Name: a colorimetric assay of citrate synthase activity in drosophila melanogaster
Uploaded: 2020-01-16T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Colorimetric Assay of Citrate Synthase Activity in Drosophila Melanogaster at JoVE.com

Ce travail a été soutenu par les subventions de la National Natural Science Foundation of China (31401013 et 31471010), de la Science and Technology Commission of Shanghai Municipality, du Shanghai Pujiang Program (14PJ1405900) et de la Natural Science Foundation of Shanghai (19ZR1446400).

1. Colorimétrique Citrate Synthase Activity Assay pour D. melanogaster16
<ol><li>Recueillir dix mouches adultes pour chaque échantillon. Recueillir au moins des échantillons tripler pour chaque génotype.</li>
	<li>Préparer 500 l de tampon d'extraction à froid contenant 20 mM HEPES (pH à 7,2), 1 mM EDTA et 0,1 % de triton X-100 dans un tube à essai de 1,5 mL pour chaque échantillon.</li>
	<li>Anesthésier les mouches adultes avec du CO2 sur un coussin et isoler les ti...

<ol>
	<li>Yee, C., Yang, W., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intrinsic+apoptosis+pathway+mediates+the+pro-longevity+response+to+mitochondrial+ROS+in+C.+elegans.">The intrinsic apoptosis pathway mediates the pro-longevity response to mitochondrial ROS in C. elegans.</a> Cell. 157 (4), 897-909 (2014).</li><li>Sarasija, S., Norman, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gamma-Secretase+Independent+Role+for+Presenilin+in+Calcium+Homeostasis+Impacts+Mitochondrial+Function+and+Morphology+in+Caenorhabditis+elegans.">A gamma-Secretase Independent Role for Presenilin in Calcium Homeostasis Impacts Mitochondrial Function and Morphology in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 201 (4), 1453-1466 (2015).</li><li>Oxenoid, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architecture+of+the+mitochondrial+calcium+uniporter.">Architecture of the mitochondrial calcium uniporter.</a> Nature. 533 (7602), 269-273 (2016).</li><li>Hekimi, S., Wang, Y., Noe, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+ROS+and+the+Effectors+of+the+Intrinsic+Apoptotic+Pathway+in+Aging+Cells:+The+Discerning+Killers!.">Mitochondrial ROS and the Effectors of the Intrinsic Apoptotic Pathway in Aging Cells: The Discerning Killers!.</a> Frontiers in Genetics. 7, 161 (2016).</li><li>Kim, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+Biosynthesis+Coordinates+a+Mitochondrial-to-Cytosolic+Stress+Response.">Lipid Biosynthesis Coordinates a Mitochondrial-to-Cytosolic Stress Response.</a> Cell. 166 (6), 1539-1552 (2016).</li><li>Wang, Y., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+and+longevity+in+animals:+Untangling+the+knot.">Mitochondrial dysfunction and longevity in animals: Untangling the knot.</a> Science. 350 (6265), 1204-1207 (2015).</li><li>Ray, A., Martinez, B. A., Berkowitz, L. A., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction,+oxidative+stress,+and+neurodegeneration+elicited+by+a+bacterial+metabolite+in+a+C.+elegans+Parkinson's+model.">Mitochondrial dysfunction, oxidative stress, and neurodegeneration elicited by a bacterial metabolite in a C. elegans Parkinson's model.</a> Cell Death &amp; Disease. 5, e984 (2014).</li><li>Tronstad, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+and+quantification+of+cellular+mitochondrial+morphology+and+content.">Regulation and quantification of cellular mitochondrial morphology and content.</a> Current Pharmaceutical Design. 20 (35), 5634-5652 (2014).</li><li>Wiegand, G., Remington, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Citrate+synthase:+structure,+control,+and+mechanism.">Citrate synthase: structure, control, and mechanism.</a> Annual Review of Biophysics and Biophysical Chemistry. 15, 97-117 (1986).</li><li>Lopez-Lluch, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calorie+restriction+induces+mitochondrial+biogenesis+and+bioenergetic+efficiency.">Calorie restriction induces mitochondrial biogenesis and bioenergetic efficiency.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (6), 1768-1773 (2006).</li><li>MacInnis, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superior+mitochondrial+adaptations+in+human+skeletal+muscle+after+interval+compared+to+continuous+single-leg+cycling+matched+for+total+work.">Superior mitochondrial adaptations in human skeletal muscle after interval compared to continuous single-leg cycling matched for total work.</a> Journal of Physiology. 595 (9), 2955-2968 (2017).</li><li>Gillen, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Twelve+Weeks+of+Sprint+Interval+Training+Improves+Indices+of+Cardiometabolic+Health+Similar+to+Traditional+Endurance+Training+despite+a+Five-Fold+Lower+Exercise+Volume+and+Time+Commitment.">Twelve Weeks of Sprint Interval Training Improves Indices of Cardiometabolic Health Similar to Traditional Endurance Training despite a Five-Fold Lower Exercise Volume and Time Commitment.</a> PLoS One. 11 (4), e0154075 (2016).</li><li>Mukherjee, S., Basar, M. A., Davis, C., Duttaroy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+functional+similarities+and+divergences+between+Drosophila+Spargel/dPGC-1+and+mammalian+PGC-1+protein.">Emerging functional similarities and divergences between Drosophila Spargel/dPGC-1 and mammalian PGC-1 protein.</a> Frontiers in Genetics. 5, 216 (2014).</li><li>Mukherjee, S., Duttaroy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spargel/dPGC-1+is+a+new+downstream+effector+in+the+insulin-TOR+signaling+pathway+in+Drosophila.">Spargel/dPGC-1 is a new downstream effector in the insulin-TOR signaling pathway in Drosophila.</a> Genetics. 195 (2), 433-441 (2013).</li><li>Diop, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PGC-1/Spargel+Counteracts+High-Fat-Diet-Induced+Obesity+and+Cardiac+Lipotoxicity+Downstream+of+TOR+and+Brummer+ATGL+Lipase.">PGC-1/Spargel Counteracts High-Fat-Diet-Induced Obesity and Cardiac Lipotoxicity Downstream of TOR and Brummer ATGL Lipase.</a> Cell Reports. 10 (9), 1572-1584 (2015).</li><li>Rera, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+longevity+and+tissue+homeostasis+by+the+Drosophila+PGC-1+homolog.">Modulation of longevity and tissue homeostasis by the Drosophila PGC-1 homolog.</a> Cell Metabolism. 14 (5), 623-634 (2011).</li><li>Wei, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNF34+modulates+the+mitochondrial+biogenesis+and+exercise+capacity+in+muscle+and+lipid+metabolism+through+ubiquitination+of+PGC-1+in+Drosophila.">RNF34 modulates the mitochondrial biogenesis and exercise capacity in muscle and lipid metabolism through ubiquitination of PGC-1 in Drosophila.</a> Acta Biochimica et Biophysica Sinica (Shanghai). 50 (10), 1038-1046 (2018).</li><li>Tennessen, J. M., Barry, W. E., Cox, J., Thummel, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+studying+metabolism+in+Drosophila.">Methods for studying metabolism in Drosophila.</a> Methods. 68 (1), 105-115 (2014).</li><li>Bosco, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+oxygen+concentration+and+pressure+on+Drosophila+melanogaster:+oxidative+stress,+mitochondrial+activity,+and+survivorship.">Effects of oxygen concentration and pressure on Drosophila melanogaster: oxidative stress, mitochondrial activity, and survivorship.</a> Archives of Insect Biochemistry and Physiology. 88 (4), 222-234 (2015).</li></ol>

Les études métaboliques utilisant Drosophila comme modèle doivent prendre en considération le fond génétique, l'alimentation, et l'entretien de stock des mouches18. Afin d'éviter les effets de différents milieux génétiques sur la mesure de l'activité de la synthase du citrate, différentes souches de Drosophila doivent être rétrocroisées à la souche témoin pendant 10 générations. Le fond génétique de toutes les souches de Drosophila utilisées dans no...

Les mitochondries sont surtout connues comme les organites producteurs d'énergie dans la plupart des organismes eucaryotes, qui produisent la monnaie de l'énergie, l'ATP, à travers le cycle de l'acide tricarboxylique (c.-à-d. le cycle Debs) et la phosphorylation oxydative. Les mitochondries jouent également un rôle important dans un grand nombre d'autres processus physiologiques, tels que la régulation de l'apoptose1, Ca2 ' homéostasie2,3, espèces d'oxydation réactive (ROS) génération4, et réticulum endoplasmique (ER)-réponse au stress5. Le dysfonctionnement mitochondrial peut affecter n'importe quel organe dans le corps à n'importe quel âge et est une cause primaire des maladies métaboliques, liées au vieillissement6,et neurodegenerative7. Les mitochondries intactes sont mécanistes liées à la fonction mitochondriale. Ainsi, la quantification appropriée de la masse mitochondriale intacte est très importante pour évaluer la fonction mitochondriale8. La synthase de citrate, une enzyme de limitation de taux dans la première étape du cycle d'acide tricarboxylique9,est localisée dans la matrice mitochondriale dans les cellules eucaryotes, et peut ainsi être employée comme marqueur quantitatif pour la présence de la masse mitochondriale intacte9,10. L'activité de synthase de citrate peut également être employée comme facteur de normalisation pour les protéines mitochondriales intactes11,12.
La mouche des fruits, Drosophila melanogaster, est un excellent système modèle pour l'étude de la fonction mitochondriale, comme de nombreuses molécules et les voies qui jouent des rôles pivots dans les mitochondries sont évolutivement conservés de Drosophila à l'homme13,14,15. Ici, nous présentons un protocole pour une méthode rapide et simple pour la mesure de l'activité de synthase de citrate par un test colorimétrique dans le tissu de Drosophila homogénéise16 dans un format de plaque de puits 96. Dans l'analyse de l'activité de synthase de citrate, la synthase de citrate dans le tissu de Drosophila homogénéise catalyse la réaction de l'oxaloacetate avec la coenzyme acétyle A (acétyl CoA) pour former le citrate CoA-SH etH. CoA-SH réagit par la suite avec 5,5'-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid) (DTNB) pour générer un produit coloré, 2-nitro-5-thiobenzoate (TNB), qui peut être facilement mesuré spectrophotometrically à 412 nm. L'activité de synthase de citrate peut être reflétée par le taux de production de couleur.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid (HEPES)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V900477</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (TRIZMA Base)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V900483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetyl-CoA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithio-bis-nitrobenzoic acid (DTNB)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V900106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxaloacetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O4126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pellet pestle</td>
			<td>Sangon</td>
			<td>F619072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pellet pestle motor</td>
			<td>Tiangen</td>
			<td>OSE-Y10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>Eon</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein BCA Assay kit</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>P0010S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>WPI</td>
			<td>14124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sangon</td>
			<td>A110694-0100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a colorimetric assay of citrate synthase activity in drosophila melanogaster

Les mitochondries jouent les rôles les plus importants dans le métabolisme cellulaire en produisant de l'ATP par phosphorylation oxydative et en régulant une variété de processus physiologiques. Le dysfonctionnement mitochondrial est une cause primaire d'un certain nombre de maladies métaboliques et neurodégénératives. Les mitochondries intactes sont essentielles à leur bon fonctionnement. La synthase de citrate d'enzyme est localisée dans la matrice mitochondriale et peut ainsi être employée comme marqueur quantitatif d'enzyme de la masse mitochondriale intacte. Étant donné que de nombreuses molécules et voies qui ont des fonctions importantes dans les mitochondries sont fortement conservés entre les humains et Drosophila, et qu'un éventail d'outils génétiques puissants sont disponibles dans Drosophila, Drosophila sert de bon système modèle pour l'étude de la fonction mitochondriale. Ici, nous présentons un protocole pour la mesure rapide et simple de l'activité de synthase de citrate dans l'homogénéisation de tissu des mouches adultes sans isoler des mitochondries. Ce protocole convient également à la mesure de l'activité de synthase de citrate dans les larves, les cellules cultivées et les tissus mammifères.

La figure 1 présente un exemple des courbes cinétiques de l'absorption de l'OD à 412 nm au fil du temps obtenue s'appuyant sur l'analyse colorimétrique de l'activité de synthase de citrate pour mesurer les homogénéités du tissu thorax Drosophila de différents génotypes. Il est bien connu que PGC-1 est un régulateur principal de la biogenèse mitochondriale. PgC-1 est fonctionnellement conservé entre la drosophile et l'homme. ...

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A Colorimetric Assay of Citrate Synthase Activity in Drosophila Melanogaster

Nous présentons un protocole pour un test colorimétrique de l'activité de synthase de citrate pour la quantification de la masse mitochondriale intacte dans les homogénéités de tissu de Drosophila.

Une description colorimétrique de l'activité de Synthase Citrate dans Drosophila Melanogaster

Mitochondria play the most prominent roles in cellular metabolism by producing ATP through oxidative phosphorylation and regulating a variety of ...

Drosophila sert de bon système modèle pour l’étude de la fonction mitochondriale. Ici nous présentons un protocole pour mesurer l’activité de synthase de citrate dans l’homogénéité de tissu des mouches adultes. Ce protocole ne nécessite pas l’isolement des mitochondries.Il est rapide et simple et il convient pour mesurer l’activité de synthase de citrate dans les larves, les cellules de culture, et les tissus mammifères. Commencez par recueillir des mouches adultes pour chaque échantillon, en vous assurant de recueillir au moins des échantillons de triplicate pour chaque génotype. Préparez 500 microlitres de tampon d’extraction glacé avec HEPES de 20 millimlaires, EDTA millimolaire et X-100 triton de 0,1 % dans un tube à essai de 1,5 millilitre pour chaque échantillon.Anesthésier les mouches adultes avec du dioxyde de carbone sur un tampon d’anesthésie. Pour isoler les thoraxes, fixez-les avec une paire de forceps et isolez les abdomens de mouche en coupant le long de la frontière du thorax et de l’abdomen avec une paire de ciseaux. Recueillir les thoraxes de mouche pour le test d’activité synthase citrate.Transférez immédiatement 10 thoraxes adultes à 100 microlitres de tampon d’extraction glacée et homogénéisez-les avec un pilon sur la glace. Gardez les échantillons au froid en homogénéisant pendant cinq à dix secondes sur la glace, en les laissant reposer sur la glace pendant cinq secondes, puis en répétant jusqu’à ce que tous les tissus soient complètement homogénéisés. Aliquot 10 microlitres de chaque échantillon homogénéisé dans un nouveau tube pour la mesure de la teneur en protéines, en gardant ces tubes sur la glace ainsi.Ajouter 400 microlitres de tampon d’extraction glacée à chaque échantillon restant pour un volume total de 500 microlitres et pipette de haut en bas doucement pour mélanger. Pour chaque réaction, ajouter un microlitre de lysate cellulaire dilué à 150 microlitres de la solution de réaction fraîchement préparée. Bien mélanger en pipetting doucement, en s’assurant d’éviter la formation de bulles, puis utilisez un lecteur de plaque pour mesurer l’absorption à 412 nanomètres toutes les 10 à 30 secondes pendant quatre minutes à 25 degrés Celsius.Tracez les données comme absorbance au fil du temps, puis calculez la pente pour la partie linéaire de la courbe. Enfin, divisez le taux de réaction ou la pente par la concentration de protéines de l’échantillon pour normaliser l’activité de synthase du citrate. On a émis l’hypothèse que le renversement de dRNF34 dans le muscle de Drosophila augmenterait l’activité mitochondrique de synthase de citrate tandis que le knockdown de dPGC-1 renverserait cette augmentation.Un taux enzymatique linéaire initial a été établi pour chaque analyse; les pentes des lignes de tendance représentent les taux de réaction maximaux qui sont équivalents aux activités maximales de synthase de citrate des différents génotypes. Les activités maximales de synthase de citrate ont été calculées à partir des courbes cinétiques et normalisées par concentration de protéines. Les résultats ont démontré que l’activité de synthase des thoraxes de mouche a en effet augmenté avec le knockdown de dRNF34 muscle-spécifique et l’augmentation a été renversée par le knockdown de dPGC-1 muscle-spécifique.Lors de l’homogénéisation de l’échantillon, il est important de faire pencher le tube et de vérifier l’homogénéité pour s’assurer qu’il n’y a pas de caillots et que les tissus dans le tube sont complètement homogénéisés. Après la collecte de l’échantillon, tous les traitements de l’échantillon doivent être effectués sur la glace. L’analyse d’activité de synthase de citrate est employée pour quantifier la masse mitochondrique intacte.La quantification appropriée de la masse mitochondrique intacte est très importante pour évaluer la fonction mitochondrique.

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