray</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >skin glue/tissue adhesive</td>
			<td >3M Vetbond</td>
			<td >1469SB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >sodium azide</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >CAS 26628-22-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td >Fisher Chemical</td>
			<td >S642-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >standard hemostat forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>13013-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Standard tweezers</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11027-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Straight iris scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14058-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >sucrose</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >BP220-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tris-base</td>
			<td >Fisher Bioreagents</td>
			<td >BP152-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Triton X-100</td>
			<td >Fisher Bioreagents</td>
			<td >BP151-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypsin-EDTA </td>
			<td >Gibco</td>
			<td >15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Xylazine</td>
			<td >Akorn</td>
			<td>NDC: 59399-111-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EQUIPMENT</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Zeiss AxioObserver Live-Cell microscope </td>
			<td >Zeiss</td>
			<td >Zeiss AxioObserver</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.45mm burr</td>
			<td >IDEAL MicroDrill</td>
			<td >67-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >BD FACScalibur</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >centrifuge</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >glass homogenizer</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >cell culture incubator</td>
			<td >Thermo Scientific HERACELL VIOS 160i</td>
			<td >13-998-213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Leica 3050S research cryostat </td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >stereotactic platform </td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >thermocycler</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Timer</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ultracentrifuge</td>
			<td >Beckman Coulter Optima L-100 XP</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Water bath (37 &#186;C)</td>
			<td >Fisher Scientific Isotemp 2239</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a non-random mouse model for pharmacological reactivation of mecp2 on the inactive x chromosome

X-хромосома инактивации (XCI) является случайный глушителей одной х-хромосоме у женщин для достижения баланса гена дозировки между полами. В результате, все самки гетерозиготные для X-сцеженный экспрессии генов. Одним из ключевых регуляторов XCI является Xci, который имеет важное значение для инициирования и поддержания xci. Предыдущие исследования выявили 13 транс действующих факторов инактивации X хромосом (XCIFs), используя крупномасштабные, потери функции генетического экрана. Ингибирование XCIFs, таких как ACVR1 и PDPK1, используя короткую шпильку РНК или малых ингибиторов молекул, активирует X хромосома связаны генов в культивируемых клеток. Но осуществимость и переносимость повторного активации неактивной х-хромосомы в естественных условиях еще предстоит определить. К этой цели, модель мыши ксистδ: Mecp2/Xist: Mecp2-GFP была сгенерированный с non-случайным Xist из-за удаления Xist на одной X хромосоме. При использовании этой модели степень неактивного X реактивации была количественно в мозге мыши после лечения ингибиторами КСИФ. Недавно опубликованные результаты показывают, впервые, что Фармакологическое торможение XCIFs активирует Mecp2 из неактивной х-хромосомы в корковых нейронами мозга живого мыши.

Для демонстрации целесообразности ксистδ: Mecp2/Xist: Mecp2-GFP модель мыши для XI реактивации исследования, ИНГИБИТОР xкиф-опосредованной активации XI связанных Mecp2-GFP был протестирован в эмбриональных фибробласты мыши (MEFS). Женский MEFs были изолированы от дня 15,5 ксис?...

Watch this Scientific Journal Video about A Non-random Mouse Model for Pharmacological Reactivation of Mecp2 on the Inactive X Chromosome at JoVE.com

A Non-random Mouse Model for Pharmacological Reactivation of Mecp2 on the Inactive X Chromosome

Здесь мы описываем протокол для создания жизнеспособной женской модели Мурины с неслучайной инактивации х-хромосомы, т. е., унаследованная по наследству х-хромосома неактивна в 100% клеток. Мы также описываем протокол для проверки осуществимости, переносимости и безопасности фармакологической активации неактивной х-хромосомы в естественных условиях.

Модель неслучайной мыши для фармакологической активации Mecp2 на неактивной х-хромосоме

X chromosome inactivation (XCI) is the random silencing of one X chromosome in females to achieve gene dosage balance between the sexes. As a result, all ...

Этот протокол может быть использован для создания не случайной модели мыши для тестирования и количественной оценки реактивации неактивной X-связанной хромосомы Mecp2 в мозге живой мыши. Эта модель может быть легко изменена для изучения реактивации Xi в других моделях болезней, связанных с X, таких как синдром DDX3X. Я пост документ в лаборатории Санчита Бхатнагар, и я буду демонстрировать процедуру с Земинг Чжэн.Начните с позиционирования анестезированной мыши в стереотаксической платформе с резцами, зацепленными в баре укуса ревербератора морды. Затяните зажим носа, сохраняя при этом голову мыши на плоскости уровня. Отрегулируйте высоту баров уха, чтобы достичь хвостовой части ушного канала, чтобы держать голову обездвиженным.Затем дезинфицировать голову чередующимися салфетками местного антисептика и 70%этанола. Когда мышь будет готова, используйте стерильный скальпель, чтобы сделать 0,75 сантиметра горизонтального разреза в середине кожи головы. Используйте заусенец диаметром 0,45 миллиметра для бурения двух симметричных отверстий над правым и левым корковым полушариями в двух миллиметрах от сагиттального шва и шва ягненка в приблизительной середине теменной кости.Твердо прикрепите 10 микролитровый шприц к стереотаксической платформе и загрузите в шприц 10 микролитров свежеприготовленного химического ингибитора. Заранее иглы в первое отверстие заусенцев, сохраняя при этом иглу перпендикулярно черепу. Когда игла пересекает череп, обнуляет координаты на стереотаксическом цифровом дисплее и заранее кончик иглы, пока она не достигнет глубины 2,5 миллиметра.Свяжете иглу 0,5 миллиметра на глубину двух миллиметров и медленно ввелите весь 10 микролитровый объем раствора в течение одной минуты. После того, как все ингибитор был доставлен, оставить иглу в мозг еще на минуту, прежде чем снять иглу. Повторите инъекцию во второе отверстие заусенцев, используя транспортное средство только в качестве контроля и закрыть кожу над разрезом.Затем перенесите мышь из стереотаксического аппарата на 37-градусную грелку Цельсия с мониторингом до полного выздоровления. В конце режима дозы закрените мышь на вскрытой площадке. Используйте ножницы и типсы, чтобы сделать боковой разрез через интеграмент и брюшную стенку прямо под грудной клеткой.Тщательно отделить печень от диафрагмы и прорезать диафрагму по всей длине грудной клетки, чтобы разоблачить плевральной полости. Используйте ножницы, чтобы сделать разрез на задний конец левого желудочка и немедленно ввести правую камеру сердца с примерно 15 миллилитров PBS в течение двух минут. Успешная перфузия приведет к изменению цвета печени с красного на бледно-розовый.Когда все PBS был доставлен, perfuse сердце с примерно 10 миллилитров 4%paraformaldehyde в PBS в течение двух минут. После сбора головы, используйте ножницы, чтобы сделать разрез средней линии кожи головы, чтобы разоблачить череп. Поместите один кончик ножниц в foramen magnum, чтобы облегчить создание бокового разреза в черепе к глазу.Сделайте аналогичный разрез на другой стороне черепа, сохраняя конец ножниц как можно более поверхностным и сократить область черепа между глазами и над носом мыши. Используйте типсы, чтобы аккуратно очистить черепные кости от полушарий мозга и использовать шпатель, чтобы поднять мозг. Тщательно вскрыть черепных нервных волокон, которые фиксируют мозг черепа и поместить мозг в пластиковую тарелку.Затем акциз мозжечка и обонятельные луковицы. Чтобы получить участки ткани мозга, сначала исправить мозг в 15 миллилитров трубки заполнены 4%paraformaldehyde в PBS при четырех градусах по Цельсию в одночасье. На следующее утро, промыть ткани мозга по крайней мере три раза в течение пяти минут при четырех градусах по Цельсию в свежем PBS за стирку.После последней стирки снимите переднюю часть каждого полушария ножницами и типсами и поместите образцы в помеченные крио-формы спереди вниз. Погрузите каждую ткань в оптимальную температурную среду резки перед тем, как заморозить образцы жидкого азота в 10-миллиметровой пластиковой чашке Петри при температуре минус 80 градусов по Цельсию. Чтобы определить реактивацию Си, погрузите пять-шесть секций ткани мозга в раствор для поиска антигенов в течение пяти минут на тепловом блоке 100 градусов по Цельсию.В конце инкубации, мыть горки с четырьмя пятиминутными моет при комнатной температуре со свежим PBS за стирку, прежде чем погрузить слайды в блокирующий раствор. После 20 минут при комнатной температуре, мыть горки три раза в течение пяти минут в свежем буфере мытья за стирку. Пятно образцов тканей с соответствующими первичными антителами при четырех градусах цельсия в одночасье.Изображение слайдов на флуоресценции микроскопа регулировки контрастности и яркости, чтобы количественное количество GFP положительных клеток для наркотиков и транспортных средств лечение мыши полушарий мозга. Чтобы продемонстрировать осуществимость не случайной модели инактивации Х-хромосомы мыши для неактивных исследований реактивации Х-хромосомы, генотипы женского трансгенного эмбрионального фибробласта мыши были подтверждены генотипирующей ПЦР и цитометрией потока. По оценке ПЦР, экспрессия GFP помечены метилен CPG связывания белка два гена или MECP2 был активирован наркотиков, но не лечение транспортных средств.Не случайные Х-хромосомы инактивации мыши модели эмбриональных фибробластов также выразил ядерной GFP после наркотиков, но не лечение транспортного средства, демонстрирующие ингибиторы фактора инактивации Х-хромосомы реактивировать инактивированные Х-хромосомы связаны MECP2 в мыши эмбриональных фибробластов. Лекарственное лечение активизирует инактивированную Х-хромосому MECP2-GFP примерно в 30% клеток в полушариях мозга, пропитанных наркотиками, в то время как в полушариях, пропитанных транспортным средством, реактивация не обнаруживается. Microtubule-ассоциированный белок два положительных нейронов также GFP положительный в обработанных препаратом полушариях свидетельствует о инактивированной Х-хромосомы MECP2-GFP выражение.Режим препарата будет зависеть от цели и эффективности малых ингибиторов молекулы так оптимизировать дозу и лечение в пробирке перед тестированием in vivo. Неугадная модель мыши может быть использована для тестирования различных препаратов как индивидуально, так и в комбинации. В самом деле, мы и другие определили несколько наркотических Х-хромосомы инактивации факторов.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Molecular Biology

Genetics

Unit 2

Mendelian Genetics

SCIENTISTS IN ACTION

Conjugative Mating Assays for Sequence-specific Analysis of Transfer Proteins Involved in Bacterial Conjugation

Конъюгативных Спаривание Анализы для последовательности конкретного анализа переноса белков, участвующих в конъюгации бактерий

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia ...

Pooled shRNA Screen for Reactivation of MeCP2 on the Inactive X Chromosome

Обобщённые индуцируемый экран для повторной активации MeCP2 на неактивных Х-хромосома

Forward genetic screens using reporter genes inserted into the heterochromatin have been extensively used to investigate mechanisms of epigenetic control ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

Высок объём идентификации генов регулирования последовательностей с использованием следующего поколения последовательности круговой хромосома конформации захвата (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

Генная инженерия сапротрофные discoideum клетки на основе выбора и роста бактерий

Dictyostelium discoideum is an intriguing model organism for the study of cell differentiation processes during development, cell signaling, and other ...

Mass Spectrometry-Based Proteomics Analyses Using the OpenProt Database to Unveil Novel Proteins Translated from Non-Canonical Open Reading Frames

Масса на основе спектрометрии протеомики анализа с использованием базы данных OpenProt откроет новые белки перевод с неканоническим открытом чтения фреймов

Genome annotation is central to today's proteomic research as it draws the outlines of the proteomic landscape. Traditional models of open reading frame ...

A Robust Polymerase Chain Reaction-based Assay for Quantifying Cytosine-guanine-guanine Trinucleotide Repeats in Fragile X Mental Retardation-1 Gene

Робуст Полимераза Цепная реакция на основе Ассаем для количественной цитозин-гуанин-гуанин тринуклеотид повторяет в хрупкой X умственной отсталости-1 Гена

Fragile X syndrome (FXS) and associated disorders are caused by expansion of the cytosine-guanine-guanine (CGG) trinucleotide repeat in the 5&#8217; ...

A Screening Method for Identification of Heterochromatin-Promoting Drugs Using Drosophila

A Screening Method for Identification of Heterochromatin-Promoting Drugs Using Drosophila

Метод скрининга для выявления гетерохроматина-пропагандирующих наркотиков с использованием дрозофилы

Drosophila is an excellent model organism that can be used to screen compounds that might be useful for cancer therapy. The method described here is a ...

Identification of Enhancer-Promoter Contacts in Embryoid Bodies by Quantitative Chromosome Conformation Capture (4C)

Identification of Enhancer-Promoter Contacts in Embryoid Bodies by Quantitative Chromosome Conformation Capture 4C

Идентификация контактов Enhancer-Promoter в эмбриоидных телах по количественному захвату конформации хромосомы (4C)

During mammalian development, cell fates are determined through the establishment of regulatory networks that define the specificity, timing, and spatial ...

Application of DNA Fingerprinting using the D1S80 Locus in Lab Classes

Application of DNA Fingerprinting using the D1S80 Locus in Lab Classes

Применение ДНК-дактилоскопии с использованием локуса D1S80 в лабораторных классах

In biological sciences, DNA fingerprinting has been widely used for paternity testing, forensic applications and phylogenetic studies. Here, we describe a ...

Investigating the Pathogenesis of MYH7 Mutation Gly823Glu in Familial Hypertrophic Cardiomyopathy using a Mouse Model

Исследование патогенеза мутации MYH7 Gly823Glu при семейной гипертрофической кардиомиопатии с использованием мышиной модели

Familial hypertrophic cardiomyopathy (HCM, OMIM: 613690) is the most common cardiomyopathy in China. However, the underlying genetic etiology of HCM ...