Name: a non-random mouse model for pharmacological reactivation of mecp2 on the inactive x chromosome
Uploaded: 2019-05-22T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Non-random Mouse Model for Pharmacological Reactivation of Mecp2 on the Inactive X Chromosome at JoVE.com

Los autores agradecen a Antonio Bedalov por aportar reactivos; Centro de histología de tejido de la Universidad de Virginia para criseccionamiento; Núcleo de citometría de flujo de la Universidad de Virginia para análisis de citometría de flujo; Christian Blue y Saloni Singh por asistencia técnica con genotipado. Este trabajo fue apoyado por una beca de investigación Double Hoo a Z.Z., y un programa de proyecto piloto otorgado por el Premio de la Universidad de Virginia-Virginia Tech Seed Fund y el Premio de investigación biomédica individual de la Fundación Hartwell a S.B.

El trabajo relacionado con ratones fue aprobado por el Comité institucional de cuidado y uso de animales de la Universidad de Virginia (IACUC; #4112).
1. genere un modelo de ratón XCI no aleatorio con el Mecp2 genéticamente etiquetado en XI
Nota: Las cepas de ratón utilizadas en el estudio fueron las siguientes: MECP2-GFP/MECP2-GFP (MECP2TM 3.1 Bird, tabla de materiales) y Xist/δxist...

<ol>
	<li>Lyon, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-chromosome+inactivation+as+a+system+of+gene+dosage+compensation+to+regulate+gene+expression.">X-chromosome inactivation as a system of gene dosage compensation to regulate gene expression.</a> Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology. 36, 119-130 (1989).</li><li>Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delving+into+the+diversity+of+facultative+heterochromatin:+the+epigenetics+of+the+inactive+X+chromosome.">Delving into the diversity of facultative heterochromatin: the epigenetics of the inactive X chromosome.</a> Current Opinion in Genetics Development. 15 (5), 482-489 (2005).</li><li>Augui, S., Nora, E. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Xist+lncRNA+interacts+directly+with+SHARP+to+silence+transcription+through+HDAC3.">The Xist lncRNA interacts directly with SHARP to silence transcription through HDAC3.</a> Nature. 521 (7551), 232-236 (2015).</li><li>Minajigi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomes.+A+comprehensive+Xist+interactome+reveals+cohesin+repulsion+and+an+RNA-directed+chromosome+conformation.">Chromosomes. A comprehensive Xist interactome reveals cohesin repulsion and an RNA-directed chromosome conformation.</a> Science. 349 (6245), (2015).</li><li>Mira-Bontenbal, H., Gribnau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Xist-Interacting+Proteins+in+X-Chromosome+Inactivation.">New Xist-Interacting Proteins in X-Chromosome Inactivation.</a> Current Biology. 26 (8), R338-R342 (2016).</li><li>Mira-Bontenbal, H., Gribnau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Xist-Interacting+Proteins+in+X-Chromosome+Inactivation.">New Xist-Interacting Proteins in X-Chromosome Inactivation.</a> Curren Biology. 26 (10), 1383 (2016).</li><li>Ridings-Figueroa, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nuclear+matrix+protein+CIZ1+facilitates+localization+of+Xist+RNA+to+the+inactive+X-chromosome+territory.">The nuclear matrix protein CIZ1 facilitates localization of Xist RNA to the inactive X-chromosome territory.</a> Genes and Development. 31 (9), 876-888 (2017).</li><li>Sunwoo, H., Colognori, D., Froberg, J. 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E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rett+syndrome+is+caused+by+mutations+in+X-linked+MECP2,+encoding+methyl-CpG-binding+protein+2.">Rett syndrome is caused by mutations in X-linked MECP2, encoding methyl-CpG-binding protein 2.</a> Nature Genetics. 23 (2), 185-188 (1999).</li><li>Przanowski, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+reactivation+of+inactive+X-linked+Mecp2+in+cerebral+cortical+neurons+of+living+mice.">Pharmacological reactivation of inactive X-linked Mecp2 in cerebral cortical neurons of living mice.</a> Proceedings of Natlional Academy of Sciences of the United States of America. 115 (31), 7991-7996 (2018).</li><li>Borensztein, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xist-dependent+imprinted+X+inactivation+and+the+early+developmental+consequences+of+its+failure.">Xist-dependent imprinted X inactivation and the early developmental consequences of its failure.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 24 (3), 226-233 (2017).</li><li>Jensen, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+histological+staining+and+fluorescence+using+ImageJ.">Quantitative analysis of histological staining and fluorescence using ImageJ.</a> Anatomical Record (Hoboken). 296 (3), 378-381 (2013).</li><li>Cseke, L. J., Talley, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+PCR-based+genotyping+method+to+distinguish+between+wild-type+and+ornamental+varieties+of+Imperata+cylindrica.">A PCR-based genotyping method to distinguish between wild-type and ornamental varieties of Imperata cylindrica.</a> Journal of Visualized Experiments. (60), (2012).</li></ol>

Anteriormente, se identificaron XCIFs que son requeridos selectivamente para el silenciamiento de genes ligados a XI en células femeninas de mamíferos12. Además, optimizamos potentes inhibidores de moléculas pequeñas para apuntar a XCIFs, como ACVR1 y efectores descendentes de PDPK1, que reactivan eficientemente el Mecp2 ligado a XI en líneas celulares de fibroblastos de ratón, neuronas corticales de ratón y una célula de fibroblastos humanos línea derivada de un paciente con RT...

La inactivación del cromosoma x (XCI) es un proceso de compensación de dosis que equilibra la expresión génica ligada al X mediante el silenciamiento de una copia del cromosoma X en las hembras1. Como resultado, el cromosoma X inactivo (XI) acumula rasgos característicos de la heterocromatina, incluyendo la metilación del ADN y las modificaciones de la histona inhibitoria, tales como histona H3-lisina 27 trimetilación (H3K27me3) e histona H2A ubiquitinación (H2Aub) 2. el regulador maestro del silenciamiento cromosómico x es la región centro de inactivación x (XIC), alrededor de 100-500 KB, que controla el conteo y emparejamiento de los cromosomas x, la elección aleatoria del cromosoma x para la inactivación, y la iniciación y propagación del silenciamiento a lo largo del cromosoma X3. El proceso de inactivación X se inicia mediante una transcripción específica X inactiva (Xist) que recubre el XI en CIS para mediar el silenciamiento de todo el cromosoma y la remodelación de la estructura tridimensional del cromosoma X4. Recientemente, varias pantallas proteómicas y genéticas han identificado reguladores adicionales de XCI, como las proteínas de interacción Xist 5,6,7,8,9 , 10 , 11 , 12. por ejemplo, un estudio anterior que utiliza una pantalla de interferencia de ARN no sesgada de todo el genoma identificó 13 factores de XCI de acción Trans(xcifs)12. Mecaniísticamente, XCIFs regula la expresión Xist y, por lo tanto, interferir con la función xcifs causa XCI12defectuoso. En conjunto, los avances recientes en el campo han proporcionado información importante sobre la maquinaria molecular necesaria para iniciar y mantener la XCI.
La identificación de los reguladores de XCI y la comprensión de su mecanismo en XCI es directamente relevante para las enfermedades humanas vinculadas a X, como el síndrome de rett (RTT)13,14. El RTT es un trastorno raro del desarrollo neurológico causado por una mutación heterocigosa en la proteína de unión al metil-CpG 2 ligada al X (MECP2) que afecta predominantemente a las niñas15. Debido a que el MECP2 se encuentra en el cromosoma X, las niñas RTT son heterocigosas para la deficiencia de MECP2 con ~ 50% de células que expresan el tipo salvaje y ~ 50% expresan un mutante MECP2. En particular, las células mutantes RTT albergan una copia inactiva pero de tipo salvaje de Mecp2 en el XI, proporcionando una fuente del gen funcional, que si se reactiva, podría aliviar los síntomas de la enfermedad. Además del RTT, hay varias otras enfermedades humanas vinculadas al X, para las que la reactivación de XI representa un posible enfoque terapéutico, como el síndrome de DDX3X.
La inhibición de XCIFs, proteína de 3-fosfoinositida dependiente quinasa-1 (PDPK1), y Activin un receptor tipo 1 (ACVR1), ya sea por el ARN corto del pelo (shRNA) o inhibidores de moléculas pequeñas, reactiva los genes XI-vinculados12. La reactivación farmacológica de genes XI-ligados se observa en varios modelos ex vivo que incluyen líneas celulares de fibroblastos de ratón, neuronas corticales de ratones adultos, fibroblastos embrionarios de ratón y líneas celulares de fibroblastos derivadas de un paciente RTT12. Sin embargo, queda por demostrar si la reactivación farmacológica de los genes vinculados con XI es factible in vivo. Un factor limitante es la falta de modelos animales efectivos para medir con precisión la expresión de los genes de la reactivada XI. Hacia este objetivo, se ha generado un Xistδ: MECP2/Xist: modelo de ratón MECP2-GFP que lleva un MECP2 genéticamente etiquetado en XI en todas las células debido a la deleción Heterocigosa en Xist en el cromosoma X materno16. Usando este modelo, la expresión de Mecp2 de XI se ha cuantitado después del tratamiento con inhibidores de xcifs en el cerebro de los ratones vivos. Aquí se describe la generación de xistδ: MECP2/Xist: modelo de ratón MECP2-GFP y metodología para la reactivación de cuantificar XI en neuronas corticales utilizando ensayos basados en inmunofluorescencia.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >MICE</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mecp2tm3.1Bird</td>
			<td >The Jackson Laboratory</td>
			<td>#014610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >B6;129-Xist (tm5Sado)</td>
			<td>provided by Antonio Bedalov, Fred Hutchinson Cancer Center, Seattle</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >REAGENTS</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >22x22 mm coverslip</td>
			<td >FISHERfinest (Fisher Scientific)</td>
			<td >125488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >32% Paraformaldehyde</td>
			<td >Electron Microscopy Sciences</td>
			<td >15714-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >50 ml syringe</td>
			<td>Medline Industries</td>
			<td>NPMJD50LZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >60mm culture dish</td>
			<td >CellStar</td>
			<td >628160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >7-AAD </td>
			<td >BioLegend</td>
			<td >420403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ammonium chloride (NH4Cl)</td>
			<td >Fisher Chemical</td>
			<td >A661-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >anti-GFP-AlexaFluor647</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td >A-31852</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >anti-MAP2</td>
			<td >Aves Labs</td>
			<td >MAP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >BSA</td>
			<td >Promega</td>
			<td >R396D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Buprenorphine SR</td>
			<td >Zoopharm</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >citric acid </td>
			<td >Sigma</td>
			<td >C-1857</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DMSO</td>
			<td >Fisher Bioreagents</td>
			<td >BP231-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td >Corning Cellgro</td>
			<td >10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethanol</td>
			<td >Decon Labs</td>
			<td >2701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td >VWR Life Science</td>
			<td>89510-198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >gelatin</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >G9391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >glass slides</td>
			<td >Fisherbrand</td>
			<td >22-034-486</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >goat anti-chicken FITC-labeled secondary antibody </td>
			<td >Aves Labs</td>
			<td >F-1005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >GSK650394</td>
			<td >ApexBio</td>
			<td >B1051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >hamilton 10&#956;l syringe </td>
			<td >Hamilton Sigma-Aldrich</td>
			<td >28615-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >14025-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ketamine</td>
			<td>Ketaset</td>
			<td>NDC 0856-2013-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Large blunt/blunt curved scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14519-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >LDN193189</td>
			<td >Cayman Chemicals</td>
			<td >11802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >lodixanol</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >1343517</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >magnesium chloride (MgCl2)</td>
			<td >Fisher Chemical</td>
			<td >M35-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Methylcelulose</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >M0262-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >mounting medium with DAPI </td>
			<td >Vectashield</td>
			<td >H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Needle tip, 26 GA x 1.25&#34;</td>
			<td >PrecisionGlide</td>
			<td >305111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ophthalmic ointment </td>
			<td >Refresh Lacri-Lube</td>
			<td >93468</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >optimal cutting temperature (O.C.T.) </td>
			<td >ThermoFisher</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PCR mix</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep)</td>
			<td >Corning</td>
			<td >30-002-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Phosphate buffered saline pH 7.4 (PBS)</td>
			<td >Corning Cellgro</td>
			<td >46-103-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Potassium chloride (KCl)</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >P330-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >scalpel blades</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Shallow glass or plastic tray</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >skin glue/tissue adhesive</td>
			<td >3M Vetbond</td>
			<td >1469SB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >sodium azide</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >CAS 26628-22-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td >Fisher Chemical</td>
			<td >S642-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >standard hemostat forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>13013-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Standard tweezers</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11027-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Straight iris scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14058-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >sucrose</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >BP220-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tris-base</td>
			<td >Fisher Bioreagents</td>
			<td >BP152-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Triton X-100</td>
			<td >Fisher Bioreagents</td>
			<td >BP151-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypsin-EDTA </td>
			<td >Gibco</td>
			<td >15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Xylazine</td>
			<td >Akorn</td>
			<td>NDC: 59399-111-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EQUIPMENT</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Zeiss AxioObserver Live-Cell microscope </td>
			<td >Zeiss</td>
			<td >Zeiss AxioObserver</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.45mm burr</td>
			<td >IDEAL MicroDrill</td>
			<td >67-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >BD FACScalibur</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >centrifuge</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >glass homogenizer</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >cell culture incubator</td>
			<td >Thermo Scientific HERACELL VIOS 160i</td>
			<td >13-998-213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Leica 3050S research cryostat </td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >stereotactic platform </td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >thermocycler</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Timer</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ultracentrifuge</td>
			<td >Beckman Coulter Optima L-100 XP</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Water bath (37 &#186;C)</td>
			<td >Fisher Scientific Isotemp 2239</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a non-random mouse model for pharmacological reactivation of mecp2 on the inactive x chromosome

La inactivación del cromosoma x (XCI) es el silenciamiento aleatorio de un cromosoma X en las hembras para lograr el equilibrio de dosis genéticas entre los sexos. Como resultado, todas las hembras son heterocigósas para la expresión génica ligada al X. Uno de los reguladores clave de XCI es Xist, que es esencial para el inicio y mantenimiento de XCI. Estudios previos han identificado 13 factores de inactivación cromosómica de acción trans (XCIFs) que utilizan una pantalla genética de pérdida de función a gran escala. La inhibición de XCIFs, como ACVR1 y PDPK1, mediante el uso de ARN de horquilla corta o de inhibidores de moléculas pequeñas, reactiva los genes relacionados con los cromosomas X en las células cultivadas. Pero la viabilidad y tolerabilidad de reactivar el cromosoma X inactivo in vivo queda por determinar. Hacia este objetivo, se ha generado un modelo de ratón Xistδ: MECP2/Xist: MECP2-GFP con XCI no aleatorio debido a la eliminación de Xist en un cromosoma X. Usando este modelo, la extensión de la reactivación X inactiva fue cuantitada en el cerebro del ratón después del tratamiento con inhibidores de XCIF. Los resultados publicados recientemente muestran, por primera vez, que la inhibición farmacológica de XCIFs reactiva el Mecp2 del cromosoma X inactivo en las neuronas corticales del cerebro viviente del ratón.

Para demostrar la viabilidad del modelo de ratón Xistδ: MECP2/Xist: MECP2-GFP para estudios de reactivación XI, se probó la reactivación por inhibidor de xcif del Mecp2-GFP de XI ligado en fibroblastos embrionarios de ratones (MEFS). Las MEFs femeninas se aislaron del día 15,5 Xistδ: MECP2/Xist: embriones de MECP2-GFP como se describe en la sección 3 (figura 1A). Los genotipos de la hembra Xistδ: MECP2/Xist: los MEFS de MECP2-GFP</e...

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A Non-random Mouse Model for Pharmacological Reactivation of Mecp2 on the Inactive X Chromosome

Aquí describimos un protocolo para generar un modelo murino femenino viable con inactivación cromosómica no aleatoria, es decir, el cromosoma X de herencia maternalmente está inactivo en el 100% de las células. También describimos un protocolo para probar la viabilidad, la tolerabilidad y la seguridad de la reactivación farmacológica del cromosoma X inactivo in vivo.

Un modelo de ratón no aleatorio para la reactivación farmacológica de Mecp2 en el cromosoma X inactivo

X chromosome inactivation (XCI) is the random silencing of one X chromosome in females to achieve gene dosage balance between the sexes. As a result, all ...

Este protocolo se puede utilizar para generar un modelo de ratón no aleatorio para probar y cuantificar la reactivación del cromosoma Mecp2 vinculado al X inactivo en el cerebro de un ratón vivo. Este modelo se puede modificar fácilmente para estudiar la reactivación de Xi en otros modelos de enfermedades ligadas al X como el síndrome DDX3X. Soy un post doc en el laboratorio de Sanchita Bhatnagar y voy a demostrar el procedimiento con Zeming Zheng.Comience colocando el ratón anestesiado en una plataforma estereotáctica con los incisivos enganchados en la barra de mordida del limitador de hocico. Apriete la abrazadera de la nariz mientras mantiene la cabeza del ratón en un plano nivelado. Ajuste la altura de las barras de los oídos para llegar a la parte caudal del canal auditivo para mantener la cabeza inmovilizada.A continuación, desinfecte la cabeza con toallitas alternas de un antiséptico tópico y 70%etanol. Cuando el ratón esté listo, usa un bisturí estéril para hacer una incisión horizontal de 0,75 centímetros en el cuero cabelludo medio. Utilice una rebaba de 0,45 milímetros para perforar dos agujeros simétricos por encima de los hemisferios cortical derecho e izquierdo a dos milímetros de la sutura sagital y la sutura lambdoid en el centro aproximado del hueso parietal.Conecte firmemente una jeringa de 10 microlitros a la plataforma estereotáctica y cargue 10 microlitros de inhibidor químico recién preparado en la jeringa. Avance la aguja en el primer orificio de rebaba mientras mantiene la aguja perpendicular al cráneo. Cuando la aguja atraviesa el cráneo, saque a cero las coordenadas de la pantalla digital estereotáctica y avance la punta de la aguja hasta que alcance una profundidad de 2,5 milímetros.Retirar la aguja de 0,5 milímetros a una profundidad de dos milímetros e inyectar lentamente todo el volumen de 10 microlitros de la solución durante un período de un minuto. Después de que se haya suministrado todo el inhibidor, deje la aguja en el cerebro durante otro minuto antes de retirar la aguja. Repita la inyección en el segundo orificio de la rebaba utilizando el vehículo sólo como control y cierre la piel sobre la incisión.A continuación, transfiera el ratón desde el aparato estereotáctico a una almohadilla de calefacción Celsius de 37 grados con monitoreo hasta la recuperación completa. Al final del régimen de dosis, fije el ratón en una almohadilla de disección. Use tijeras y fórceps para hacer una incisión lateral a través del integumento y la pared abdominal justo debajo de la caja torácica.Separe cuidadosamente el hígado del diafragma y corte a través del diafragma a lo largo de toda la longitud de la caja torácica para exponer la cavidad pleural. Utilice las tijeras para hacer una incisión en el extremo posterior del ventrículo izquierdo e inyecte inmediatamente la cámara cardíaca derecha con aproximadamente 15 mililitros de PBS durante un período de dos minutos. Una perfusión exitosa resultará en un cambio de color hepático de rojo a rosa pálido.Cuando se haya suministrado todo el PBS, perfunda el corazón con aproximadamente 10 mililitros de 4%paraformaldehído en PBS durante dos minutos. Después de cosechar la cabeza, usa tijeras para hacer una incisión de línea media en el cuero cabelludo para exponer el cráneo. Coloque una punta de las tijeras en el foramen magnum para facilitar la creación de una incisión lateral en el cráneo hacia el ojo.Haga una incisión similar en el otro lado del cráneo manteniendo el extremo de las tijeras lo más superficial posible y corte la región del cráneo entre los ojos y por encima de la nariz del ratón. Usa fórceps para pelar suavemente los huesos craneales de los hemisferios cerebrales y usa una espátula para elevar el cerebro. Disecciona cuidadosamente las fibras del nervio craneal que fijan el cerebro al cráneo y coloca el cerebro en un plato de plástico.A continuación, extirpar el cerebelo y bulbos olfativos. Para obtener secciones del tejido cerebral, primero fije el cerebro en un tubo de 15 mililitros lleno de 4%paraformaldehído en PBS a cuatro grados Celsius durante la noche. A la mañana siguiente, enjuague el tejido cerebral al menos tres veces durante cinco minutos a cuatro grados centígrados en PBS fresco por lavado.Después del último lavado, retire la parte frontal de cada hemisferio con tijeras y fórceps y coloque las muestras en criomoldeos etiquetados hacia abajo. Sumerja cada tejido en un medio de temperatura de corte óptimo antes de congelar las muestras en nitrógeno líquido en una placa Petri de plástico de 10 milímetros para un almacenamiento de menos 80 grados Centígrados. Para determinar la reactivación de Xi, sumerja secciones de tejido cerebral de cinco a seis micrómetros en la solución de recuperación de antígenos durante cinco minutos en un bloque de calor de 100 grados Celsius.Al final de la incubación, lave los portaobjetos con cuatro lavados de cinco minutos a temperatura ambiente con PBS fresco por lavado antes de sumergir los portaobjetos en solución de bloqueo. Después de 20 minutos a temperatura ambiente, lave los portaobjetos tres veces durante cinco minutos en un tampón de lavado fresco por lavado. Mancha las muestras de tejido con los anticuerpos primarios apropiados a cuatro grados Celsius durante la noche.Imagine las diapositivas en un microscopio de fluorescencia ajustando el contraste y el brillo para permitir la cuantificación del número de células positivas de la GFP para los hemisferios cerebrales de ratón tratados con fármacos y vehículos. Para demostrar la viabilidad del modelo de ratón de inactivación cromosómica X no aleatorio para estudios inactivos de reactivación del cromosoma X, los genotipos del fibroblasto embrionario de ratón transgénico femenino se confirmaron mediante la genotipado de PCR y la citometría de flujo. Según lo evaluado por pcR, la expresión de la GFP etiquetada proteína de unión a CPG de metileno dos genes o MECP2 se reactivó mediante fármaco, pero no por tratamiento vehiculo.Los fibroblastos embrionarios no aleatorios del cromosoma X también expresaron la GFP nuclear después del tratamiento farmacológico, pero no el tratamiento del vehículo que demuestra que los inhibidores del factor de inactivación del cromosoma X X reactivan el MECP2 vinculado al cromosoma X inactivado en fibroblastos embrionarios de ratón. El tratamiento farmacológico reactiva el cromosoma X MECP2-GFP en aproximadamente el 30% de las células de los hemisferios cerebrales infundidos con fármacos, mientras que no se detecta ninguna reactivación en los hemisferios infundidos de vehículos. La proteína asociada al microtúbulo dos neuronas positivas también son positivas de la GFP en los hemisferios tratados con fármacos indicativos de la expresión MECP2-GFP del cromosoma X inactivado.El régimen farmacológico dependerá del objetivo y de la eficacia de los inhibidores de moléculas pequeñas, optimizando así la dosis y el tratamiento in vitro antes de realizar la prueba in vivo. El modelo de ratón no aleatorio se puede utilizar para probar diferentes medicamentos ya sea individualmente o en combinación. De hecho, nosotros y otros hemos identificado varios factores de inactivación cromosómica X farmacológica.

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