Name: a non-random mouse model for pharmacological reactivation of mecp2 on the inactive x chromosome
Uploaded: 2019-05-22T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Non-random Mouse Model for Pharmacological Reactivation of Mecp2 on the Inactive X Chromosome at JoVE.com

Yazarlar, reaktifler sağlamak için Antonio Bedalov teşekkür ederiz; Virginia Üniversitesi doku histolojisi çekirdek kriyobölümleme için; Akış sitometri analizi için Virginia Üniversitesi akış sitometri çekirdeği; Christian Blue ve Saloni Singh, genotyping ile teknik yardım için. Bu çalışma Z.Z. için bir Double Hoo araştırma Grant ve Virginia-Virginia teknoloji tohum fonu Ödülü ve Hartwell Vakfı bireysel Biyomedikal Araştırma Ödülü Üniversitesi 'nden bir pilot proje programı Ödülü tarafından destekleniyordu SB

Fareler ile ilgili çalışmalar Virginia Üniversitesi Kurumsal hayvan bakımı ve kullanım Komitesi (ıayuc; #4112) tarafından onaylanmıştır.
1. bir non-Random XCı fare modeli ile genetik etiketli Mecp2 XI oluşturmak
Not: Çalışmada kullanılan fare suşları aşağıdaki gibidir: Mecp2-Gfp/Mecp2-Gfp (Mecp2TM 3.1 kuş, malzeme tablosu) ve Xist/δxist (B6; 129-Xist < tm5Sado...

<ol>
	<li>Lyon, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-chromosome+inactivation+as+a+system+of+gene+dosage+compensation+to+regulate+gene+expression.">X-chromosome inactivation as a system of gene dosage compensation to regulate gene expression.</a> Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology. 36, 119-130 (1989).</li><li>Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delving+into+the+diversity+of+facultative+heterochromatin:+the+epigenetics+of+the+inactive+X+chromosome.">Delving into the diversity of facultative heterochromatin: the epigenetics of the inactive X chromosome.</a> Current Opinion in Genetics Development. 15 (5), 482-489 (2005).</li><li>Augui, S., Nora, E. P., Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+X-chromosome+inactivation+by+the+X-inactivation+centre.">Regulation of X-chromosome inactivation by the X-inactivation centre.</a> Nature Review Genetics. 12 (6), 429-442 (2011).</li><li>Pontier, D. B., Gribnau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xist+regulation+and+function+explored.">Xist regulation and function explored.</a> Human Genetics. 130 (2), 223-236 (2011).</li><li>Barnes, C., Kanhere, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+RNA-Protein+Interactions+Through+In+Vitro+RNA+Pull-Down+Assays.">Identification of RNA-Protein Interactions Through In Vitro RNA Pull-Down Assays.</a> Methods in Molecular Biology. 1480, 99-113 (2016).</li><li>McHugh, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Xist+lncRNA+interacts+directly+with+SHARP+to+silence+transcription+through+HDAC3.">The Xist lncRNA interacts directly with SHARP to silence transcription through HDAC3.</a> Nature. 521 (7551), 232-236 (2015).</li><li>Minajigi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomes.+A+comprehensive+Xist+interactome+reveals+cohesin+repulsion+and+an+RNA-directed+chromosome+conformation.">Chromosomes. A comprehensive Xist interactome reveals cohesin repulsion and an RNA-directed chromosome conformation.</a> Science. 349 (6245), (2015).</li><li>Mira-Bontenbal, H., Gribnau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Xist-Interacting+Proteins+in+X-Chromosome+Inactivation.">New Xist-Interacting Proteins in X-Chromosome Inactivation.</a> Current Biology. 26 (8), R338-R342 (2016).</li><li>Mira-Bontenbal, H., Gribnau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Xist-Interacting+Proteins+in+X-Chromosome+Inactivation.">New Xist-Interacting Proteins in X-Chromosome Inactivation.</a> Curren Biology. 26 (10), 1383 (2016).</li><li>Ridings-Figueroa, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nuclear+matrix+protein+CIZ1+facilitates+localization+of+Xist+RNA+to+the+inactive+X-chromosome+territory.">The nuclear matrix protein CIZ1 facilitates localization of Xist RNA to the inactive X-chromosome territory.</a> Genes and Development. 31 (9), 876-888 (2017).</li><li>Sunwoo, H., Colognori, D., Froberg, J. E., Jeon, Y., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repeat+E+anchors+Xist+RNA+to+the+inactive+X+chromosomal+compartment+through+CDKN1A-interacting+protein+(CIZ1).">Repeat E anchors Xist RNA to the inactive X chromosomal compartment through CDKN1A-interacting protein (CIZ1).</a> Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. , (2017).</li><li>Bhatnagar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+pharmacological+reactivation+of+the+mammalian+inactive+X+chromosome.">Genetic and pharmacological reactivation of the mammalian inactive X chromosome.</a> Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (35), 12591-12598 (2014).</li><li>Zoghbi, H. Y., Percy, A. K., Schultz, R. J., Fill, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+X+chromosome+inactivation+in+the+Rett+syndrome.">Patterns of X chromosome inactivation in the Rett syndrome.</a> Brain Development. 12 (1), 131-135 (1990).</li><li>Anvret, M., Wahlstrom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rett+syndrome:+random+X+chromosome+inactivation.">Rett syndrome: random X chromosome inactivation.</a> Clinical Genetics. 45 (5), 274-275 (1994).</li><li>Amir, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rett+syndrome+is+caused+by+mutations+in+X-linked+MECP2,+encoding+methyl-CpG-binding+protein+2.">Rett syndrome is caused by mutations in X-linked MECP2, encoding methyl-CpG-binding protein 2.</a> Nature Genetics. 23 (2), 185-188 (1999).</li><li>Przanowski, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+reactivation+of+inactive+X-linked+Mecp2+in+cerebral+cortical+neurons+of+living+mice.">Pharmacological reactivation of inactive X-linked Mecp2 in cerebral cortical neurons of living mice.</a> Proceedings of Natlional Academy of Sciences of the United States of America. 115 (31), 7991-7996 (2018).</li><li>Borensztein, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xist-dependent+imprinted+X+inactivation+and+the+early+developmental+consequences+of+its+failure.">Xist-dependent imprinted X inactivation and the early developmental consequences of its failure.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 24 (3), 226-233 (2017).</li><li>Jensen, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+histological+staining+and+fluorescence+using+ImageJ.">Quantitative analysis of histological staining and fluorescence using ImageJ.</a> Anatomical Record (Hoboken). 296 (3), 378-381 (2013).</li><li>Cseke, L. J., Talley, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+PCR-based+genotyping+method+to+distinguish+between+wild-type+and+ornamental+varieties+of+Imperata+cylindrica.">A PCR-based genotyping method to distinguish between wild-type and ornamental varieties of Imperata cylindrica.</a> Journal of Visualized Experiments. (60), (2012).</li></ol>

Daha önce, memeliler kadın hücrelerinde XI bağlantılı genlerin susturulması için seçici olarak gerekli olan Xcıs12tespit edildi. Biz daha fazla güçlü küçük molekül inhibitörleri hedef xcıgs, ACVR1 ve PDPK1, hangi verimli Xi-bağlantılı Mecp2 fare fibroblast hücre hatları, fare kortikal nöronlar ve insan fibroblast hücre yeniden akış efektörlere gibi optimize bir RTT hasta türetilmiştir. Bu sonuçlar, XI reaktivasyonunun X bağlantılı hastalık hastalarında...

X kromozom inaktivasyonu (XCI) doz telafisi bir süreçtir x-bağlantılı gen ifadesi dişilerde x kromozom bir kopyasını susturarak dengeler1. Sonuç olarak, aktif olmayan X kromozom (Xi), histon H3-lizin 27 trimetilasyon (H3K27me3) ve histon H2A mayası (H2Aub) gibi DNA metilasyonu ve inhibitör histon modifikasyonları dahil heterokromatin karakteristik özelliklerini birikir 2. x kromozom susturulması Master regülatörü, x kromozomların sayım ve eşleştirme, inactivation için x kromozom rasgele seçimi ve başlama ve başlatma kontrolleri 100 − 500 KB civarında, xınactivation Merkezi (KIC) bölgedir X kromozom3boyunca susturma yayılması. X inaktivasyonu süreci, x kromozom4' ün üç boyutlu yapısını yeniden modellemek ve kromozom çapında susturulması için BDT 'de bulunan XI 'e özel transkript (xıst) tarafından başlatılır. Son zamanlarda, çeşitli proteomik ve genetik ekranlar XCI ek regülatörler tespit etti, gibi x-ist etkileşim proteinleri5,6,7,8,9 , 10 ' dan fazla , 11 ' i , 12. Örneğin, tarafsız genom çapında RNA parazit ekranı kullanan bir önceki çalışmada 13 Trans-hareket XCI faktörü (xcıs)12tespit edilmiştir. Mekanik olarak, Xcıs Xıst ifadesini düzenler ve bu nedenle xcıfs işlevine müdahale etmek arızalı XCI12' ye neden olur. Birlikte, alanda son gelişmeler XCı başlatmak ve korumak için gerekli olan moleküler makine içine önemli Öngörüler sağladı.
XCI regülatörlerinin tanımlanması ve XCI 'daki mekanizmalarını anlamak Rett sendromu (RTT)13,14gibi X bağlantılı insan hastalıkları ile doğrudan ilgilidir. RTT, X-bağlantılı metil-CPG bağlayıcı protein 2 ' de bir heterozigot mutasyon nedeniyle nadir görülen bir nörogelişimsel hastalıktır (MECP2), ağırlıklı olarak kızları etkileyen15. MECP2 X kromozom üzerinde yer aldığından, RTT kızlar MECP2 eksikliği için heterozigot vardır ~ 50% vahşi tipi ifade hücreleri ve ~ 50% mutant MECP2ifade. Özellikle, RTT mutant hücreler bir uyuyan ama Wild-türü kopyası Mecp2 XI, fonksiyonel geni bir kaynak sağlayarak, hangi reaktive, potansiyel olarak hastalığın belirtileri hafifletmek olabilir. RTT ek olarak, Xi 'nin yeniden aktivasyonu DDX3X sendromu gibi potansiyel bir terapötik yaklaşımın temsil ettiği diğer birçok X bağlantılı insan hastalıkları vardır.
Xcıfs inhibisyonu, 3-fosfoinositide bağımlı protein kinaz-1 (PDPK1), ve aktivin bir reseptör tipi 1 (ACVR1), kısa saç iğnesi RNA (shrna) veya küçük molekül inhibitörleri tarafından, XI bağlı genler reaktive12. XI bağlantılı genlerin farmakolojik reaktivasyonu, fare fibroblast hücre hatları, Yetişkin fare kortikal nöronlar, fare embriyonik fibroblastlar ve bir RTT hastadan elde edilen fibroblast hücre hatları içeren çeşitli ex vivo modellerde görülür12. Ancak, XI bağlantılı genlerin farmakolojik yeniden aktivasyonuna uygun olup olmadığını gösterilecektir. Bir sınırlama faktörü doğru yeniden XI genlerin ifade ölçmek için etkili hayvan modellerinin eksikliği. Bu hedefe doğru, bir xistδ: Mecp2/Xist: Mecp2-Gfp fare modeli, maternal X kromozom16üzerinde Xist heterozigot silme nedeniyle tüm hücreler XI üzerinde bir genetik etiketli Mecp2 taşır üretilir. Bu modeli kullanarak, XI Mecp2 ifadesi, canlı farelerin beyinde Xcıfs inhibitörleri ile tedavi sonrasında quantitite edilmiştir. Burada, Xistδ: Mecp2/Xist: Mecp2-Gfp fare modeli ve metodolojisi nımofluorescence tabanlı asder kullanarak kortikal nöronlar üzerinde Niceye reaktivasyonu ile tanımlanmıştır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >MICE</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mecp2tm3.1Bird</td>
			<td >The Jackson Laboratory</td>
			<td>#014610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >B6;129-Xist (tm5Sado)</td>
			<td>provided by Antonio Bedalov, Fred Hutchinson Cancer Center, Seattle</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >REAGENTS</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >22x22 mm coverslip</td>
			<td >FISHERfinest (Fisher Scientific)</td>
			<td >125488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >32% Paraformaldehyde</td>
			<td >Electron Microscopy Sciences</td>
			<td >15714-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >50 ml syringe</td>
			<td>Medline Industries</td>
			<td>NPMJD50LZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >60mm culture dish</td>
			<td >CellStar</td>
			<td >628160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >7-AAD </td>
			<td >BioLegend</td>
			<td >420403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ammonium chloride (NH4Cl)</td>
			<td >Fisher Chemical</td>
			<td >A661-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >anti-GFP-AlexaFluor647</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td >A-31852</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >anti-MAP2</td>
			<td >Aves Labs</td>
			<td >MAP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >BSA</td>
			<td >Promega</td>
			<td >R396D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Buprenorphine SR</td>
			<td >Zoopharm</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >citric acid </td>
			<td >Sigma</td>
			<td >C-1857</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DMSO</td>
			<td >Fisher Bioreagents</td>
			<td >BP231-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td >Corning Cellgro</td>
			<td >10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethanol</td>
			<td >Decon Labs</td>
			<td >2701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td >VWR Life Science</td>
			<td>89510-198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >gelatin</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >G9391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >glass slides</td>
			<td >Fisherbrand</td>
			<td >22-034-486</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >goat anti-chicken FITC-labeled secondary antibody </td>
			<td >Aves Labs</td>
			<td >F-1005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >GSK650394</td>
			<td >ApexBio</td>
			<td >B1051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >hamilton 10&#956;l syringe </td>
			<td >Hamilton Sigma-Aldrich</td>
			<td >28615-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >14025-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ketamine</td>
			<td>Ketaset</td>
			<td>NDC 0856-2013-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Large blunt/blunt curved scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14519-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >LDN193189</td>
			<td >Cayman Chemicals</td>
			<td >11802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >lodixanol</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >1343517</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >magnesium chloride (MgCl2)</td>
			<td >Fisher Chemical</td>
			<td >M35-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Methylcelulose</td>
			<td >Sigma</td>
			<td >M0262-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >mounting medium with DAPI </td>
			<td >Vectashield</td>
			<td >H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Needle tip, 26 GA x 1.25&#34;</td>
			<td >PrecisionGlide</td>
			<td >305111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ophthalmic ointment </td>
			<td >Refresh Lacri-Lube</td>
			<td >93468</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >optimal cutting temperature (O.C.T.) </td>
			<td >ThermoFisher</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PCR mix</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep)</td>
			<td >Corning</td>
			<td >30-002-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Phosphate buffered saline pH 7.4 (PBS)</td>
			<td >Corning Cellgro</td>
			<td >46-103-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Potassium chloride (KCl)</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >P330-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >scalpel blades</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Shallow glass or plastic tray</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >skin glue/tissue adhesive</td>
			<td >3M Vetbond</td>
			<td >1469SB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >sodium azide</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >CAS 26628-22-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td >Fisher Chemical</td>
			<td >S642-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >standard hemostat forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>13013-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Standard tweezers</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11027-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Straight iris scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14058-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >sucrose</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >BP220-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tris-base</td>
			<td >Fisher Bioreagents</td>
			<td >BP152-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Triton X-100</td>
			<td >Fisher Bioreagents</td>
			<td >BP151-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypsin-EDTA </td>
			<td >Gibco</td>
			<td >15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Xylazine</td>
			<td >Akorn</td>
			<td>NDC: 59399-111-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EQUIPMENT</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Zeiss AxioObserver Live-Cell microscope </td>
			<td >Zeiss</td>
			<td >Zeiss AxioObserver</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >0.45mm burr</td>
			<td >IDEAL MicroDrill</td>
			<td >67-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >BD FACScalibur</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >centrifuge</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >glass homogenizer</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >cell culture incubator</td>
			<td >Thermo Scientific HERACELL VIOS 160i</td>
			<td >13-998-213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Leica 3050S research cryostat </td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >stereotactic platform </td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >thermocycler</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Timer</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ultracentrifuge</td>
			<td >Beckman Coulter Optima L-100 XP</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Water bath (37 &#186;C)</td>
			<td >Fisher Scientific Isotemp 2239</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a non-random mouse model for pharmacological reactivation of mecp2 on the inactive x chromosome

X kromozom inaktivasyonu (XCI) cinsiyeler arasında gen dozaj dengesi elde etmek için kadınlarda bir X kromozom rasgele susturulması olduğunu. Sonuç olarak, tüm kadınlar X bağlantılı gen ifadesi için heterozigot vardır. XCı 'nın anahtar düzenleyicilerinin biri, XCı 'nın başlatılması ve bakımı için gerekli olan Xist'dir. Önceki çalışmalar, büyük ölçekli, fonksiyon kaybı genetik ekranı kullanarak 13 Trans hareket X kromozom inaktivasyon faktörünü (Xcıs) tespit etmiştir. ACVR1 ve PDPK1 gibi Xcıs 'Ler, kısa saç pim RNA veya küçük molekül inhibitörleri kullanarak inhibisyonu, kültürlü hücrelerde X kromozom bağlantılı genleri yeniden etkinleştirir. Ancak Pasif X kromozom in vivo olarak yeniden aktive edilebilirliğinin fizibilite ve tolerabilitesi belirlenecek. Bu hedefe doğru, bir Xistδ: Mecp2/Xist: Mecp2-Gfp fare modeli bir X kromozom üzerinde Xist silinmesi nedeniyle olmayan rasgele XCI ile üretilir. Bu modeli kullanarak, aktif X reaktivasyonu ölçüde XCıF inhibitörleri ile tedavi sonrasında fare beyin quantite oldu. Son zamanlarda yayımlanan sonuçları göstermek, ilk kez, Xcıfs farmakolojik inhibisyonu canlı fare beynin kortikal nöronlar içinde aktif X kromozom Mecp2 yeniden etkinleştirir.

Xistδ fizibilitesi göstermek için : Mecp2/Xıst: XI reaktivasyon çalışmaları için Mecp2-Gfp fare modeli, XI bağlantılı Mecp2-Gfp xcıf inhibitörü-aracılı reaktivasyonu fare embriyonik fibroblastlar (MEFS) test edildi. Kadın MEFs gün 15,5 Xistδ: Mecp2/Xıst: Mecp2-Gfp embriyolar Bölüm 3 ' te açıklandığı gibi izole edildi (Şekil 1a). Dişi Xistδ: Mecp2/Xist: Mecp2-Gfp MEFS 'in genotipleri, daha önce<sup class="...

Watch this Scientific Journal Video about A Non-random Mouse Model for Pharmacological Reactivation of Mecp2 on the Inactive X Chromosome at JoVE.com

A Non-random Mouse Model for Pharmacological Reactivation of Mecp2 on the Inactive X Chromosome

Burada, rastgele olmayan X kromozom inactivation ile uygulanabilir bir kadın duvar modeli oluşturmak için bir protokol tarif, yani, maternally miras X kromozom hücrelerde% 100 ' de aktif değildir. Ayrıca, pasif X kromozom in vivo farmakolojik reaktivasyonunun fizibilite, tolerabilite ve güvenliğini test etmek için bir protokol açıklanmaktadır.

Pasif X kromozom üzerinde Mecp2 farmakolojik yeniden aktivasyonu için rasgele olmayan bir fare modeli

X chromosome inactivation (XCI) is the random silencing of one X chromosome in females to achieve gene dosage balance between the sexes. As a result, all ...

Bu protokol, canlı bir farenin beynindeki aktif olmayan X'e bağlı Mecp2 kromozomunun yeniden aktivasyonunu test etmek ve ölçmek için rastgele olmayan bir fare modeli oluşturmak için kullanılabilir. Bu model kolayca DDX3X sendromu gibi diğer X-bağlantılı hastalık modellerinde Xi reaktivasyon çalışma için değiştirilebilir. Ben Sanchita Bhatnagar laboratuvarında bir post doc ve Ben Zeming Zheng ile prosedür gösteren olacak.Anestezili fareyi, beyin koruyucunun ısırık çubuğuna bağlanmış kesicilerle stereotaktik bir platformda konumlandırarak başlayın. Farenin kafasını düz bir düzlemde tutarken burun kıskacını sıkın. Kulak çubuklarının yüksekliğini ayarlayarak kulak kanalının kaudal kısmına ulaşarak başı hareketsiz tutun.Sonra bir topikal antiseptik ve% 70 etanol alternatif mendilleri ile baş dezenfekte. Fare hazır olduğunda, orta kafa derisi 0.75 santimetre yatay kesi yapmak için steril bir neşter kullanın. Sağ ve sol kortikal hemisferlerin iki milimetre üzerinde sagittal sütür ve parietal kemiğin yaklaşık ortasında lambdoid sütür iki milimetre üzerinde iki simetrik delik açmak için 0,45 milimetrelik bir çapak kullanın.Stereotaktik platforma 10 mikrolitrelik bir şırınga takın ve 10 mikrolitre taze hazırlanmış kimyasal inhibitörü şırınganın içine yükleyin. İğneyi kafatasına dik tutarken iğneyi ilk çapak deliğine doğru ilerletin. İğne kafatasından geçtiğinde, stereotaktik dijital ekrandaki koordinatları sıfırlayın ve 2,5 milimetre derinliğe ulaşana kadar iğnenin ucunu ilerletin.İğneyi 0,5 milimetreden iki milimetre derinliğe çekin ve çözeltinin 10 mikrolitrelik hacminin tamamını bir dakika boyunca yavaşça enjekte edin. Tüm inhibitör teslim edildikten sonra, iğneçekmeden önce bir dakika daha beyne iğne bırakın. Sadece bir kontrol olarak araç kullanarak ikinci çapak deliğe enjeksiyon tekrarlayın ve kesi üzerinde cilt kapatın.Daha sonra fareyi stereotaktik cihazdan tam iyileşmeye kadar izleyerek 37 derece lik bir ısıtma yastığına aktarın. Doz rejiminin sonunda, fareyi bir diseksiyon pedi üzerinde sabitleyin. Göğüs kafesinin hemen altındaki integument ve karın duvarından lateral bir kesi yapmak için makas ve forceps kullanın.Dikkatle diyafram karaciğer ayırmak ve plevral kavite ortaya çıkarmak için göğüs kafesi tüm uzunluğu boyunca diyafram ile kesti. Sol ventrikül arka ucunda bir kesi yapmak için makas kullanın ve hemen iki dakikalık bir süre içinde PBS yaklaşık 15 mililitre ile sağ kalp odası enjekte. Başarılı bir perfüzyon soluk pembe kırmızı bir karaciğer renk değişikliği neden olacaktır.Tüm PBS teslim edildiğinde, iki dakika içinde PBS%4 paraformaldehit yaklaşık 10 mililitre ile kalp perfuse. Baş hasat sonra, kafatası ortaya çıkarmak için kafa derisi bir orta hat kesi yapmak için makas kullanın. Göze doğru kafatasında yanal bir kesi oluşumunu kolaylaştırmak için foramen magnum içine makas bir ucunu yerleştirin.Kafatasının diğer tarafında mümkün olduğunca yüzeysel olarak makas ucunu tutarak benzer bir kesi yapmak ve göz ve farenin burun üzerinde kafatası nın bölge kesti. Nazikçe beyin hemisferinden kafatası kemikleri soymak ve beyin yükseltmek için bir spatula kullanmak için forceps kullanın. Dikkatle kafatası için beyin düzeltmek ve plastik bir çanak içine beyin yerleştirin kranial sinir lifleri incelemek.Sonra beyincik ve koku ampulleri çıkarmak. Beyin dokusunun bölümlerini elde etmek için, ilk bir gecede dört derece santigrat pbs% 4 paraformaldehit dolu bir 15 mililitretüp beyin düzeltmek. Ertesi sabah, beyin dokusunu en az üç kez beş dakika boyunca dört santigrat derecede yıkayın başına taze PBS'de durulayın.Son yıkamadan sonra, makas ve forceps ile her yarımkürenin ön kaldırın ve aşağı etiketli kriyo-kalıplar içine örnekleri yerleştirin. Eksi 80 santigrat depolama için 10 milimetrelik plastik Petri kabında sıvı nitrojen numuneleri dondurma önce optimum kesme sıcaklığı orta her doku batırın. Xi reaktivasyon belirlemek için, 100 derece santigrat ısı bloğu beş dakika boyunca antijen alma çözeltisi beş ila altı mikrometre beyin dokusu bölümleri batırın.Kuluçka sonunda, slaytları bloklama çözeltisi içine batırmadan önce oda sıcaklığında dört beş dakikalık yıkama ile yıkama başına taze PBS ile yıkayın. Oda sıcaklığında 20 dakika sonra, yıkama başına taze yıkama tampon beş dakika slaytlar üç kez yıkayın. Doku örneklerini bir gecede uygun primer antikorlarla dört dereceye kadar lekeleyin.Kontrast ve parlaklığı ayarlayarak hem ilaç hem de araç la tedavi edilen fare beyin yarıküreleri için GFP pozitif hücrelerinin sayısının ölçülmesine olanak sağlayacak bir floresan mikroskop üzerindeki slaytları görüntüleyin. İnaktif X kromozomu reaktivasyonu çalışmaları için rastgele olmayan X kromozomu inaktivasyon fare modelinin fizibilitesini göstermek için, kadın transgenik fare embriyonik fibroblastın genotipleri pcr ve akış sitometrisi ile doğrulandı. PCR tarafından değerlendirildiği gibi, GFP etiketli metilen CPG bağlayıcı protein iki gen veya MECP2 ifadesi ilaç ile yeniden aktive edildi, ancak araç tedavisi değil.Rastgele olmayan X kromozomu inaktivasyon fare modeli embriyonik fibroblastlar da ilaç sonra nükleer GFP ifade ama x kromozominin inaktivasyon faktörü inhibitörleri gösteren araç tedavi fare embriyonik fibroblastlarda inaktive X kromozomu bağlantılı MECP2 reaktive. İlaç tedavisi, ilaç infüzyonlu beyin yarımküredeki hücrelerin yaklaşık %30'unda inaktive X kromozomu MECP2-GFP'yi yeniden etkinleştirirken, araç aşılı hemisferlerde reaktivasyon saptanır. Mikrotübül ilişkili protein iki pozitif nöron da inaktive X kromozomu MECP2-GFP ekspresyonunun göstergesi olarak ilaç tedavi edilen hemisferlerde GFP pozitiftir.İlaç rejimi hedef ve küçük molekül inhibitörleri etkinliğine bağlı olacak böylece in vivo test etmeden önce doz ve tedavi in vitro optimize. Rastgele olmayan fare modeli, farklı ilaçları tek tek veya birlikte test etmek için kullanılabilir. Aslında, biz ve diğerleri birkaç druggable X kromozomu inaktivasyon faktörleri tespit ettik.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Molecular Biology

Genetics

Unit 2

Mendelian Genetics

SCIENTISTS IN ACTION

Conjugative Mating Assays for Sequence-specific Analysis of Transfer Proteins Involved in Bacterial Conjugation

Bakteriyel Konjugasyon ilgilendim Transferi Proteinlerin Dizi özgü Analiz konjugatif Çiftleşme Tahliller

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia ...

Pooled shRNA Screen for Reactivation of MeCP2 on the Inactive X Chromosome

Havuza alınan shRNA MeCP2 reaktivasyonu üzerinde etkin olmayan X kromozomu için ekran

Forward genetic screens using reporter genes inserted into the heterochromatin have been extensively used to investigate mechanisms of epigenetic control ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

Gen düzenleyici dizileri dairesel kromozom Conformation yeni nesil sıralama kullanarak yüksek üretilen iş tanımlaması yakalama (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

Genetik Mühendisliği hücreleri Dictyostelium discoideum alan seçimi ve bakteri büyüme

Dictyostelium discoideum is an intriguing model organism for the study of cell differentiation processes during development, cell signaling, and other ...

Mass Spectrometry-Based Proteomics Analyses Using the OpenProt Database to Unveil Novel Proteins Translated from Non-Canonical Open Reading Frames

Kütle spektrometresi tabanlı proteomik analizleri roman proteinler açıklayacak OpenProt veritabanı kullanarak kanonik olmayan açık okuma çerçevesi tercüme

Genome annotation is central to today's proteomic research as it draws the outlines of the proteomic landscape. Traditional models of open reading frame ...

A Robust Polymerase Chain Reaction-based Assay for Quantifying Cytosine-guanine-guanine Trinucleotide Repeats in Fragile X Mental Retardation-1 Gene

Kırılgan X Mental Retardasyon-1 Genininde Sitozin-guanin-guanin Trinükleotid Tekrarlarının Ölçülmesi için Sağlam Polimeraz Zincir Reaksiyonu Esaslı Bir Test

Fragile X syndrome (FXS) and associated disorders are caused by expansion of the cytosine-guanine-guanine (CGG) trinucleotide repeat in the 5&#8217; ...

A Screening Method for Identification of Heterochromatin-Promoting Drugs Using Drosophila

A Screening Method for Identification of Heterochromatin-Promoting Drugs Using Drosophila

Drosophila Kullanan Heterokromatin-Teşvik Edici İlaçların Tanımlanması nda Bir Tarama Yöntemi

Drosophila is an excellent model organism that can be used to screen compounds that might be useful for cancer therapy. The method described here is a ...

Identification of Enhancer-Promoter Contacts in Embryoid Bodies by Quantitative Chromosome Conformation Capture (4C)

Identification of Enhancer-Promoter Contacts in Embryoid Bodies by Quantitative Chromosome Conformation Capture 4C

Kantitatif Kromozom Konformasyon Yakalama (4C) ile Embriyoid Cisimlerde Arttırıcı-Organizatör Kontalarının Belirlenmesi

During mammalian development, cell fates are determined through the establishment of regulatory networks that define the specificity, timing, and spatial ...

Application of DNA Fingerprinting using the D1S80 Locus in Lab Classes

Application of DNA Fingerprinting using the D1S80 Locus in Lab Classes

Laboratuvar Sınıflarında D1S80 Locus Kullanılarak DNA Parmak İzi Uygulaması

In biological sciences, DNA fingerprinting has been widely used for paternity testing, forensic applications and phylogenetic studies. Here, we describe a ...

Investigating the Pathogenesis of MYH7 Mutation Gly823Glu in Familial Hypertrophic Cardiomyopathy using a Mouse Model

Ailesel Hipertrofik Kardiyomiyopatide MYH7 Mutasyonu Gly823Glu'nun Patogenezinin Bir Fare Modeli Kullanılarak İncelenmesi

Familial hypertrophic cardiomyopathy (HCM, OMIM: 613690) is the most common cardiomyopathy in China. However, the underlying genetic etiology of HCM ...