Name: a colorimetric assay of citrate synthase activity in drosophila melanogaster
Uploaded: 2020-01-16T12:00:00
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Este trabajo fue apoyado por las subvenciones de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (31401013 y 31471010), la Comisión de Ciencia y Tecnología del Municipio de Shanghái, el Programa Pujiang de Shanghái (14PJ1405900), y la Fundación de Ciencias Naturales de Shanghái (19ZR1446400).

1. Ensayo de actividad de citrato colorimétrico de la síntesis para D. melanogaster16
<ol><li>Recoger diez moscas adultas para cada muestra. Recoger al menos muestras triplicadas para cada genotipo.</li>
	<li>Preparar 500 ml de tampón de extracción en frío-hielo que contenga 20 mM de HEPES (pH a 7,2), EDTA de 1 mM y trífino X-100 del 0,1% en un tubo de ensayo de 1,5 ml para cada muestra.</li>
	<li>Anestetiza las moscas adultas conCO2 en una almohadilla de anestesia y a?...

<ol>
	<li>Yee, C., Yang, W., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intrinsic+apoptosis+pathway+mediates+the+pro-longevity+response+to+mitochondrial+ROS+in+C.+elegans.">The intrinsic apoptosis pathway mediates the pro-longevity response to mitochondrial ROS in C. elegans.</a> Cell. 157 (4), 897-909 (2014).</li><li>Sarasija, S., Norman, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gamma-Secretase+Independent+Role+for+Presenilin+in+Calcium+Homeostasis+Impacts+Mitochondrial+Function+and+Morphology+in+Caenorhabditis+elegans.">A gamma-Secretase Independent Role for Presenilin in Calcium Homeostasis Impacts Mitochondrial Function and Morphology in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 201 (4), 1453-1466 (2015).</li><li>Oxenoid, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architecture+of+the+mitochondrial+calcium+uniporter.">Architecture of the mitochondrial calcium uniporter.</a> Nature. 533 (7602), 269-273 (2016).</li><li>Hekimi, S., Wang, Y., Noe, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+ROS+and+the+Effectors+of+the+Intrinsic+Apoptotic+Pathway+in+Aging+Cells:+The+Discerning+Killers!.">Mitochondrial ROS and the Effectors of the Intrinsic Apoptotic Pathway in Aging Cells: The Discerning Killers!.</a> Frontiers in Genetics. 7, 161 (2016).</li><li>Kim, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+Biosynthesis+Coordinates+a+Mitochondrial-to-Cytosolic+Stress+Response.">Lipid Biosynthesis Coordinates a Mitochondrial-to-Cytosolic Stress Response.</a> Cell. 166 (6), 1539-1552 (2016).</li><li>Wang, Y., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+and+longevity+in+animals:+Untangling+the+knot.">Mitochondrial dysfunction and longevity in animals: Untangling the knot.</a> Science. 350 (6265), 1204-1207 (2015).</li><li>Ray, A., Martinez, B. A., Berkowitz, L. A., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction,+oxidative+stress,+and+neurodegeneration+elicited+by+a+bacterial+metabolite+in+a+C.+elegans+Parkinson's+model.">Mitochondrial dysfunction, oxidative stress, and neurodegeneration elicited by a bacterial metabolite in a C. elegans Parkinson's model.</a> Cell Death &amp; Disease. 5, e984 (2014).</li><li>Tronstad, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+and+quantification+of+cellular+mitochondrial+morphology+and+content.">Regulation and quantification of cellular mitochondrial morphology and content.</a> Current Pharmaceutical Design. 20 (35), 5634-5652 (2014).</li><li>Wiegand, G., Remington, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Citrate+synthase:+structure,+control,+and+mechanism.">Citrate synthase: structure, control, and mechanism.</a> Annual Review of Biophysics and Biophysical Chemistry. 15, 97-117 (1986).</li><li>Lopez-Lluch, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calorie+restriction+induces+mitochondrial+biogenesis+and+bioenergetic+efficiency.">Calorie restriction induces mitochondrial biogenesis and bioenergetic efficiency.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (6), 1768-1773 (2006).</li><li>MacInnis, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Superior+mitochondrial+adaptations+in+human+skeletal+muscle+after+interval+compared+to+continuous+single-leg+cycling+matched+for+total+work.">Superior mitochondrial adaptations in human skeletal muscle after interval compared to continuous single-leg cycling matched for total work.</a> Journal of Physiology. 595 (9), 2955-2968 (2017).</li><li>Gillen, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Twelve+Weeks+of+Sprint+Interval+Training+Improves+Indices+of+Cardiometabolic+Health+Similar+to+Traditional+Endurance+Training+despite+a+Five-Fold+Lower+Exercise+Volume+and+Time+Commitment.">Twelve Weeks of Sprint Interval Training Improves Indices of Cardiometabolic Health Similar to Traditional Endurance Training despite a Five-Fold Lower Exercise Volume and Time Commitment.</a> PLoS One. 11 (4), e0154075 (2016).</li><li>Mukherjee, S., Basar, M. A., Davis, C., Duttaroy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+functional+similarities+and+divergences+between+Drosophila+Spargel/dPGC-1+and+mammalian+PGC-1+protein.">Emerging functional similarities and divergences between Drosophila Spargel/dPGC-1 and mammalian PGC-1 protein.</a> Frontiers in Genetics. 5, 216 (2014).</li><li>Mukherjee, S., Duttaroy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spargel/dPGC-1+is+a+new+downstream+effector+in+the+insulin-TOR+signaling+pathway+in+Drosophila.">Spargel/dPGC-1 is a new downstream effector in the insulin-TOR signaling pathway in Drosophila.</a> Genetics. 195 (2), 433-441 (2013).</li><li>Diop, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PGC-1/Spargel+Counteracts+High-Fat-Diet-Induced+Obesity+and+Cardiac+Lipotoxicity+Downstream+of+TOR+and+Brummer+ATGL+Lipase.">PGC-1/Spargel Counteracts High-Fat-Diet-Induced Obesity and Cardiac Lipotoxicity Downstream of TOR and Brummer ATGL Lipase.</a> Cell Reports. 10 (9), 1572-1584 (2015).</li><li>Rera, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+longevity+and+tissue+homeostasis+by+the+Drosophila+PGC-1+homolog.">Modulation of longevity and tissue homeostasis by the Drosophila PGC-1 homolog.</a> Cell Metabolism. 14 (5), 623-634 (2011).</li><li>Wei, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNF34+modulates+the+mitochondrial+biogenesis+and+exercise+capacity+in+muscle+and+lipid+metabolism+through+ubiquitination+of+PGC-1+in+Drosophila.">RNF34 modulates the mitochondrial biogenesis and exercise capacity in muscle and lipid metabolism through ubiquitination of PGC-1 in Drosophila.</a> Acta Biochimica et Biophysica Sinica (Shanghai). 50 (10), 1038-1046 (2018).</li><li>Tennessen, J. M., Barry, W. E., Cox, J., Thummel, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+studying+metabolism+in+Drosophila.">Methods for studying metabolism in Drosophila.</a> Methods. 68 (1), 105-115 (2014).</li><li>Bosco, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+oxygen+concentration+and+pressure+on+Drosophila+melanogaster:+oxidative+stress,+mitochondrial+activity,+and+survivorship.">Effects of oxygen concentration and pressure on Drosophila melanogaster: oxidative stress, mitochondrial activity, and survivorship.</a> Archives of Insect Biochemistry and Physiology. 88 (4), 222-234 (2015).</li></ol>

Los estudios metabólicos utilizando Drosophila como modelo deben tener en cuenta los antecedentes genéticos, la dieta y el mantenimiento de las acciones de las moscas18. Para evitar los efectos de diferentes fondos genéticos en la medición de la actividad citrato sintasa, diferentes cepas de Drosophila deben ser retrocruzadas a la cepa de control durante 10 generaciones. El trasfondo genético de todas las cepas Drosophila utilizadas en nuestros experimentos es w...

Las mitocondrias son más conocidas como los orgánulos que producen energía en la mayoría de los organismos eucariotas, que producen la moneda energética, ATP, a través del ciclo del ácido tricarboxílico (es decir, ciclo Krebs) y fosforilación oxidativa. Mitocondrias también se encuentran para desempeñar un papel importante en una gran cantidad de otros procesos fisiológicos, tales como la regulación de la apoptosis1, Ca2 + homeostasis2,3, especies de oxidación reactiva (ROS) generación4, y retículo endoplasmático (ER)-respuesta de estrés5. La disfunción mitocondrial puede afectar a cualquier órgano del cuerpo a cualquier edad y es una causa primaria de enfermedadmeólica, relacionada con el envejecimiento6,y enfermedades neurodegenerativas7. Las mitocondrias intactas están relacionadas mecanicísticamente con la función mitocondrial. Por lo tanto, la cuantificación adecuada de la masa mitocondrial intacta es muy importante para evaluar la función mitocondrial8. Citrato sintasa, una enzima limitante de velocidad en el primer paso del ciclo de ácido tricarboxílico9, se localiza en la matriz mitocondrial dentro de las células eucariotas, y por lo tanto se puede utilizar como un marcador cuantitativo para la presencia de masa mitocondrial intacta9,10. La actividad de la citrato sintasa también se puede utilizar como factor de normalización para las proteínas mitocondriales intactas11,12.
La mosca de la fruta, Drosophila melanogaster, es un excelente sistema modelo para el estudio de la función mitocondrial, ya que muchas moléculas y vías que desempeñan papeles fundamentales en las mitocondrias se conservan evolutivamente desde Drosophila a los seres humanos13,14,15. Aquí, presentamos un protocolo para un método rápido y simple para la medición de la actividad citrato sintasa mediante un ensayo colorimétrico en tejido Drosophila homogeneiza16 en un formato de placa de 96 pozos. En el ensayo de actividad de citrato sintasa, citrato sintasa en el tejido drosofílico homogeneizado cataliza la reacción de oxaloacetato con acetil coenzima A (acetil CoA) para formar el citrato CoA-SH y H+. CoA-SH reacciona posteriormente con 5,5'-dithiobis-(2-ácido nitrobenzoico) (DTNB) para generar un producto de color, 2-nitro-5-tiobenzoato (TNB), que se puede medir fácilmente espectrofotométricamente a 412 nm. La actividad de la citrato sintasa puede reflejarse en la tasa de producción de color.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid (HEPES)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V900477</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (TRIZMA Base)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V900483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetyl-CoA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithio-bis-nitrobenzoic acid (DTNB)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V900106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxaloacetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O4126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pellet pestle</td>
			<td>Sangon</td>
			<td>F619072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pellet pestle motor</td>
			<td>Tiangen</td>
			<td>OSE-Y10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>Eon</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein BCA Assay kit</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>P0010S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>WPI</td>
			<td>14124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sangon</td>
			<td>A110694-0100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a colorimetric assay of citrate synthase activity in drosophila melanogaster

Las mitocondrias desempeñan el papel más prominente en el metabolismo celular mediante la producción de ATP a través de la fosforilación oxidativa y la regulación de una variedad de procesos fisiológicos. La disfunción mitocondrial es una causa primaria de una serie de enfermedades metabólicas y neurodegenerativas. Las mitocondrias intactas son fundamentales para su correcto funcionamiento. La enzima citrato sintasa se localiza en la matriz mitocondrial y por lo tanto se puede utilizar como un marcador de enzima cuantitativa de la masa mitocondrial intacta. Dado que muchas moléculas y vías que tienen funciones importantes en las mitocondrias están altamente conservadas entre los seres humanos y Drosophila,y que una serie de potentes herramientas genéticas están disponibles en Drosophila, Drosophila sirve como un buen sistema modelo para el estudio de la función mitocondrial. Aquí, presentamos un protocolo para la medición rápida y sencilla de la actividad citrato sintasa en el tejido homogeneizado de moscas adultas sin aislar las mitocondrias. Este protocolo también es adecuado para medir la actividad de la citrato sintasa en larvas, células cultivadas y tejidos de mamíferos.

La Figura 1 presenta un ejemplo de las curvas cinéticas para la absorbancia de la OD a 412 nm con el tiempo obtenidas utilizando el ensayo colorimétrico de actividad citrato sintasa para medir los homogeneios del tejido del tórax Drosophila de diferentes genotipos. Es bien sabido que el PGC-1 es un regulador maestro de la biogénesis mitocondrial. El PGC-1se conserva funcionalmente entre Drosophila y los humanos. Drosophila El RN...

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A Colorimetric Assay of Citrate Synthase Activity in Drosophila Melanogaster

Presentamos un protocolo para un ensayo colorimétrico de la actividad citrato sintasa para la cuantificación de la masa mitocondrial intacta en el tejido Drosophila homogeneatos.

Un ensayo colorimétrico de la actividad de citrato sintasa en Drosophila Melanogaster

Mitochondria play the most prominent roles in cellular metabolism by producing ATP through oxidative phosphorylation and regulating a variety of ...

Drosophila sirve como buen sistema modelo para el estudio de la función mitocondrial. Aquí presentamos un protocolo para medir la actividad de la citrato sintasa en el tejido homogeneizar a partir de moscas adultas. Este protocolo no requiere aislamiento de las mitocondrias.Es rápido y simple y es adecuado para medir la actividad de la citrato sintasa en larvas, células cultivadas y tejidos de mamíferos. Comience por recoger moscas adultas para cada muestra, asegurándose de recoger al menos muestras triplicadas para cada genotipo. Preparar 500 microlitros de tampón de extracción en frío con HEPES de 20 milimolares, un EDTA mililolar y 0,1% tritón X-100 en un tubo de ensayo de 1,5 mililitros para cada muestra.Anesthetizar las moscas adultas con dióxido de carbono en una almohadilla de anestesia. Para aislar los tórax, fijarlos con un par de fórceps y aislar los abdomens de la mosca cortando a lo largo del borde del tórax y el abdomen con un par de tijeras. Recoger los tórax mosca para el ensayo de actividad de citrato sintasa.Transfiera 10 tójees de mosca adulta a 100 microlitros de tampón de extracción de hielo en frío inmediatamente y homogeneicelos con un pestillo sobre hielo. Mantenga las muestras frías homogeneizando durante cinco a 10 segundos sobre hielo, dejándolas reposar sobre hielo durante cinco segundos, luego repitiendo hasta que todos los tejidos estén completamente homogeneizados. Aliquot 10 microlitros de cada muestra homogeneizada en un nuevo tubo para la medición del contenido de proteínas, manteniendo estos tubos en hielo también.Agregue 400 microlitros de tampón de extracción en frío helado a cada muestra restante para un volumen total de 500 microlitros y pipetear hacia arriba y hacia abajo suavemente para mezclar. Para cada reacción, agregue un microlitro de lito celular diluido a 150 microlitros de la solución de reacción recién preparada. Mezcle bien pipeteando suavemente, asegurándose de evitar la formación de burbujas, luego utilice un lector de placas para medir la absorbancia a 412 nanómetros cada 10 a 30 segundos durante cuatro minutos a 25 grados centígrados.Trazar los datos como absorbancia a lo largo del tiempo y, a continuación, calcular la pendiente de la parte lineal de la curva. Por último, divida la tasa de reacción o la pendiente por la concentración de proteína de muestra para normalizar la actividad de la citrato sintasa. Se hipotetizó que el derribo de dRNF34 en el músculo Drosophila aumentaría la actividad de citrato mitocondrial sintasa mientras que la eliminación de dPGC-1 revertiría este aumento.Se estableció una tasa enzimática lineal inicial para cada ensayo;las pendientes de las líneas de tendencia representan las tasas máximas de reacción que son equivalentes a las actividades máximas de citrato sintasa de los diferentes genotipos. Las actividades máximas de citrato sintasa se calcularon a partir de las curvas cinéticas y se normalizaron por concentración de proteínas. Los resultados demostraron que la actividad sintasa de los tórax de mosca de hecho aumentó con el knockdown dRNF34 específico del músculo y el aumento fue revertido por el knockdown dPGC-1 específico del músculo.Al homogeneizar la muestra, es importante inclinar el tubo y comprobar el homogeneizado para asegurarse de que no hay coágulos y que los tejidos en el tubo están completamente homogeneizados. Después de la recolección de muestras, todos los tratamientos de muestra deben realizarse sobre hielo. El ensayo de actividad de la citrato sintasa se utiliza para cuantificar la masa mitocondrial intacta.La cuantificación adecuada de la masa mitocondrial intacta es muy importante para evaluar la función mitocondrial.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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An Alternative Approach to Protein Quantification by Bradford Assay Using a Smartphone (Video) | JoVE

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