Name: a colorimetric assay of citrate synthase activity in drosophila melanogaster
Uploaded: 2020-01-16T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Colorimetric Assay of Citrate Synthase Activity in Drosophila Melanogaster at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto dalle sovvenzioni della National Natural Science Foundation of China (31401013 e 31471010), della Science and Technology Commission del comune di Shanghai, del Programma Shanghai Pujiang (14PJ1405900) e della Natural Science Foundation di Shanghai (19-R1446400).

1. Colorimetric Citrate Synthase Activity Assay for D. melanogaster16
<ol><li>Raccogli dieci mosche adulte per ogni campione. Raccogliere almeno campioni triplicati per ogni genotipo.</li>
	<li>Preparare 500 l di buffer di estrazione a freddo ghiaccio contenente 20 mHE HEPES (pH , 7,2), 1 mM EDTA e 0,1% triton X-100 in una provetta da 1,5 mL per ogni campione.</li>
	<li>Anestesizza le mosche adulte con CO2 su un cuscinetto di anestesia e isola i tessuti desiderati. Per isolar...

<ol>
	<li>Yee, C., Yang, W., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intrinsic+apoptosis+pathway+mediates+the+pro-longevity+response+to+mitochondrial+ROS+in+C.+elegans.">The intrinsic apoptosis pathway mediates the pro-longevity response to mitochondrial ROS in C. elegans.</a> Cell. 157 (4), 897-909 (2014).</li><li>Sarasija, S., Norman, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gamma-Secretase+Independent+Role+for+Presenilin+in+Calcium+Homeostasis+Impacts+Mitochondrial+Function+and+Morphology+in+Caenorhabditis+elegans.">A gamma-Secretase Independent Role for Presenilin in Calcium Homeostasis Impacts Mitochondrial Function and Morphology in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 201 (4), 1453-1466 (2015).</li><li>Oxenoid, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architecture+of+the+mitochondrial+calcium+uniporter.">Architecture of the mitochondrial calcium uniporter.</a> Nature. 533 (7602), 269-273 (2016).</li><li>Hekimi, S., Wang, Y., Noe, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+ROS+and+the+Effectors+of+the+Intrinsic+Apoptotic+Pathway+in+Aging+Cells:+The+Discerning+Killers!.">Mitochondrial ROS and the Effectors of the Intrinsic Apoptotic Pathway in Aging Cells: The Discerning Killers!.</a> Frontiers in Genetics. 7, 161 (2016).</li><li>Kim, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+Biosynthesis+Coordinates+a+Mitochondrial-to-Cytosolic+Stress+Response.">Lipid Biosynthesis Coordinates a Mitochondrial-to-Cytosolic Stress Response.</a> Cell. 166 (6), 1539-1552 (2016).</li><li>Wang, Y., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+and+longevity+in+animals:+Untangling+the+knot.">Mitochondrial dysfunction and longevity in animals: Untangling the knot.</a> Science. 350 (6265), 1204-1207 (2015).</li><li>Ray, A., Martinez, B. A., Berkowitz, L. A., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction,+oxidative+stress,+and+neurodegeneration+elicited+by+a+bacterial+metabolite+in+a+C.+elegans+Parkinson's+model.">Mitochondrial dysfunction, oxidative stress, and neurodegeneration elicited by a bacterial metabolite in a C. elegans Parkinson's model.</a> Cell Death &amp; Disease. 5, e984 (2014).</li><li>Tronstad, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+and+quantification+of+cellular+mitochondrial+morphology+and+content.">Regulation and quantification of cellular mitochondrial morphology and content.</a> Current Pharmaceutical Design. 20 (35), 5634-5652 (2014).</li><li>Wiegand, G., Remington, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Citrate+synthase:+structure,+control,+and+mechanism.">Citrate synthase: structure, control, and mechanism.</a> Annual Review of Biophysics and Biophysical Chemistry. 15, 97-117 (1986).</li><li>Lopez-Lluch, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calorie+restriction+induces+mitochondrial+biogenesis+and+bioenergetic+efficiency.">Calorie restriction induces mitochondrial biogenesis and bioenergetic efficiency.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (6), 1768-1773 (2006).</li><li>MacInnis, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superior+mitochondrial+adaptations+in+human+skeletal+muscle+after+interval+compared+to+continuous+single-leg+cycling+matched+for+total+work.">Superior mitochondrial adaptations in human skeletal muscle after interval compared to continuous single-leg cycling matched for total work.</a> Journal of Physiology. 595 (9), 2955-2968 (2017).</li><li>Gillen, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Twelve+Weeks+of+Sprint+Interval+Training+Improves+Indices+of+Cardiometabolic+Health+Similar+to+Traditional+Endurance+Training+despite+a+Five-Fold+Lower+Exercise+Volume+and+Time+Commitment.">Twelve Weeks of Sprint Interval Training Improves Indices of Cardiometabolic Health Similar to Traditional Endurance Training despite a Five-Fold Lower Exercise Volume and Time Commitment.</a> PLoS One. 11 (4), e0154075 (2016).</li><li>Mukherjee, S., Basar, M. A., Davis, C., Duttaroy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+functional+similarities+and+divergences+between+Drosophila+Spargel/dPGC-1+and+mammalian+PGC-1+protein.">Emerging functional similarities and divergences between Drosophila Spargel/dPGC-1 and mammalian PGC-1 protein.</a> Frontiers in Genetics. 5, 216 (2014).</li><li>Mukherjee, S., Duttaroy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spargel/dPGC-1+is+a+new+downstream+effector+in+the+insulin-TOR+signaling+pathway+in+Drosophila.">Spargel/dPGC-1 is a new downstream effector in the insulin-TOR signaling pathway in Drosophila.</a> Genetics. 195 (2), 433-441 (2013).</li><li>Diop, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PGC-1/Spargel+Counteracts+High-Fat-Diet-Induced+Obesity+and+Cardiac+Lipotoxicity+Downstream+of+TOR+and+Brummer+ATGL+Lipase.">PGC-1/Spargel Counteracts High-Fat-Diet-Induced Obesity and Cardiac Lipotoxicity Downstream of TOR and Brummer ATGL Lipase.</a> Cell Reports. 10 (9), 1572-1584 (2015).</li><li>Rera, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+longevity+and+tissue+homeostasis+by+the+Drosophila+PGC-1+homolog.">Modulation of longevity and tissue homeostasis by the Drosophila PGC-1 homolog.</a> Cell Metabolism. 14 (5), 623-634 (2011).</li><li>Wei, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNF34+modulates+the+mitochondrial+biogenesis+and+exercise+capacity+in+muscle+and+lipid+metabolism+through+ubiquitination+of+PGC-1+in+Drosophila.">RNF34 modulates the mitochondrial biogenesis and exercise capacity in muscle and lipid metabolism through ubiquitination of PGC-1 in Drosophila.</a> Acta Biochimica et Biophysica Sinica (Shanghai). 50 (10), 1038-1046 (2018).</li><li>Tennessen, J. M., Barry, W. E., Cox, J., Thummel, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+studying+metabolism+in+Drosophila.">Methods for studying metabolism in Drosophila.</a> Methods. 68 (1), 105-115 (2014).</li><li>Bosco, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+oxygen+concentration+and+pressure+on+Drosophila+melanogaster:+oxidative+stress,+mitochondrial+activity,+and+survivorship.">Effects of oxygen concentration and pressure on Drosophila melanogaster: oxidative stress, mitochondrial activity, and survivorship.</a> Archives of Insect Biochemistry and Physiology. 88 (4), 222-234 (2015).</li></ol>

Gli studi metabolici che utilizzano la Drosophila come modello devono prendere in considerazione il background genetico, la dieta e il mantenimento delle scorte delle mosche18. Per evitare gli effetti di diversi background genetici sulla misurazione dell'attività synthase citrato, diversi ceppi di Drosophila dovrebbero essere riincrociati al ceppo di controllo per 10 generazioni. Il background genetico di tutti i ceppi di Drosophila utilizzati nei nostri esperimenti è ...

I mitocondri sono meglio conosciuti come gli organelle che producono energia nella maggior parte degli organismi eucarioti, che producono la valuta energetica, ATP, attraverso il ciclo dell'acido tricarboxylico (cioè il ciclo di Krebs) e il ciclo osofoso. I mitocondri si trovano anche a svolgere un ruolo importante in molti altri processi fisiologici, come la regolazione dell'apoptosi1, Ca 2 omeostasi2,3, specie reattiva di ossidazione (ROS) generazione4e reticolo endoplasmico (ER)-risposta di stress5. La disfunzione mitocondriale può colpire qualsiasi organo nel corpo a qualsiasi età ed è una causa primaria di metabolica, invecchiamento6e malattie neurodegenerative7. I mitocondri intatti sono meccanicamente correlati alla funzione mitocondriale. Pertanto, una corretta quantificazione della massa mitocondriale intatta è molto importante per valutare la funzione mitocondriale8. Citrate synthase, un enzima che limita il tasso nella prima fase del ciclo di acido tricarboxylico9, è localizzato nella matrice mitocondriale all'interno delle cellule eucariotiche, e quindi può essere utilizzato come marcatore quantitativo per la presenza di massa mitocondriale intatta9,10. L'attività synthase citrato può anche essere utilizzata come fattore di normalizzazione per proteine mitocondriali intatte11,12.
La mosca della frutta, Drosophila melanogaster, è un ottimo sistema modello per studiare la funzione mitocondriale, come molte molecole e percorsi che svolgono ruoli fondamentali nei mitocondri sono evolutivamente conservati dalla Drosophila agli esseri umani13,14,15. Qui, presentiamo un protocollo per un metodo semplice e veloce per la misurazione dell'attività di sinteassi citrati da un saggio colorimetrico in omogenato del tessuto della Drosophila 16 in un formato 96 beh piastra. Nel saggio di attività di sintetzia citrato, citrato synthase nel tessuto di Drosophila omogenato cala la reazione di osaloaceta con coenzima acetil A (acetyl CoA) per formare il citrate CoA-SH e H. CoA-SH reagisce successivamente con 5,5'-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid) (DTNB) per generare un prodotto colorato, 2-nitro-5-thiobenzoate (TNB), che può essere facilmente misurato spettrometricamente a 412 nm. L'attività synthasi citrata può essere riflessa dal tasso di produzione del colore.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid (HEPES)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V900477</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (TRIZMA Base)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V900483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetyl-CoA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithio-bis-nitrobenzoic acid (DTNB)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V900106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxaloacetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O4126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pellet pestle</td>
			<td>Sangon</td>
			<td>F619072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pellet pestle motor</td>
			<td>Tiangen</td>
			<td>OSE-Y10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>Eon</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein BCA Assay kit</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>P0010S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>WPI</td>
			<td>14124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sangon</td>
			<td>A110694-0100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a colorimetric assay of citrate synthase activity in drosophila melanogaster

I mitocondri svolgono i ruoli più importanti nel metabolismo cellulare producendo ATP attraverso la fosfororylazione ossidativa e regolando una varietà di processi fisiologici. La disfunzione mitocondriale è una causa primaria di una serie di malattie metaboliche e neurodegenerative. I mitocondri intatti sono fondamentali per il loro corretto funzionamento. L'enzima citrato synthasi è localizzato nella matrice mitocondriale e quindi può essere utilizzato come un marcatore enzimatico quantitativo di massa mitocondriale intatta. Dato che molte molecole e percorsi che hanno importanti funzioni nei mitocondri sono altamente conservati tra gli esseri umani e la Drosophila, e che una serie di potenti strumenti genetici sono disponibili in Drosophila, la Drosophila serve come un buon sistema modello per studiare la funzione mitocondriale. Qui, presentiamo un protocollo per la misurazione rapida e semplice dell'attività di sintetazione della citrata nell'omogenea tissutale da mosche adulte senza isolare i mitocondri. Questo protocollo è adatto anche per misurare l'attività di sintetasi citrate in larve, cellule coltivate e tessuti mammiferi.

La figura 1 presenta un esempio delle curve cinetiche per l'assorbimento OD a 412 nm nel tempo ottenute utilizzando il saggio colorimetrico dell'attività di citrate synthase per misurare i setgenati del tessuto toracico della Drosophila di diversi genotipi. È ben noto che il PGC-1 è un regolatore principale della biogenesi mitocondriale. Il PGC-1 è conservato funzionalmente tra la Drosophila e gli esseri umani. Drosophila RNF34 ...

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A Colorimetric Assay of Citrate Synthase Activity in Drosophila Melanogaster

Vi presentiamo un protocollo per un saggio colorimetrico di attività di sinteassi citrate per la quantificazione della massa mitocondriale intatta negli omogenei del tessuto della Drosophila.

Un saggio colorimetrico dell'attività Citrate Synthase in Drosophila Melanogaster

Mitochondria play the most prominent roles in cellular metabolism by producing ATP through oxidative phosphorylation and regulating a variety of ...

Drosophila funge da buon sistema modello per lo studio della funzione mitocondriale. Qui presentiamo un protocollo per misurare l'attività della sintasi citrato nell'omogeneato tissutale dalle mosche adulte. Questo protocollo non richiede l'isolamento dei mitocondri.È veloce e semplice ed è adatto per misurare l'attività della sintasi citrato nelle larve, nelle cellule coltivate e nei tessuti dei mammiferi. Inizia raccogliendo mosche adulte per ogni campione, assicurandoti di raccogliere almeno campioni triplicati per ogni genotipo. Preparare 500 microlitri di tampone di estrazione ghiacciato con HEPES da 20 millimolare, UN EDTA millimolare e 0,1% tritone X-100 in una provetta da 1,5 millilitri per ogni campione.Anestetizza le mosche adulte con anidride carbonica su un tampone di anestesia. Per isolare i torace, fissarli con un paio di forcep e isolare gli addome di mosca tagliando lungo il bordo del torace e dell'addome con un paio di forbici. Raccogliere i torace di mosca per il saggio di attività della sintasi citrato.Trasferire immediatamente 10 torace di mosca adulto in 100 microlitri di tampone di estrazione ghiacciato e omogeneizzarli con un pestello sul ghiaccio. Mantenere i campioni freddi omogeneizzando per cinque o 10 secondi sul ghiaccio, lasciandoli sedere sul ghiaccio per cinque secondi, per poi ripetersi fino a quando tutti i tessuti non sono completamente omogeneizzati. Aliquot 10 microlitri di ogni campione omogeneizzato in un nuovo tubo per la misurazione del contenuto proteico, mantenendo questi tubi anche sul ghiaccio.Aggiungere 400 microlitri di tampone di estrazione ghiacciato-freddo a ciascun campione rimanente per un volume totale di 500 microlitri e pipetta su e giù delicatamente da mescolare. Per ogni reazione, aggiungere un microlitro di litolato di cellule diluite a 150 microlitri della soluzione di reazione preparata al momento. Mescolare accuratamente pipettando delicatamente, assicurandosi di evitare la formazione di bolle, quindi utilizzare un lettore di piastre per misurare l'assorbanza a 412 nanometri ogni 10-30 secondi per quattro minuti a 25 gradi Celsius.Tracciate i dati come assorbanza nel tempo, quindi calcolate la pendenza per la porzione lineare della curva. Infine, dividere la velocità di reazione o la pendenza per la concentrazione proteica del campione per normalizzare l'attività sintasi del citrato. È stato ipotizzato che il knockdown di dRNF34 nel muscolo Drosophila aumenterebbe l'attività della sintasi del citrato mitocondriale mentre il knockdown del dPGC-1 avrebbe invertito questo aumento.Per ogni saggio è stato stabilito un tasso enzimatico lineare iniziale; Le attività massime del citrato sintasi sono state calcolate dalle curve cinetiche e normalizzate dalla concentrazione proteica. I risultati hanno dimostrato che l'attività sintasi dei torace di mosca è effettivamente aumentata con il knockdown dRNF34 specifico del muscolo e l'aumento è stato invertito dal knockdown dPGC-1 specifico del muscolo.Quando si omogeneizza il campione, è importante puntare il tubo e controllare l'omogeneato per assicurarsi che non ci siano coaguli e che i tessuti nel tubo siano completamente omogeneizzati. Dopo la raccolta del campione, tutti i trattamenti campione devono essere eseguiti sul ghiaccio. Il saggio di attività della sintasi citrato è usato per quantificare la massa mitocondriale intatta.Una corretta quantificazione della massa mitocondriale intatta è molto importante per valutare la funzione mitocondriale.

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