Name: a colorimetric assay of citrate synthase activity in drosophila melanogaster
Uploaded: 2020-01-16T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Colorimetric Assay of Citrate Synthase Activity in Drosophila Melanogaster at JoVE.com

Эта работа была поддержана грантами От Национального фонда естественных наук Китая (31401013 и 31471010), Научно-технической комиссии муниципалитета Шанхая, Шанхайской программы Пуцзян (14PJ1405900) и Фонда естественных наук Шанхай (19ЗР14446400).

1. Колориметрический цитрат Синтаза Деятельности Анализ для D. melanogaster16
<ol><li>Соберите десять взрослых мух для каждого образца. Соберите хотя бы тройные образцы для каждого генотипа.</li>
	<li>Подготовьте 500 кЛ ледяного буфера экстракции, содержащего 20 мМ HEPES (pH 7.2), 1 мМ EDTA и 0,1% ...

<ol>
	<li>Yee, C., Yang, W., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intrinsic+apoptosis+pathway+mediates+the+pro-longevity+response+to+mitochondrial+ROS+in+C.+elegans.">The intrinsic apoptosis pathway mediates the pro-longevity response to mitochondrial ROS in C. elegans.</a> Cell. 157 (4), 897-909 (2014).</li><li>Sarasija, S., Norman, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gamma-Secretase+Independent+Role+for+Presenilin+in+Calcium+Homeostasis+Impacts+Mitochondrial+Function+and+Morphology+in+Caenorhabditis+elegans.">A gamma-Secretase Independent Role for Presenilin in Calcium Homeostasis Impacts Mitochondrial Function and Morphology in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 201 (4), 1453-1466 (2015).</li><li>Oxenoid, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architecture+of+the+mitochondrial+calcium+uniporter.">Architecture of the mitochondrial calcium uniporter.</a> Nature. 533 (7602), 269-273 (2016).</li><li>Hekimi, S., Wang, Y., Noe, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+ROS+and+the+Effectors+of+the+Intrinsic+Apoptotic+Pathway+in+Aging+Cells:+The+Discerning+Killers!.">Mitochondrial ROS and the Effectors of the Intrinsic Apoptotic Pathway in Aging Cells: The Discerning Killers!.</a> Frontiers in Genetics. 7, 161 (2016).</li><li>Kim, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+Biosynthesis+Coordinates+a+Mitochondrial-to-Cytosolic+Stress+Response.">Lipid Biosynthesis Coordinates a Mitochondrial-to-Cytosolic Stress Response.</a> Cell. 166 (6), 1539-1552 (2016).</li><li>Wang, Y., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+and+longevity+in+animals:+Untangling+the+knot.">Mitochondrial dysfunction and longevity in animals: Untangling the knot.</a> Science. 350 (6265), 1204-1207 (2015).</li><li>Ray, A., Martinez, B. A., Berkowitz, L. A., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction,+oxidative+stress,+and+neurodegeneration+elicited+by+a+bacterial+metabolite+in+a+C.+elegans+Parkinson's+model.">Mitochondrial dysfunction, oxidative stress, and neurodegeneration elicited by a bacterial metabolite in a C. elegans Parkinson's model.</a> Cell Death &amp; Disease. 5, e984 (2014).</li><li>Tronstad, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+and+quantification+of+cellular+mitochondrial+morphology+and+content.">Regulation and quantification of cellular mitochondrial morphology and content.</a> Current Pharmaceutical Design. 20 (35), 5634-5652 (2014).</li><li>Wiegand, G., Remington, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Citrate+synthase:+structure,+control,+and+mechanism.">Citrate synthase: structure, control, and mechanism.</a> Annual Review of Biophysics and Biophysical Chemistry. 15, 97-117 (1986).</li><li>Lopez-Lluch, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calorie+restriction+induces+mitochondrial+biogenesis+and+bioenergetic+efficiency.">Calorie restriction induces mitochondrial biogenesis and bioenergetic efficiency.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (6), 1768-1773 (2006).</li><li>MacInnis, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superior+mitochondrial+adaptations+in+human+skeletal+muscle+after+interval+compared+to+continuous+single-leg+cycling+matched+for+total+work.">Superior mitochondrial adaptations in human skeletal muscle after interval compared to continuous single-leg cycling matched for total work.</a> Journal of Physiology. 595 (9), 2955-2968 (2017).</li><li>Gillen, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Twelve+Weeks+of+Sprint+Interval+Training+Improves+Indices+of+Cardiometabolic+Health+Similar+to+Traditional+Endurance+Training+despite+a+Five-Fold+Lower+Exercise+Volume+and+Time+Commitment.">Twelve Weeks of Sprint Interval Training Improves Indices of Cardiometabolic Health Similar to Traditional Endurance Training despite a Five-Fold Lower Exercise Volume and Time Commitment.</a> PLoS One. 11 (4), e0154075 (2016).</li><li>Mukherjee, S., Basar, M. A., Davis, C., Duttaroy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+functional+similarities+and+divergences+between+Drosophila+Spargel/dPGC-1+and+mammalian+PGC-1+protein.">Emerging functional similarities and divergences between Drosophila Spargel/dPGC-1 and mammalian PGC-1 protein.</a> Frontiers in Genetics. 5, 216 (2014).</li><li>Mukherjee, S., Duttaroy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spargel/dPGC-1+is+a+new+downstream+effector+in+the+insulin-TOR+signaling+pathway+in+Drosophila.">Spargel/dPGC-1 is a new downstream effector in the insulin-TOR signaling pathway in Drosophila.</a> Genetics. 195 (2), 433-441 (2013).</li><li>Diop, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PGC-1/Spargel+Counteracts+High-Fat-Diet-Induced+Obesity+and+Cardiac+Lipotoxicity+Downstream+of+TOR+and+Brummer+ATGL+Lipase.">PGC-1/Spargel Counteracts High-Fat-Diet-Induced Obesity and Cardiac Lipotoxicity Downstream of TOR and Brummer ATGL Lipase.</a> Cell Reports. 10 (9), 1572-1584 (2015).</li><li>Rera, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+longevity+and+tissue+homeostasis+by+the+Drosophila+PGC-1+homolog.">Modulation of longevity and tissue homeostasis by the Drosophila PGC-1 homolog.</a> Cell Metabolism. 14 (5), 623-634 (2011).</li><li>Wei, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNF34+modulates+the+mitochondrial+biogenesis+and+exercise+capacity+in+muscle+and+lipid+metabolism+through+ubiquitination+of+PGC-1+in+Drosophila.">RNF34 modulates the mitochondrial biogenesis and exercise capacity in muscle and lipid metabolism through ubiquitination of PGC-1 in Drosophila.</a> Acta Biochimica et Biophysica Sinica (Shanghai). 50 (10), 1038-1046 (2018).</li><li>Tennessen, J. M., Barry, W. E., Cox, J., Thummel, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+studying+metabolism+in+Drosophila.">Methods for studying metabolism in Drosophila.</a> Methods. 68 (1), 105-115 (2014).</li><li>Bosco, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+oxygen+concentration+and+pressure+on+Drosophila+melanogaster:+oxidative+stress,+mitochondrial+activity,+and+survivorship.">Effects of oxygen concentration and pressure on Drosophila melanogaster: oxidative stress, mitochondrial activity, and survivorship.</a> Archives of Insect Biochemistry and Physiology. 88 (4), 222-234 (2015).</li></ol>

Метаболические исследования с использованием Drosophila в качестве модели должны принимать во внимание генетический фон, диета, и запас обслуживания мух18. Чтобы избежать воздействия различных генетических фонов на измерение активности цитрата синтаза, различные штаммы <...

Митохондрии наиболее известны как органеллы, производящие энергию в большинстве эукариотических организмов, которые производят энергетическую валюту, АТФ, через цикл трикарбоксилевой кислоты (т.е. цикл Кребса) и окислительного фосфорилирования. Митохондрии также находятся играть важную роль во многих других физиологических процессов, таких как регулирование апоптоза1, Ca 2 "гомеостаз2,3, реактивные виды окисления (ROS) поколения4, и эндоплазмический ретикулум (ER)-стресс ответ5. Митохондриальная дисфункция может повлиять на любой орган в организме в любом возрасте и является основной причиной метаболических, связанных со старением6,и нейродегенеративных заболеваний7. Нетронутые митохондрии механистически связаны с митохондриальной функцией. Таким образом, надлежащая количественная оценка нетронутой митохондриальной массы очень важна для оценки митохондриальной функции8. Цитрат синтазы, ограничивающий скорость фермента в первой ступени цикла трикарбоксилевой кислоты9, локализуется в митохондриальной матрицы в эукариотических клетках, и, таким образом, может быть использован в качестве количественного маркера для присутствия нетронутой митохондриальной массы9,10. Активность цитрата синтазы также может быть использована в качестве фактора нормализации для нетронутых митохондриальных белков11,12.
Плодовая муха, Drosophila melanogaster, является отличной моделью системы для изучения митохондриальной функции, так как многие молекулы и пути, которые играют ключевую роль в митохондриях эволюционно сохранены от Drosophila к людям13,14,15. Здесь мы представляем протокол для быстрого и простого метода измерения активности цитрата синтазы с помощью колористического анализа в ткани Drosophila гомогенатов16 в формате 96 скважин. В цитрат синтазы деятельности анализ, цитрат синтазы в ткани Drosophila гомогената катализации реакции оксалататата с ацетил коэнзим а (ацетил КоА) для формирования цитрат CoA-SH и H. CoA-SH впоследствии реагирует с 5,5'-дитиобис-(2-нитробензойной кислоты) (DTNB) для создания цветного продукта, 2-нитро-5-тиобензоат (TNB), который может быть легко измерен спектрофотометрически на 412 нм. Активность цитрата синтаза может быть отражена скоростью производства цвета.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid (HEPES)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V900477</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (TRIZMA Base)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V900483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetyl-CoA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithio-bis-nitrobenzoic acid (DTNB)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V900106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxaloacetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O4126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pellet pestle</td>
			<td>Sangon</td>
			<td>F619072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pellet pestle motor</td>
			<td>Tiangen</td>
			<td>OSE-Y10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>Eon</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein BCA Assay kit</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>P0010S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>WPI</td>
			<td>14124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sangon</td>
			<td>A110694-0100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a colorimetric assay of citrate synthase activity in drosophila melanogaster

Митохондрии играют наиболее заметную роль в клеточном метаболизме, производя АТФ через окислительную фосфорилирование и регулируя различные физиологические процессы. Митохондриальная дисфункция является основной причиной ряда метаболических и нейродегенеративных заболеваний. Intact митохондрии имеют решающее значение для их надлежащего функционирования. Фермент цитрат синтазы локализован в митохондриальной матрицы и, таким образом, может быть использован в качестве количественного маркера фермента нетронутой митохондриальной массы. Учитывая, что многие молекулы и пути, которые имеют важные функции в митохондриях, очень сохраняются между людьми и дрозофилой,и что массив мощных генетических инструментов доступны в Drosophila, Drosophila служит хорошей модельной системой для изучения митохондриальной функции. Здесь мы представляем протокол для быстрого и простого измерения активности цитрата синтазы в ткани гомегената от взрослых мух без изоляции митохондрий. Этот протокол также подходит для измерения активности цитрата синтаза в личинках, культивированных клетках и тканях млекопитающих.

Рисунок 1 представляет собой пример кинетических кривых для абсорбции OD на 412 нм с течением времени, полученных с помощью цитрат ажиотажной активности колористовой анализ для измерения drosophila грудной ткани ткани гомогенаты различных генотипов. Хо?...

Watch this Scientific Journal Video about A Colorimetric Assay of Citrate Synthase Activity in Drosophila Melanogaster at JoVE.com

A Colorimetric Assay of Citrate Synthase Activity in Drosophila Melanogaster

Мы представляем протокол для колористического асссиса цитратной активности синтазы для количественной оценки нетронутой митохондриальной массы в гомогенатах ткани Дрозофилы.

Колориметрический анализ цитратсинстого действия в Drosophila Меланогастер

Mitochondria play the most prominent roles in cellular metabolism by producing ATP through oxidative phosphorylation and regulating a variety of ...

Дрозофила служит хорошей модельной системой для изучения митохондриальной функции. Здесь мы представляем протокол для измерения активности цитрат синтазы в ткани гомогената от взрослых мух. Этот протокол не требует изоляции митохондрий.Он быстрый и простой, и он подходит для измерения активности цитрат синтазы в личинках, культурных клеток и тканей млекопитающих. Начните с сбора взрослых мух для каждого образца, убедившись, что собрать по крайней мере тройной образцы для каждого генотипа. Подготовь 500 микролитров ледяного буфера экстракции с 20 миллимолярной HEPES, одной миллимолярной ЭДТА и 0,1%тритон X-100 в 1,5-миллилитровой пробирке для каждого образца.Обезболивать взрослых мух углекислым газом на анестезии площадку. Чтобы изолировать грудную клетку, исправить их с парой типсов и изолировать мухи животы, разрезая вдоль границы грудной клетки и живота с ножницами. Соберите муху грудной клетки для цитрат синтазы деятельности анализа.Передача 10 взрослых мух грудной клетки на 100 микролитров ледяной буфер извлечения немедленно и гомогенизировать их с пестиком на льду. Держите образцы холодными, гомогенизируя в течение пяти-десяти секунд на льду, позволяя им сидеть на льду в течение пяти секунд, а затем повторять, пока все ткани полностью гомогенизированы. Aliquot 10 микролитров каждого однородного образца в новую трубку для измерения содержания белка, сохраняя эти трубки на льду, а также.Добавьте 400 микролитров ледяного буфера экстракции к каждому оставшемуся образцу общим объемом 500 микролитров и пипеток вверх и вниз осторожно, чтобы перемешать. Для каждой реакции добавьте один микролитер разбавленной клетки лизай до 150 микролитров свежеприготовленного реакционной раствора. Тщательно смешайте, аккуратно трубы, убедившись, чтобы избежать образования пузыря, а затем использовать считыватель пластин для измерения поглощения на 412 нанометров каждые 10 до 30 секунд в течение четырех минут при 25 градусов по Цельсию.Участок данных в качестве поглощения с течением времени, а затем рассчитать наклон для линейной части кривой. Наконец, разделите скорость реакции или наклон по концентрации белка образца для нормализации активности цитратной синтазы. Было выдвинуто предположение, что нокдаун dRNF34 в мышцах Drosophila увеличит митохондриальный цитрат синтазы деятельности в то время как нокдаун dPGC-1 бы обратить вспять это увеличение.Для каждого анализа была установлена начальная линейная энзиматическая скорость; склоны трендовых линий представляют собой максимальные скорости реакции, эквивалентные максимальной цитратной синтазной деятельности различных генотипов. Максимальный цитрат синтазы деятельности были рассчитаны из кинетических кривых и нормализуется концентрации белка. Результаты показали, что активность синтазы мухи грудной клетки действительно увеличилось с мышцами конкретных dRNF34 нокдаун и увеличение было обращено на мышцы конкретных dPGC-1 нокдаун.При гомогенизации образца, важно, чтобы наконечник трубки и проверить гомогенат, чтобы убедиться, что Есть нет сгустков и что ткани в трубке полностью гомогенизированы. После сбора проб все пробные обработки должны проводиться на льду. Анализ активности цитрат-синтазы используется для количественной оценки нетронутой митохондриальной массы.Правильная количественная оценка нетронутой митохондриальной массы очень важна для оценки митохондриальной функции.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Colorimetric Assay of Citrate Synthase Activity in Drosophila Melanogaster

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Обнаружение рН-зависимой активности<em&gt; Кишечная палочка</em&gt; Сопровождающий HdeB<em&gt; In Vitro</em&gt; и<em&gt; В Vivo</em

Bacteria are frequently exposed to environmental changes, such as alterations in pH, temperature, redox status, light exposure or mechanical force. Many ...

A Fluorescence-based Assay of Phospholipid Scramblase Activity

Флуоресцентным на основе анализа фосфолипида Scramblase деятельности

Scramblases translocate phospholipids across the membrane bilayer bidirectionally in an ATP-independent manner. The first scramblase to be identified and ...

A Colorimetric Method for Measuring Iron Content in Plants

Колориметрический метод измерения содержания железа в растениях

Iron, one of the most important micronutrients in living organisms, is involved in basic processes, such as respiration and photosynthesis. Iron content ...

Mapping Metabolism: Monitoring Lactate Dehydrogenase Activity Directly in Tissue

Сопоставление метаболизма: Мониторинг активности лактатдегидрогеназы непосредственно в ткани

Mapping enzymatic activity in space and time is critical for understanding the molecular basis of cell behavior in normal tissue and disease. In situ ...

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

In Vitro Assay для обнаружения деятельности трансферазы tRNA изопентенил

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved ...

Caffeine Extraction, Enzymatic Activity and Gene Expression of Caffeine Synthase from Plant Cell Suspensions

Экстракции кофеина, ферментативной активности и экспрессии генов синтетазы кофеин из суспензий клеток растений

Caffeine (1,3,7-trimethylxanthine) is a purine alkaloid present in popular drinks such as coffee and tea. This secondary metabolite is regarded as a ...

A Fluorogenic Peptide Cleavage Assay to Screen for Proteolytic Activity: Applications for coronavirus spike protein activation

Fluorogenic пептид расщепления Assay экран для протеолитической активности: приложения для коронавирус Спайк активации белка

Enveloped viruses such as coronaviruses or influenza virus require proteolytic cleavage of their fusion protein to be able to infect the host cell. Often ...

Continuous Fluorescence-Based Endonuclease-Coupled DNA Methylation Assay to Screen for DNA Methyltransferase Inhibitors

Непрерывный флуоресцентный анализ метилирования ДНК на основе эндонуклеазы для скрининга ингибиторов ДНК-метилтрансферазы

DNA methylation, a form of epigenetic gene regulation, is important for normal cellular function. In cells, proteins called DNA methyltransferases (DNMTs) ...

Measuring Caspase Activity Using a Fluorometric Assay or Flow Cytometry

Измерение активности каспазы с помощью флуорометрического анализа или проточной цитометрии

The activation of cysteine proteases, known as caspases, remains an important process in multiple forms of cell death. Caspases are critical initiators ...

Smartphone as an Analytical Device to Quantify Protein Using Bradford Assay

RGBradford: Protein Quantitation with a Smartphone Camera

An Alternative Approach to Protein Quantification by Bradford Assay Using a Smartphone (Video) | JoVE

RGBradford: Количественное определение белка с помощью камеры смартфона

Protein quantitation is an essential procedure in life sciences research. Amongst several other methods, the Bradford assay is one of the most used. ...