Name: a colorimetric assay of citrate synthase activity in drosophila melanogaster
Uploaded: 2020-01-16T12:00:00
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この研究は、中国国立自然科学財団(31401013および31471010)、上海市科学技術委員会、上海浦江プログラム(14PJ1405900)、自然科学財団の助成金によって支援されました。上海 (19ZR1446400).

1. D.メラノガスターの比色クエン酸シンターゼ活性アッセイ16
<ol><li>サンプルごとに10匹の大人のハエを収集します。各遺伝子型の少なくとも三重のサンプルを収集します。</li>
	<li>20 mM HEPES (pH = 7.2)、1 mM EDTA、および 0.1% トリトン X-100 を含む氷冷抽出バッファーを 1 サンプルごとに 1.5 mL 試験管に用意します。</li>
	<li>麻酔パッド上のCO2で成人のハエを麻酔し?...

<ol>
	<li>Yee, C., Yang, W., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intrinsic+apoptosis+pathway+mediates+the+pro-longevity+response+to+mitochondrial+ROS+in+C.+elegans.">The intrinsic apoptosis pathway mediates the pro-longevity response to mitochondrial ROS in C. elegans.</a> Cell. 157 (4), 897-909 (2014).</li><li>Sarasija, S., Norman, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gamma-Secretase+Independent+Role+for+Presenilin+in+Calcium+Homeostasis+Impacts+Mitochondrial+Function+and+Morphology+in+Caenorhabditis+elegans.">A gamma-Secretase Independent Role for Presenilin in Calcium Homeostasis Impacts Mitochondrial Function and Morphology in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 201 (4), 1453-1466 (2015).</li><li>Oxenoid, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architecture+of+the+mitochondrial+calcium+uniporter.">Architecture of the mitochondrial calcium uniporter.</a> Nature. 533 (7602), 269-273 (2016).</li><li>Hekimi, S., Wang, Y., Noe, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+ROS+and+the+Effectors+of+the+Intrinsic+Apoptotic+Pathway+in+Aging+Cells:+The+Discerning+Killers!.">Mitochondrial ROS and the Effectors of the Intrinsic Apoptotic Pathway in Aging Cells: The Discerning Killers!.</a> Frontiers in Genetics. 7, 161 (2016).</li><li>Kim, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+Biosynthesis+Coordinates+a+Mitochondrial-to-Cytosolic+Stress+Response.">Lipid Biosynthesis Coordinates a Mitochondrial-to-Cytosolic Stress Response.</a> Cell. 166 (6), 1539-1552 (2016).</li><li>Wang, Y., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+and+longevity+in+animals:+Untangling+the+knot.">Mitochondrial dysfunction and longevity in animals: Untangling the knot.</a> Science. 350 (6265), 1204-1207 (2015).</li><li>Ray, A., Martinez, B. A., Berkowitz, L. A., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction,+oxidative+stress,+and+neurodegeneration+elicited+by+a+bacterial+metabolite+in+a+C.+elegans+Parkinson's+model.">Mitochondrial dysfunction, oxidative stress, and neurodegeneration elicited by a bacterial metabolite in a C. elegans Parkinson's model.</a> Cell Death &amp; Disease. 5, e984 (2014).</li><li>Tronstad, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+and+quantification+of+cellular+mitochondrial+morphology+and+content.">Regulation and quantification of cellular mitochondrial morphology and content.</a> Current Pharmaceutical Design. 20 (35), 5634-5652 (2014).</li><li>Wiegand, G., Remington, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Citrate+synthase:+structure,+control,+and+mechanism.">Citrate synthase: structure, control, and mechanism.</a> Annual Review of Biophysics and Biophysical Chemistry. 15, 97-117 (1986).</li><li>Lopez-Lluch, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calorie+restriction+induces+mitochondrial+biogenesis+and+bioenergetic+efficiency.">Calorie restriction induces mitochondrial biogenesis and bioenergetic efficiency.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (6), 1768-1773 (2006).</li><li>MacInnis, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superior+mitochondrial+adaptations+in+human+skeletal+muscle+after+interval+compared+to+continuous+single-leg+cycling+matched+for+total+work.">Superior mitochondrial adaptations in human skeletal muscle after interval compared to continuous single-leg cycling matched for total work.</a> Journal of Physiology. 595 (9), 2955-2968 (2017).</li><li>Gillen, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Twelve+Weeks+of+Sprint+Interval+Training+Improves+Indices+of+Cardiometabolic+Health+Similar+to+Traditional+Endurance+Training+despite+a+Five-Fold+Lower+Exercise+Volume+and+Time+Commitment.">Twelve Weeks of Sprint Interval Training Improves Indices of Cardiometabolic Health Similar to Traditional Endurance Training despite a Five-Fold Lower Exercise Volume and Time Commitment.</a> PLoS One. 11 (4), e0154075 (2016).</li><li>Mukherjee, S., Basar, M. A., Davis, C., Duttaroy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+functional+similarities+and+divergences+between+Drosophila+Spargel/dPGC-1+and+mammalian+PGC-1+protein.">Emerging functional similarities and divergences between Drosophila Spargel/dPGC-1 and mammalian PGC-1 protein.</a> Frontiers in Genetics. 5, 216 (2014).</li><li>Mukherjee, S., Duttaroy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spargel/dPGC-1+is+a+new+downstream+effector+in+the+insulin-TOR+signaling+pathway+in+Drosophila.">Spargel/dPGC-1 is a new downstream effector in the insulin-TOR signaling pathway in Drosophila.</a> Genetics. 195 (2), 433-441 (2013).</li><li>Diop, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PGC-1/Spargel+Counteracts+High-Fat-Diet-Induced+Obesity+and+Cardiac+Lipotoxicity+Downstream+of+TOR+and+Brummer+ATGL+Lipase.">PGC-1/Spargel Counteracts High-Fat-Diet-Induced Obesity and Cardiac Lipotoxicity Downstream of TOR and Brummer ATGL Lipase.</a> Cell Reports. 10 (9), 1572-1584 (2015).</li><li>Rera, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+longevity+and+tissue+homeostasis+by+the+Drosophila+PGC-1+homolog.">Modulation of longevity and tissue homeostasis by the Drosophila PGC-1 homolog.</a> Cell Metabolism. 14 (5), 623-634 (2011).</li><li>Wei, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNF34+modulates+the+mitochondrial+biogenesis+and+exercise+capacity+in+muscle+and+lipid+metabolism+through+ubiquitination+of+PGC-1+in+Drosophila.">RNF34 modulates the mitochondrial biogenesis and exercise capacity in muscle and lipid metabolism through ubiquitination of PGC-1 in Drosophila.</a> Acta Biochimica et Biophysica Sinica (Shanghai). 50 (10), 1038-1046 (2018).</li><li>Tennessen, J. M., Barry, W. E., Cox, J., Thummel, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+studying+metabolism+in+Drosophila.">Methods for studying metabolism in Drosophila.</a> Methods. 68 (1), 105-115 (2014).</li><li>Bosco, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+oxygen+concentration+and+pressure+on+Drosophila+melanogaster:+oxidative+stress,+mitochondrial+activity,+and+survivorship.">Effects of oxygen concentration and pressure on Drosophila melanogaster: oxidative stress, mitochondrial activity, and survivorship.</a> Archives of Insect Biochemistry and Physiology. 88 (4), 222-234 (2015).</li></ol>

ショウジョウバエをモデルとして使用した代謝研究は、ハエ18の遺伝的背景、食事、およびストックメンテナンスを考慮する必要があります。クエン酸シンターゼ活性の測定に異なる遺伝的背景の影響を避けるために、ショウジョウバエの異なる株は、10世代のコントロール株にバッククロスする必要があります。我々の実験で使用されるすべてのショウジ?...

ミトコンドリアは、トリカルボン酸サイクル(すなわち、クレブスサイクル)および酸化リン酸化を介してエネルギー通貨ATPを生成するほとんどの真核生物における発電性オルガネラとして最もよく知られています。ミトコンドリアはまた、アポトーシス1、Ca2+恒常性2、3、反応性酸化種(ROS)生成4、および小胞体(ER)ストレス応答5の調節など、他の多くの生理学的過程において重要な役割を果たすることが判明している。ミトコンドリア機能障害は、任意の年齢で体内の任意の臓器に影響を与えることができるし、代謝、老化関連6、および神経変性疾患の主な原因である7。無傷のミトコンドリアは、ミトコンドリア機能に機械的に関連しています。従って、ミトコンドリア質量の適切な定量は、ミトコンドリア機能8を評価するために非常に重要である。クエン酸シンターゼは、トリカルボン酸サイクル9の第1工程における速度制限酵素であり、真核細胞内のミトコンドリアマトリックスに局在し、従って無傷のミトコンドリア質量9、10の存在のための定量マーカーとして使用することができる。クエン酸シンターゼ活性は、無傷のミトコンドリアタンパク質11、12の正規化因子としても使用することができる。
フルーツフライ、ショウジョウバエメラノガスターは、ミトコンドリアで重要な役割を果たす多くの分子および経路がショウジョウバエからヒト13、14、15に進化的に保存されているので、ミトコンドリア機能を研究するための優れたモデルシステムである。ここでは、ショウジョウバエ組織中の比色アッセイによるクエン酸シンターゼ活性を96ウェルプレート形式で均質化するクエン酸シンターゼ活性を測定するための迅速かつ簡単な方法のためのプロトコルを提示する。クエン酸シンターゼ活性アッセイにおいて、ショウジョウバエ組織中のクエン酸シンターゼは、アセチル補酵素A(アセチルCoA)とオキサロ酢酸塩の反応を触媒し、クエン酸CoA-SHおよびH+を形成する。CoA-SHはその後、5,5'-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸)(DTNB)と反応して着色物を生成し、2-ニトロ-5-チオ安息香酸塩(TNB)を生成し、412nmで分光法で容易に測定することができる。クエン酸シンターゼ活性は、色の生産速度によって反映することができる。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid (HEPES)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V900477</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (TRIZMA Base)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V900483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetyl-CoA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithio-bis-nitrobenzoic acid (DTNB)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V900106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxaloacetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O4126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pellet pestle</td>
			<td>Sangon</td>
			<td>F619072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pellet pestle motor</td>
			<td>Tiangen</td>
			<td>OSE-Y10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>Eon</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein BCA Assay kit</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>P0010S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>WPI</td>
			<td>14124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sangon</td>
			<td>A110694-0100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a colorimetric assay of citrate synthase activity in drosophila melanogaster

ミトコンドリアは、酸化リン酸化を通じてATPを産生し、様々な生理学的プロセスを調節することにより、細胞代謝において最も顕著な役割を果たしています。ミトコンドリア機能不全は、多くの代謝および神経変性疾患の主な原因である。無傷のミトコンドリアは、その適切な機能のために重要です.クエン酸酵素シンターゼはミトコンドリアマトリックスに局在しているため、無傷のミトコンドリア塊の定量酵素マーカーとして使用することができます。ミトコンドリアで重要な機能を持つ多くの分子や経路がヒトとショウジョウバレの間で高度に保存されており、ショウジョウバアラで強力な遺伝的ツールの配列が利用可能であることを考えると、ショウジョウバヤはミトコンドリア機能を研究するための良いモデルシステムとして機能します。ここでは、ミトコンドリアを単離することなく、成体ハエ由来の組織ホモジネートにおけるクエン酸シンターゼ活性を迅速かつ簡単に測定するためのプロトコルを提示する。このプロトコルはまた、幼虫、培養細胞、および哺乳動物組織におけるクエン酸シンターゼ活性を測定するのに適している。

図1は、クエン酸シンターゼ活性比色アッセイを用いて得られた412nmにおけるOD吸光度に対する運動曲線の一例を示し、異なる遺伝子型のショウジョウバエ胸郭組織ホモジナートを測定する。PGC-1αがミトコンドリア生形成の主レギュレータであることはよく知られている。PGC-1αはショウジョウバアラとヒトの間で機能的に保存されて...

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A Colorimetric Assay of Citrate Synthase Activity in Drosophila Melanogaster

ショウジョウバエ組織ホモジネテスにおける無傷のミトコンドリア塊を定量するためのクエン酸シンターゼ活性の比色アッセイのためのプロトコルを提示する。

ショウジョウバエメラノガスターにおけるクエン酸シンターゼ活性の比色アッセイ

Mitochondria play the most prominent roles in cellular metabolism by producing ATP through oxidative phosphorylation and regulating a variety of ...

ショウジョウバエはミトコンドリア機能を研究するための良いモデルシステムとして機能します。ここでは、成体ハエからホモジネート組織におけるクエン酸シンターゼ活性を測定するためのプロトコルを提示する。このプロトコルはミトコンドリアの分離を必要としません。それは速く、簡単で、幼虫、培養細胞および哺乳類組織のクエン酸シンターゼ活性を測定するのに適している。各サンプルの成虫ハエを収集し、各遺伝子型の少なくとも三重サンプルを収集することを確認します。20ミリモルHEPES、1ミリモルEDTA、および0.1%トリトンX-100を各サンプルに対して1.5ミリリットル試験管で500マイクロリットルの氷冷抽出バッファーを調製します。成人は麻酔パッドに二酸化炭素を持って飛ぶ麻酔をします。胸郭を分離するには、鉗子で固定し、はさみで胸郭と腹部の境界に沿って切断することによってハエ腹部を分離します。クエン酸シンターゼ活性アッセイのためのフライソアサックスを収集します。10個の成体フライソラックスを100マイクロリットルの氷冷抽出バッファーにすぐに移し、氷の上の害虫でそれらを均質化します。氷の上で5〜10秒間均質化し、5秒間氷の上に座らせ、すべての組織が完全に均質化されるまで繰り返すことによって、サンプルを冷たく保ちます。アリコート 10 マイクロリットルの各均質化サンプルを新しいチューブに入れ、タンパク質含有量測定を行い、これらのチューブを氷上に保ちます。残りのサンプルに400マイクロリットルの氷冷抽出バッファーを加え、合計体積500マイクロリットル、ピペットを上下に加え、穏やかに混合します。各反応に対して、1マイクロリットルの希釈した細胞溶解液を、作製した反応液の150マイクロリットルに加える。穏やかにピペット処理を行い、泡の形成を避け、プレートリーダーを使用して摂氏25度で4分間、10〜30秒ごとに412ナノメートルの吸光度を測定します。時間の経過に従って吸光度としてデータをプロットし、曲線の直線部分の傾きを計算します。最後に、反応速度または傾斜をサンプルタンパク質濃度で割り、クエン酸シンターゼ活性を正常化する。ショウジョウバエの筋肉におけるdRNF34のノックダウンはミトコンドリアクエン酸シンターゼ活性を増加させ、dPGC-1のノックダウンはこの増加を逆転させると仮定された。初期線形酵素速度はアッセイごとに確立され、トレンドラインの傾きは、異なる遺伝子型の最大クエン酸合成酵素活動と同等の最大反応速度を表す。最大クエン酸シンターゼの活動は、運動曲線から計算し、タンパク質濃度によって正規化した。結果は、ハエのthoraxの合成酵素活性が実際に筋肉特異的dRNF34ノックダウンで増加し、増加が筋肉特異的dPGC-1ノックダウンによって逆転したことを示した。サンプルを均質化する際には、チューブにチップを入れ、ホモゲン酸をチェックして、血栓がなく、チューブ内の組織が完全に均質化されていることを確認することが重要です。サンプル採取後、すべてのサンプル処理は氷上で行う必要があります。クエン酸シンターゼ活性アッセイは、無傷のミトコンドリア質量を定量するために使用される。ミトコンドリアの機能を評価するためには、ミトコンドリア質量の適切な定量化が非常に重要です。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Colorimetric Assay of Citrate Synthase Activity in Drosophila Melanogaster

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

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のpH依存性活性の検出<em&gt;エシェリヒア・コリ</em&gt;シャペロンHdeB<em&gt;インビトロ</em&gt;と<em&gt;インビボ</em

Bacteria are frequently exposed to environmental changes, such as alterations in pH, temperature, redox status, light exposure or mechanical force. Many ...

A Fluorescence-based Assay of Phospholipid Scramblase Activity

リン脂質スクランブラーゼ活性の蛍光ベースのアッセイ

Scramblases translocate phospholipids across the membrane bilayer bidirectionally in an ATP-independent manner. The first scramblase to be identified and ...

A Colorimetric Method for Measuring Iron Content in Plants

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Iron, one of the most important micronutrients in living organisms, is involved in basic processes, such as respiration and photosynthesis. Iron content ...

Mapping Metabolism: Monitoring Lactate Dehydrogenase Activity Directly in Tissue

マッピング代謝: 監視組織で直接乳酸脱水素酵素活性

Mapping enzymatic activity in space and time is critical for understanding the molecular basis of cell behavior in normal tissue and disease. In situ ...

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

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TRNA イソペンテニル トランスフェラーゼ活性を検出する体外の試金

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved ...

Caffeine Extraction, Enzymatic Activity and Gene Expression of Caffeine Synthase from Plant Cell Suspensions

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Caffeine (1,3,7-trimethylxanthine) is a purine alkaloid present in popular drinks such as coffee and tea. This secondary metabolite is regarded as a ...

A Fluorogenic Peptide Cleavage Assay to Screen for Proteolytic Activity: Applications for coronavirus spike protein activation

プロテアーゼ活性の画面に蛍光ペプチド胸の谷間アッセイ: アプリケーション コロナ ウイルスのスパイク蛋白質のアクティブ化

Enveloped viruses such as coronaviruses or influenza virus require proteolytic cleavage of their fusion protein to be able to infect the host cell. Often ...

Continuous Fluorescence-Based Endonuclease-Coupled DNA Methylation Assay to Screen for DNA Methyltransferase Inhibitors

DNAメチルトランスフェラーゼ阻害剤をスクリーニングするための連続蛍光ベースのエンドヌクレアーゼ共役DNAメチル化アッセイ(英語)

DNA methylation, a form of epigenetic gene regulation, is important for normal cellular function. In cells, proteins called DNA methyltransferases (DNMTs) ...

Measuring Caspase Activity Using a Fluorometric Assay or Flow Cytometry

蛍光アッセイまたはフローサイトメトリーを使用したカスパーゼ活性の測定

The activation of cysteine proteases, known as caspases, remains an important process in multiple forms of cell death. Caspases are critical initiators ...

Smartphone as an Analytical Device to Quantify Protein Using Bradford Assay

RGBradford: Protein Quantitation with a Smartphone Camera

An Alternative Approach to Protein Quantification by Bradford Assay Using a Smartphone (Video) | JoVE

RGBradford:スマートフォンカメラによるタンパク質定量(英語)

Protein quantitation is an essential procedure in life sciences research. Amongst several other methods, the Bradford assay is one of the most used. ...