Name: a colorimetric assay of citrate synthase activity in drosophila melanogaster
Uploaded: 2020-01-16T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Colorimetric Assay of Citrate Synthase Activity in Drosophila Melanogaster at JoVE.com

Diese Arbeit wurde durch die Stipendien der National Natural Science Foundation of China (31401013 und 31471010), der Wissenschafts- und Technologiekommission der Shanghai Municipality, shanghai Pujiang Program (14PJ1405900) und der Natural Science Foundation of Shanghai (19ZR1446400).

1. Colorimetric Citrat Synthase Activity Assay für D. melanogaster16
<ol><li>Sammeln Sie zehn erwachsene Fliegen für jede Probe. Sammeln Sie mindestens dreifache Proben für jeden Genotyp.</li>
	<li>Bereiten Sie 500 l eiskalten Extraktionspuffer mit 20 mM HEPES (pH = 7,2), 1 mM EDTA und 0,1% Triton X-100 in einem 1,5 ml Reagenzglas für jede Probe vor.</li>
	<li>Anästhesisieren Sie erwachsene Fliegen mit CO2 auf einem Anästhesiepad und isolieren Sie die gewünschten Geweb...

<ol>
	<li>Yee, C., Yang, W., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intrinsic+apoptosis+pathway+mediates+the+pro-longevity+response+to+mitochondrial+ROS+in+C.+elegans.">The intrinsic apoptosis pathway mediates the pro-longevity response to mitochondrial ROS in C. elegans.</a> Cell. 157 (4), 897-909 (2014).</li><li>Sarasija, S., Norman, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gamma-Secretase+Independent+Role+for+Presenilin+in+Calcium+Homeostasis+Impacts+Mitochondrial+Function+and+Morphology+in+Caenorhabditis+elegans.">A gamma-Secretase Independent Role for Presenilin in Calcium Homeostasis Impacts Mitochondrial Function and Morphology in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 201 (4), 1453-1466 (2015).</li><li>Oxenoid, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architecture+of+the+mitochondrial+calcium+uniporter.">Architecture of the mitochondrial calcium uniporter.</a> Nature. 533 (7602), 269-273 (2016).</li><li>Hekimi, S., Wang, Y., Noe, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+ROS+and+the+Effectors+of+the+Intrinsic+Apoptotic+Pathway+in+Aging+Cells:+The+Discerning+Killers!.">Mitochondrial ROS and the Effectors of the Intrinsic Apoptotic Pathway in Aging Cells: The Discerning Killers!.</a> Frontiers in Genetics. 7, 161 (2016).</li><li>Kim, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+Biosynthesis+Coordinates+a+Mitochondrial-to-Cytosolic+Stress+Response.">Lipid Biosynthesis Coordinates a Mitochondrial-to-Cytosolic Stress Response.</a> Cell. 166 (6), 1539-1552 (2016).</li><li>Wang, Y., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+and+longevity+in+animals:+Untangling+the+knot.">Mitochondrial dysfunction and longevity in animals: Untangling the knot.</a> Science. 350 (6265), 1204-1207 (2015).</li><li>Ray, A., Martinez, B. A., Berkowitz, L. A., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction,+oxidative+stress,+and+neurodegeneration+elicited+by+a+bacterial+metabolite+in+a+C.+elegans+Parkinson's+model.">Mitochondrial dysfunction, oxidative stress, and neurodegeneration elicited by a bacterial metabolite in a C. elegans Parkinson's model.</a> Cell Death &amp; Disease. 5, e984 (2014).</li><li>Tronstad, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+and+quantification+of+cellular+mitochondrial+morphology+and+content.">Regulation and quantification of cellular mitochondrial morphology and content.</a> Current Pharmaceutical Design. 20 (35), 5634-5652 (2014).</li><li>Wiegand, G., Remington, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Citrate+synthase:+structure,+control,+and+mechanism.">Citrate synthase: structure, control, and mechanism.</a> Annual Review of Biophysics and Biophysical Chemistry. 15, 97-117 (1986).</li><li>Lopez-Lluch, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calorie+restriction+induces+mitochondrial+biogenesis+and+bioenergetic+efficiency.">Calorie restriction induces mitochondrial biogenesis and bioenergetic efficiency.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (6), 1768-1773 (2006).</li><li>MacInnis, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superior+mitochondrial+adaptations+in+human+skeletal+muscle+after+interval+compared+to+continuous+single-leg+cycling+matched+for+total+work.">Superior mitochondrial adaptations in human skeletal muscle after interval compared to continuous single-leg cycling matched for total work.</a> Journal of Physiology. 595 (9), 2955-2968 (2017).</li><li>Gillen, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Twelve+Weeks+of+Sprint+Interval+Training+Improves+Indices+of+Cardiometabolic+Health+Similar+to+Traditional+Endurance+Training+despite+a+Five-Fold+Lower+Exercise+Volume+and+Time+Commitment.">Twelve Weeks of Sprint Interval Training Improves Indices of Cardiometabolic Health Similar to Traditional Endurance Training despite a Five-Fold Lower Exercise Volume and Time Commitment.</a> PLoS One. 11 (4), e0154075 (2016).</li><li>Mukherjee, S., Basar, M. A., Davis, C., Duttaroy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+functional+similarities+and+divergences+between+Drosophila+Spargel/dPGC-1+and+mammalian+PGC-1+protein.">Emerging functional similarities and divergences between Drosophila Spargel/dPGC-1 and mammalian PGC-1 protein.</a> Frontiers in Genetics. 5, 216 (2014).</li><li>Mukherjee, S., Duttaroy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spargel/dPGC-1+is+a+new+downstream+effector+in+the+insulin-TOR+signaling+pathway+in+Drosophila.">Spargel/dPGC-1 is a new downstream effector in the insulin-TOR signaling pathway in Drosophila.</a> Genetics. 195 (2), 433-441 (2013).</li><li>Diop, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PGC-1/Spargel+Counteracts+High-Fat-Diet-Induced+Obesity+and+Cardiac+Lipotoxicity+Downstream+of+TOR+and+Brummer+ATGL+Lipase.">PGC-1/Spargel Counteracts High-Fat-Diet-Induced Obesity and Cardiac Lipotoxicity Downstream of TOR and Brummer ATGL Lipase.</a> Cell Reports. 10 (9), 1572-1584 (2015).</li><li>Rera, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+longevity+and+tissue+homeostasis+by+the+Drosophila+PGC-1+homolog.">Modulation of longevity and tissue homeostasis by the Drosophila PGC-1 homolog.</a> Cell Metabolism. 14 (5), 623-634 (2011).</li><li>Wei, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNF34+modulates+the+mitochondrial+biogenesis+and+exercise+capacity+in+muscle+and+lipid+metabolism+through+ubiquitination+of+PGC-1+in+Drosophila.">RNF34 modulates the mitochondrial biogenesis and exercise capacity in muscle and lipid metabolism through ubiquitination of PGC-1 in Drosophila.</a> Acta Biochimica et Biophysica Sinica (Shanghai). 50 (10), 1038-1046 (2018).</li><li>Tennessen, J. M., Barry, W. E., Cox, J., Thummel, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+studying+metabolism+in+Drosophila.">Methods for studying metabolism in Drosophila.</a> Methods. 68 (1), 105-115 (2014).</li><li>Bosco, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+oxygen+concentration+and+pressure+on+Drosophila+melanogaster:+oxidative+stress,+mitochondrial+activity,+and+survivorship.">Effects of oxygen concentration and pressure on Drosophila melanogaster: oxidative stress, mitochondrial activity, and survivorship.</a> Archives of Insect Biochemistry and Physiology. 88 (4), 222-234 (2015).</li></ol>

Metabolische Studien mit Drosophila als Modell müssen den genetischen Hintergrund, die Ernährung und die Bestandspflege der Fliegen berücksichtigen18. Um die Auswirkungen unterschiedlicher genetischer Hintergründe auf die Messung der Citrat-Synthase-Aktivität zu vermeiden, sollten verschiedene Stämme von Drosophila für 10 Generationen auf den Kontrollstamm zurückgekreuzt werden. Der genetische Hintergrund aller Drosophila-Stämme, die in unseren Experimenten verw...

Mitochondrien sind am besten bekannt als die kraftproduzierenden Organellen in den meisten eukaryotischen Organismen, die die Energiewährung ATP durch den Tricarbonsäurezyklus (d.h. Krebs-Zyklus) und oxidative Phosphorylierung produzieren. Mitochondrien werden auch gefunden, um wichtige Rollen in vielen anderen physiologischen Prozessen zu spielen, wie Regulierung der Apoptose1, Ca2+ Homöostase2,3, reaktive Oxidation Spezies (ROS) Generation4, und endoplasmisches Retikulum (ER)-Stress-Antwort5. Mitochondriale Dysfunktion kann jedes Organ im Körper in jedem Alter beeinflussen und ist eine primäre Ursache für metabolische, Alterungs-bedingte6, und neurodegenerative Erkrankungen7. Intakte Mitochondrien sind mechanistisch mit der mitochondrialen Funktion verwandt. Daher ist eine korrekte Quantifizierung der intakten mitochondrialen Masse sehr wichtig für die Bewertung der mitochondrialen Funktion8. Citrat-Synthase, ein ratenbegrenzendes Enzym im ersten Schritt des Tricarbonsäurezyklus9, ist in der mitochondrialen Matrix innerhalb eukaryotischer Zellen lokalisiert und kann daher als quantitativer Marker für das Vorhandensein intakter mitochondrialer Masse9,10verwendet werden. Citrat-Synthase-Aktivität kann auch als Normalisierungsfaktor für intakte mitochondriale Proteine11,12verwendet werden.
Die Fruchtfliege, Drosophila melanogaster, ist ein ausgezeichnetes Modellsystem für das Studium der mitochondrialen Funktion, da viele Moleküle und Wege, die eine zentrale Rolle in Mitochondrien spielen, evolutionär von Drosophila bis zum Menschen konserviert werden13,14,15. Hier stellen wir ein Protokoll zur schnellen und einfachen Methode zur Messung der Citrat-Synthase-Aktivität durch einen kolorimetrischen Assay in Drosophila-Gewebehomogenaten 16 in einem 96-Well-Platten-Format vor. Im Citrat-Synthase-Aktivitätstest katalysiert Citrat-Synthase in Drosophila-Gewebehomogenat die Reaktion von Oxaloacetat mit Acetylcoenzym A (Acetyl CoA) zu dem Citrat CoA-SH und H+. CoA-SH reagiert anschließend mit 5,5'-Dithiobis-(2-Nitrobenzoesäure) (DTNB) und erzeugt ein farbiges Produkt, 2-Nitro-5-Thiobenzoat (TNB), das bei 412 nm spektrophotometrisch leicht gemessen werden kann. Die Citrat-Synthase-Aktivität kann durch die Rate der Farbproduktion widergespiegelt werden.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid (HEPES)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V900477</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (TRIZMA Base)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V900483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetyl-CoA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithio-bis-nitrobenzoic acid (DTNB)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V900106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxaloacetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O4126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pellet pestle</td>
			<td>Sangon</td>
			<td>F619072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pellet pestle motor</td>
			<td>Tiangen</td>
			<td>OSE-Y10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>Eon</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein BCA Assay kit</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>P0010S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>WPI</td>
			<td>14124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sangon</td>
			<td>A110694-0100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a colorimetric assay of citrate synthase activity in drosophila melanogaster

Mitochondrien spielen die wichtigste Rolle im Zellstoffwechsel, indem sie ATP durch oxidative Phosphorylierung produzieren und eine Vielzahl von physiologischen Prozessen regulieren. Mitochondriale Dysfunktion ist eine primäre Ursache für eine Reihe von metabolischen und neurodegenerativen Erkrankungen. Intakte Mitochondrien sind entscheidend für ihr ordnungsgemäßes Funktionieren. Das Enzym Citratsynthase ist in der mitochondrialen Matrix lokalisiert und kann somit als quantitativer Enzymmarker intakter mitochondrialer Masse verwendet werden. Angesichts der Tatsache, dass viele Moleküle und Wege, die wichtige Funktionen in Mitochondrien haben, sind stark zwischen Menschen und Drosophilakonserviert, und dass eine Reihe von leistungsfähigen genetischen Werkzeugen in Drosophilazur Verfügung stehen, Drosophila dient als ein gutes Modellsystem für die Untersuchung mitochondriale Funktion. Hier präsentieren wir ein Protokoll zur schnellen und einfachen Messung der Citrat-Synthase-Aktivität in Gewebehomogenat von erwachsenen Fliegen, ohne Mitochondrien zu isolieren. Dieses Protokoll eignet sich auch zur Messung der Citratsynthase-Aktivität in Larven, kultivierten Zellen und Säugetiergeweben.

Abbildung 1 zeigt ein Beispiel für die kinetischen Kurven für die OD-Absorption bei 412 nm im Zeitverlauf, die mit hilfe des kolorimetrischen Assays der Citrat-Synthase-Aktivität zur Messung der Drosophila Thoraxgewebehomogenate verschiedener Genotypen erhalten wurden. Es ist allgemein bekannt, dass PGC-1a ein Master Regulator der mitochondrialen Biogenese ist. PGC-1 ist funktionell zwischen Drosophila und Menschen konserviert. Drosop...

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A Colorimetric Assay of Citrate Synthase Activity in Drosophila Melanogaster

Wir präsentieren ein Protokoll für einen kolorimetrischen Test der Citratsynthase-Aktivität zur Quantifizierung intakter mitochondrialer Masse in Drosophila-Gewebehomogenaten.

Ein kolorimetrischer Test der Citrat-Synthase-Aktivität in Drosophila Melanogaster

Mitochondria play the most prominent roles in cellular metabolism by producing ATP through oxidative phosphorylation and regulating a variety of ...

Drosophila dient als gutes Modellsystem für das Studium der mitochondrialen Funktion. Hier stellen wir ein Protokoll zur Messung der Citratsynthase-Aktivität in Gewebehomogenat von erwachsenen Fliegen vor. Dieses Protokoll erfordert keine Isolierung von Mitochondrien.Es ist schnell und einfach und eignet sich zur Messung der Citratsynthase-Aktivität in Larven, kultivierten Zellen und Säugetiergeweben. Beginnen Sie mit dem Sammeln von erwachsenen Fliegen für jede Probe, stellen Sie sicher, mindestens dreifache Proben für jeden Genotyp zu sammeln. Bereiten Sie 500 Mikroliter eiskalten Extraktionspuffer mit 20 Millimolaren HEPES, einem Millimolaren EDTA und 0,1%triton X-100 in einem 1,5-Milliliter-Reagenzglas für jede Probe vor.Anästhesisieren Sie die erwachsenen Fliegen mit Kohlendioxid auf einem Anästhesiepad. Um die Thoraxen zu isolieren, fixieren Sie sie mit einem Paar Zangen und isolieren Sie den Fliegenbauch, indem Sie entlang der Grenze des Thorax und Desdomen mit einer Schere schneiden. Sammeln Sie die Fliegenthoraxes für die Citrat-Synthase-Aktivität Assay.10 erwachsene Fliegenthoraxes sofort auf 100 Mikroliter eiskalten Extraktionspuffer übertragen und mit einem Stößel auf Eis homogenisieren. Halten Sie die Proben kalt, indem Sie sie fünf bis zehn Sekunden auf Demeis homogenisieren, fünf Sekunden lang auf dem Eis sitzen lassen und sich dann wiederholen, bis alle Gewebe vollständig homogenisiert sind. Aliquot 10 Mikroliter jeder homogenisierten Probe in eine neue Röhre zur Messung des Proteingehalts, wodurch diese Tuben ebenfalls auf Eis gehalten werden.Fügen Sie 400 Mikroliter eiskalten Extraktionspuffer zu jeder verbleibenden Probe für ein Gesamtvolumen von 500 Mikroliter und Pipette nach oben und unten sanft zu mischen. Für jede Reaktion einen Mikroliter verdünntes Zelllysat zu 150 Mikrolitern der frisch zubereiteten Reaktionslösung hinzufügen. Mischen Sie gründlich durch sanfte Pipettierung, um Blasenbildung zu vermeiden, dann verwenden Sie einen Plattenleser, um die Absorption bei 412 Nanometern alle 10 bis 30 Sekunden für vier Minuten bei 25 Grad Celsius zu messen.Zeichnen Sie die Daten im Laufe der Zeit als Absorptionskraft und berechnen Sie dann die Neigung für den linearen Teil der Kurve. Dividieren Sie schließlich die Reaktionsgeschwindigkeit oder Steigung durch die Probenproteinkonzentration, um die Citratsynthase-Aktivität zu normalisieren. Es wurde vermutet, dass Knockdown von dRNF34 in Drosophila Muskel würde mitochondriale Citrat-Synthase-Aktivität zu erhöhen, während Knockdown von dPGC-1 würde diese Erhöhung umkehren.Für jeden Test wurde eine erste lineare enzymatische Rate festgelegt; die Steigungen der Trendlinien stellen die maximalen Reaktionsraten dar, die den maximalen Citrat-Synthase-Aktivitäten der verschiedenen Genotypen entsprechen. Die maximalen Citrat-Synthase-Aktivitäten wurden aus den kinetischen Kurven berechnet und durch die Proteinkonzentration normalisiert. Die Ergebnisse zeigten, dass die Synthase-Aktivität von Fliegenthoraxen tatsächlich mit muskelspezifischem dRNF34 Knockdown zunahm und die Erhöhung durch muskelspezifischen dPGC-1-Knockdown umgekehrt wurde.Bei der Homogenisierung der Probe ist es wichtig, das Rohr zu kippen und das Homogenat zu überprüfen, um sicherzustellen, dass keine Gerinnsel vorhanden sind und die Gewebe im Rohr vollständig homogenisiert sind. Nach der Probenentnahme sollten alle Probenbehandlungen auf Eis durchgeführt werden. Der Citrat-Synthase-Aktivitätstest wird verwendet, um intakte mitochondriale Masse zu quantifizieren.Die richtige Quantifizierung der intakten mitochondrialen Masse ist sehr wichtig für die Bewertung der mitochondrialen Funktion.

Research

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Kontinuierlicher fluoreszenzbasierter Endonuklease-gekoppelter DNA-Methylierungsassay zum Screening auf DNA-Methyltransferase-Inhibitoren

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Messung der Caspase-Aktivität mit einem fluorometrischen Assay oder einer Durchflusszytometrie

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