Name: a colorimetric assay of citrate synthase activity in drosophila melanogaster
Uploaded: 2020-01-16T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Colorimetric Assay of Citrate Synthase Activity in Drosophila Melanogaster at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado pelas subvenções da National Natural Science Foundation of China (31401013 e 31471010), da Comissão de Ciência e Tecnologia do Município de Xangai, do Programa Shanghai Pujiang (14PJ1405900) e da Fundação de Ciências Naturais Xangai (19ZR1446400).

1. Ensaio de atividade de citrato de citrato colorimtricpara D. melanogaster16
<ol><li>Coletar dez moscas adultas para cada amostra. Coletar pelo menos amostras de triplicado para cada genótipo.</li>
	<li>Prepare 500 μL de tampão de extração de gelo-frio contendo 20 mM HEPES (pH = 7,2), 1 mM EDTA e 0,1% triton X-100 em um tubo de ensaio de 1,5 mL para cada amostra.</li>
	<li>Anestesia adulto voa com CO2 em uma almofada de anestesia e isolar os tecidos desejados. Para iso...

<ol>
	<li>Yee, C., Yang, W., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intrinsic+apoptosis+pathway+mediates+the+pro-longevity+response+to+mitochondrial+ROS+in+C.+elegans.">The intrinsic apoptosis pathway mediates the pro-longevity response to mitochondrial ROS in C. elegans.</a> Cell. 157 (4), 897-909 (2014).</li><li>Sarasija, S., Norman, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gamma-Secretase+Independent+Role+for+Presenilin+in+Calcium+Homeostasis+Impacts+Mitochondrial+Function+and+Morphology+in+Caenorhabditis+elegans.">A gamma-Secretase Independent Role for Presenilin in Calcium Homeostasis Impacts Mitochondrial Function and Morphology in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 201 (4), 1453-1466 (2015).</li><li>Oxenoid, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architecture+of+the+mitochondrial+calcium+uniporter.">Architecture of the mitochondrial calcium uniporter.</a> Nature. 533 (7602), 269-273 (2016).</li><li>Hekimi, S., Wang, Y., Noe, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+ROS+and+the+Effectors+of+the+Intrinsic+Apoptotic+Pathway+in+Aging+Cells:+The+Discerning+Killers!.">Mitochondrial ROS and the Effectors of the Intrinsic Apoptotic Pathway in Aging Cells: The Discerning Killers!.</a> Frontiers in Genetics. 7, 161 (2016).</li><li>Kim, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+Biosynthesis+Coordinates+a+Mitochondrial-to-Cytosolic+Stress+Response.">Lipid Biosynthesis Coordinates a Mitochondrial-to-Cytosolic Stress Response.</a> Cell. 166 (6), 1539-1552 (2016).</li><li>Wang, Y., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+and+longevity+in+animals:+Untangling+the+knot.">Mitochondrial dysfunction and longevity in animals: Untangling the knot.</a> Science. 350 (6265), 1204-1207 (2015).</li><li>Ray, A., Martinez, B. A., Berkowitz, L. A., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction,+oxidative+stress,+and+neurodegeneration+elicited+by+a+bacterial+metabolite+in+a+C.+elegans+Parkinson's+model.">Mitochondrial dysfunction, oxidative stress, and neurodegeneration elicited by a bacterial metabolite in a C. elegans Parkinson's model.</a> Cell Death &amp; Disease. 5, e984 (2014).</li><li>Tronstad, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+and+quantification+of+cellular+mitochondrial+morphology+and+content.">Regulation and quantification of cellular mitochondrial morphology and content.</a> Current Pharmaceutical Design. 20 (35), 5634-5652 (2014).</li><li>Wiegand, G., Remington, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Citrate+synthase:+structure,+control,+and+mechanism.">Citrate synthase: structure, control, and mechanism.</a> Annual Review of Biophysics and Biophysical Chemistry. 15, 97-117 (1986).</li><li>Lopez-Lluch, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calorie+restriction+induces+mitochondrial+biogenesis+and+bioenergetic+efficiency.">Calorie restriction induces mitochondrial biogenesis and bioenergetic efficiency.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (6), 1768-1773 (2006).</li><li>MacInnis, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superior+mitochondrial+adaptations+in+human+skeletal+muscle+after+interval+compared+to+continuous+single-leg+cycling+matched+for+total+work.">Superior mitochondrial adaptations in human skeletal muscle after interval compared to continuous single-leg cycling matched for total work.</a> Journal of Physiology. 595 (9), 2955-2968 (2017).</li><li>Gillen, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Twelve+Weeks+of+Sprint+Interval+Training+Improves+Indices+of+Cardiometabolic+Health+Similar+to+Traditional+Endurance+Training+despite+a+Five-Fold+Lower+Exercise+Volume+and+Time+Commitment.">Twelve Weeks of Sprint Interval Training Improves Indices of Cardiometabolic Health Similar to Traditional Endurance Training despite a Five-Fold Lower Exercise Volume and Time Commitment.</a> PLoS One. 11 (4), e0154075 (2016).</li><li>Mukherjee, S., Basar, M. A., Davis, C., Duttaroy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+functional+similarities+and+divergences+between+Drosophila+Spargel/dPGC-1+and+mammalian+PGC-1+protein.">Emerging functional similarities and divergences between Drosophila Spargel/dPGC-1 and mammalian PGC-1 protein.</a> Frontiers in Genetics. 5, 216 (2014).</li><li>Mukherjee, S., Duttaroy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spargel/dPGC-1+is+a+new+downstream+effector+in+the+insulin-TOR+signaling+pathway+in+Drosophila.">Spargel/dPGC-1 is a new downstream effector in the insulin-TOR signaling pathway in Drosophila.</a> Genetics. 195 (2), 433-441 (2013).</li><li>Diop, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PGC-1/Spargel+Counteracts+High-Fat-Diet-Induced+Obesity+and+Cardiac+Lipotoxicity+Downstream+of+TOR+and+Brummer+ATGL+Lipase.">PGC-1/Spargel Counteracts High-Fat-Diet-Induced Obesity and Cardiac Lipotoxicity Downstream of TOR and Brummer ATGL Lipase.</a> Cell Reports. 10 (9), 1572-1584 (2015).</li><li>Rera, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+longevity+and+tissue+homeostasis+by+the+Drosophila+PGC-1+homolog.">Modulation of longevity and tissue homeostasis by the Drosophila PGC-1 homolog.</a> Cell Metabolism. 14 (5), 623-634 (2011).</li><li>Wei, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNF34+modulates+the+mitochondrial+biogenesis+and+exercise+capacity+in+muscle+and+lipid+metabolism+through+ubiquitination+of+PGC-1+in+Drosophila.">RNF34 modulates the mitochondrial biogenesis and exercise capacity in muscle and lipid metabolism through ubiquitination of PGC-1 in Drosophila.</a> Acta Biochimica et Biophysica Sinica (Shanghai). 50 (10), 1038-1046 (2018).</li><li>Tennessen, J. M., Barry, W. E., Cox, J., Thummel, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+studying+metabolism+in+Drosophila.">Methods for studying metabolism in Drosophila.</a> Methods. 68 (1), 105-115 (2014).</li><li>Bosco, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+oxygen+concentration+and+pressure+on+Drosophila+melanogaster:+oxidative+stress,+mitochondrial+activity,+and+survivorship.">Effects of oxygen concentration and pressure on Drosophila melanogaster: oxidative stress, mitochondrial activity, and survivorship.</a> Archives of Insect Biochemistry and Physiology. 88 (4), 222-234 (2015).</li></ol>

Estudos metabólicos usando Drosophila como modelo devem levar em consideração o fundo genético, dieta e manutenção de estoque das moscas18. Para evitar os efeitos de diferentes origens genéticas na medição da atividade de sintese de citrato, diferentes cepas de Drosophila devem ser backcrossed para a cepa de controle por 10 gerações. O fundo genético de todas as cepas drosophila usado em nossos experimentos é w1118, por isso usamos w<...

As mitocôndrias são mais conhecidas como organelas produtoras de energia na maioria dos organismos eucarióticos, que produzem a moeda energética, atp, através do ciclo de ácido tricarboxílico (ou seja, ciclo Krebs) e fosforialation oxidativo. Mitocôndrias também são encontrados para desempenhar papéis importantes em uma série de outros processos fisiológicos, tais como a regulação da apoptose1, Ca2 + homeostase2,3, espécies de oxidação reativa (ROS) geração4, e reticulum endoplasmic (ER) -resposta ao estresse5. Disfunção mitocondrial pode afetar qualquer órgão do corpo em qualquer idade e é uma das principais causas metabólicas, relacionadas ao envelhecimento6, e doenças neurodegenerativas7. Mitocôndrias intactas estão mecanicamente relacionadas à função mitocondrial. Assim, quantificação adequada da massa mitocondrial intacta é muito importante para avaliar a função mitocondrial8. A sintetização de citrato, uma enzima limitante da taxa na primeira etapa do ciclo do ácido tricarboxílico9,é localizada na matriz mitocondrial dentro das células eucarióticas e, portanto, pode ser usada como um marcador quantitativo para a presença de massa mitocondrial intacta9,10. A atividade de sintese de citrato também pode ser usada como um fator de normalização para proteínas mitocondriais intactas11,12.
A mosca da fruta, Drosophila melanogaster,é um excelente sistema modelo para estudar a função mitocondrial, como muitas moléculas e vias que desempenham papéis fundamentais na mitocôndria são evolutivamente conservados de Drosophila para os seres humanos13,14,15. Aqui, apresentamos um protocolo para um método rápido e simples para a medição da atividade de sinteta de citrato por um ensaio colorimétrico no tecido Drosophila homogeneia16 em um formato de placa de 96 poços. No ensaio de atividade de citrato synthase, citrato synthase no tecido Drosophila homogeneizar catalisa a reação de oxaloacetate com coenzima acetil A (acetil CoA) para formar o citrato CoA-SH e H+. O CoA-SH reage posteriormente com 5,5'-dithiobis(2-ácido nitrobenzoico) (DTNB) para gerar um produto colorido, 2-nitro-5-thiobenzoato (TNB), que pode ser facilmente medido espectrofotomicamente a 412 nm. A atividade de sintetizador de citrato pode ser refletida pela taxa de produção de cores.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid (HEPES)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V900477</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (TRIZMA Base)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V900483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetyl-CoA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithio-bis-nitrobenzoic acid (DTNB)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V900106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxaloacetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O4126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pellet pestle</td>
			<td>Sangon</td>
			<td>F619072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pellet pestle motor</td>
			<td>Tiangen</td>
			<td>OSE-Y10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>Eon</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein BCA Assay kit</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>P0010S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>WPI</td>
			<td>14124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sangon</td>
			<td>A110694-0100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a colorimetric assay of citrate synthase activity in drosophila melanogaster

Mitocôndrias desempenham os papéis mais proeminentes no metabolismo celular, produzindo ATP através da fosforia oxidativa e regulação de uma variedade de processos fisiológicos. A disfunção mitocondrial é a principal causa de uma série de doenças metabólicas e neurodegenerativas. Mitocôndrias intactas são fundamentais para o seu bom funcionamento. A enzima citrato synthase é localizada na matriz mitocondrial e, portanto, pode ser usada como um marcador de enzima quantitativa de massa mitocondrial intacta. Dado que muitas moléculas e vias que têm funções importantes nas mitocôndrias são altamente conservadas entre humanos e Drosophila,e que uma série de poderosas ferramentas genéticas estão disponíveis em Drosophila, Drosophila serve como um bom sistema de modelo para estudar a função mitocondrial. Aqui, apresentamos um protocolo para a medição rápida e simples da atividade de sintese de citrato no tecido homogeneado de moscas adultas sem isolar mitocôndrias. Este protocolo também é adequado para medir a atividade de sintese de citrato em larvas, células cultivadas e tecidos de mamíferos.

A Figura 1 apresenta um exemplo das curvas cinéticas para a absorção de OD em 412 nm ao longo do tempo obtida usando o ensaio colorítrico da atividade synthase citrato para medir as homogeneas do tecido drosophila thorax de diferentes genótipos. É sabido que o PGC-1α é um regulador mestre da biogênese mitocondrial. Pgc-1α é funcionalmente conservado entre Drosophila e os seres humanos. Drosophila Drosophila RNF34 (dRNF34)...

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A Colorimetric Assay of Citrate Synthase Activity in Drosophila Melanogaster

Apresentamos um protocolo para um ensaio colorirétrico da atividade de sintese de citrato para quantificação de massa mitocondrial intacta no tecido Drosophila homogeneia.

Um ensaio colorimétrico da atividade de sinteta de citrato em Drosophila Melanogaster

Mitochondria play the most prominent roles in cellular metabolism by producing ATP through oxidative phosphorylation and regulating a variety of ...

A drosophila serve como um bom sistema de modelo para estudar a função mitocondrial. Aqui apresentamos um protocolo para medir a atividade de sinthase citrato em tecido homogeneado de moscas adultas. Este protocolo não requer isolamento das mitocôndrias.É rápido e simples e é adequado para medir a atividade de sinthase citrato em larvas, células cultivadas e tecidos mamíferos. Comece coletando moscas adultas para cada amostra, certificando-se de coletar pelo menos amostras triplicadas para cada genótipo. Prepare 500 microliters de tampão de extração gelada com HEPES de 20 mililitros, um EDTA mililitro e 0,1% tritão X-100 em um tubo de ensaio de 1,5 mililitro para cada amostra.Anestesiar as moscas adultas com dióxido de carbono em uma almofada de anestesia. Para isolar os tóraxs, fixá-los com um par de fórceps e isolar os abdômens de mosca cortando ao longo da borda do tórax e abdômen com uma tesoura. Colete os tóraxs de mosca para o ensaio de atividade de sinthase citrato.Transfira 10 tóraxs de mosca adultos para 100 microliters de tampão de extração gelada imediatamente e homogeneize-os com um pilão no gelo. Mantenha as amostras frias homogeneizando por cinco a 10 segundos no gelo, deixando-as sentar no gelo por cinco segundos, repetindo-as até que todos os tecidos sejam completamente homogeneizados. Alíquota 10 microliters de cada amostra homogeneizada em um novo tubo para medição de teor de proteínas, mantendo esses tubos no gelo também.Adicione 400 microliters de tampão de extração gelada a cada amostra restante para um volume total de 500 microliters e pipeta para cima e para baixo suavemente para misturar. Para cada reação, adicione um microliter de diluído lysato celular a 150 microliters da solução de reação recém-preparada. Misture bem afim por tubos suavemente, certificando-se de evitar a formação de bolhas, em seguida, use um leitor de placas para medir a absorvância em 412 nanômetros a cada 10 a 30 segundos durante quatro minutos a 25 graus Celsius.Plote os dados como absorvância ao longo do tempo e, em seguida, calcule a inclinação para a porção linear da curva. Por fim, divida a taxa de reação ou inclinação pela concentração de proteínas amostrais para normalizar a atividade de sinthase citrato. Foi hipótese de que o knockdown de dRNF34 no músculo Drosophila aumentaria a atividade de sintetizador mitocondrial enquanto o knockdown de dPGC-1 reverteria esse aumento.Estabeleceu-se uma taxa enzimática linear inicial para cada ensaio;as inclinações das linhas de tendência representam as taxas de reação máxima que são equivalentes às atividades de sinthase citrato maximal dos diferentes genótipos. As atividades máximas de sinthase citrato foram calculadas a partir das curvas cinéticas e normalizadas pela concentração proteica. Os resultados demonstraram que a atividade de synthase dos tóraxes-mosca realmente aumentou com o knockdown dRNF34 específico do músculo e o aumento foi revertido por knockdown dPGC-1 específico para músculos.Ao homogeneizar a amostra, é importante virar o tubo e verificar o homogeneizado para ter certeza de que não há coágulos e que os tecidos do tubo estão completamente homogeneizados. Após a coleta da amostra, todos os tratamentos amostrais devem ser realizados no gelo. O ensaio de atividade de sinthase citrato é usado para quantificar massa mitocondrial intacta.A quantificação adequada da massa mitocondrial intacta é muito importante para avaliar a função mitocondrial.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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Um ensaio de clivagem de peptídeo Fluorogenic para triagem de atividade proteolítica: aplicações para coronavirus spike ativação de proteína

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Measuring Caspase Activity Using a Fluorometric Assay or Flow Cytometry

Medindo a atividade da caspase usando um ensaio fluorométrico ou citometria de fluxo

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Smartphone as an Analytical Device to Quantify Protein Using Bradford Assay

RGBradford: Protein Quantitation with a Smartphone Camera

An Alternative Approach to Protein Quantification by Bradford Assay Using a Smartphone (Video) | JoVE

RGBradford: Quantificação de proteínas com uma câmera de smartphone

Protein quantitation is an essential procedure in life sciences research. Amongst several other methods, the Bradford assay is one of the most used. ...