Name: thawing, culturing, and cryopreserving drosophila cell lines
Uploaded: 2019-04-16T15:00:00
Duration: 7 min 57 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines at JoVE.com

ونحن نشكر "المعاهد الوطنية للصحة" (المعاهد الوطنية للصحة جائزة P40OD010949) ومجتمع البحوث للاستفادة من الموارد الحمض النووي/ناقل/خلية melanogaster دال- الفني في دجرك مختلف.

1-ذوبان الجليد وإحياء خطوط الخلايا المجمدة المورفولوجية
<ol><li>تعقيم هود بمسح سطح العمل مع الإيثانول 70%. الاستغناء عن 5 مل الوسط المناسب (الجدول 1) إلى 25 سم2 ر-قارورة (T-25).</li>
	<li>إزالة كريوفيال/أمبولي من سائل ن2 أو الثلج الجاف. مسح كريوفيال مع الإيثانول 70%، بعناية ترخي وفتح في أمبولي.</li>
	<li>استخدام ماصة باستور، سحب 1 مل من درجة حرارة الغرفة (RT) وسائط الإعلام من قارورة T-25. إضافة وسائط الإعلام ببطء إلى كريوفيال وتخلط برفق إذابة الخلايا المجمدة، وضمان أن لا تجاوز تعليق خلية.</li>
	<li>نقل وحدة التخزين بأكملها من تعليق خلية المذابة من أمبولي في قارورة T-25. تكرار لضمان نقل تعليق خلية تماما.</li>
	<li>في قارورة في حاضنة 25 درجة مئوية، السماح للخلايا بتسوية والالتزام على الأقل 2 حاء دراسة الخلايا تحت مجهر للتأكد من أن معظم خلايا استقروا على سطح المتنامية. بلطف قم بإزالة الوسائط القديمة واستبدالها مع 5 مل وسائط جديدة. العودة قارورة في الحاضنة.</li>
	<li>اليوم التالي، بلطف قم بإزالة الوسائط القديمة واستبدالها مع 5 مل وسائط جديدة. العودة الثقافة للحاضنة.</li>
</ol>2-ذوبان الجليد وإحياء خطوط الخلايا المجمدة المورفولوجية (البديل)
<ol><li>في غطاء عقيمة، إذابة الخلايا قبل ريسوسبيندينج بيليه المجمدة مع مل 1 RT وسائل الإعلام. نقل كل تعليق خلية المذابة في أنبوب مخروطي 15 مل.</li>
	<li>بيليه الخلايا باستخدام الطرد المركزي في س 1,000 ز لأدنى 5 تجاهل المادة طافية وريسوسبيند بيليه الخلية في 5 مل وسائط جديدة.</li>
	<li>نقل وحدة التخزين بأكملها من تعليق خلية في قارورة T-25 واحتضان ثقافة عند 25 درجة مئوية.</li>
	<li>ح 1 إلى 2 في وقت لاحق، دراسة الخلايا تحت المجهر التأكد من أن معظم خلايا استقروا على سطح المتنامية. اليوم التالي، تحل محل وسائل الإعلام القديمة مع 5 مل من وسائط الإعلام الجديدة والعودة الثقافة للحاضنة.</li>
</ol>3-سوبكولتورينج شبه ملتصقة خلايا تزرع في لوحات الثقافة 100 مم
<ol><li>تعقيم هود بالمسح مع الإيثانول 70%. جلب المواد المعقمة سوبكولتورينج في غطاء محرك السيارة، بما في ذلك زجاجات وسائط الإعلام والماصات والمعونة ماصة ولوحات الثقافة.</li>
	<li>دراسة مورفولوجيا والتقاء الثقافة تحت مجهر. البحث عن علامات واضحة للتلوث ميكرورجانيسمال في الثقافة. تحديد ما إذا كانت الخلايا على استعداد لأن باساجيد، تستند إلى خصائص الثقافة: الخلية كثافة ومضاعفة الوقت، بما في ذلك آخر مرة أنهم كانوا سوبكولتوريد.</li>
	<li>في حالة ظهور الثقافة عالية روافد (الشكل 1)، تحديد كثافة الخلية. في هود العقيمة، إزاحة الخلايا من سطح المتزايد بيبيتينج يصل إلى 10 مل الوسط من اللوحة والاستغناء عن ذلك عبر الخلايا. كرر عدة مرات، ضمان لا لخلق الرغوة، حتى يصبح السطح تزايد واضح. تحديد كثافة الخلية باستخدام هيموسيتوميتير أو عداد جسيمات تلقائي (الباب 5، الشكل 3). ثقافة فرعية الخلايا إذا كانت كثافة الخلية ما بين 5 106 و 1 × 107 خلايا/مل. ملاحظة: هل عدم ثقافة فرعية خطوط الخلايا المورفولوجية لكثافة خلية أدناه 1 × 106 خلايا/مل.</li>
	<li>
تمييع تعليق خلية تبعاً لذلك باستخدام وسيلة مناسبة لتركيز بذر نهائي على الأقل 1 × 106 خلايا/مل.
	<ol>
<li>باساجينج والصيانة الروتينية، إضافة وحدة تخزين مناسبة لتعليق خلية لوحدة تخزين محددة سلفا من المتوسطة في صفيحة ثقافة جديدة لتحقيق كثافة الخلية البذر المطلوب.</li>
		<li>لرفع مستوى ثقافة، نقل جميع تعليق خلية في قارورة كبيرة. تمييع تعليق خلية لكثافة الخلايا المطلوب مع حجم مناسب من المتوسط. توزيع كميات متساوية من تعليق خلية المخفف للوحات الجديدة. يقلل هذا الأسلوب الاختلافات في كثافة الخلايا بين لوحات.</li>
	</ol>
</li>
	<li>تغطية وتسمية اللوحات مع الأحرف الأولى من اسم المشغل، تاريخ، نسبة تقسيم، كثافة الخلية بذر، معرف خط الخلية، ووسائط الإعلام ومرور عدد وأي إضافات الوسائط مثل المضادات الحيوية.</li>
	<li>وضع اللوحات في وعاء من بلاستيك، والعودة المربع للحاضنة. ملاحظة: الجدول 3 قوائم السفن الثقافة استخداماً لاستزراع المورفولوجية خلية خطوط وأحجام العمل المرتبطة بها.</li>
</ol>4-إزاحة الخلايا ملتصقة نمت في لوحات الثقافة 100 مم
<ol><li>نقل جميع المتوسطة من اللوحة إلى قارورة معقمة جديدة. حفظ في المتوسط.</li>
	<li>شطف الخلايا بإضافة 1 مل من 0.05% التربسين-يدتا ببطء اللوحة. دوامة بلطف لضمان الحل التربسين الذي يغطي سطح النمو الكامل. تجاهل الحل التربسين.</li>
	<li>إضافة مل 1 0.05% التربسين-يدتا برفق اللوحة. احتضان لوحة عند 25 درجة مئوية بين 3−10 دقيقة في حين رصد علامات مرئية لفصل طبقة الخلية وانزلاق قبالة السطح المتزايد.</li>
	<li>إضافة 9 مل الوسط المحفوظة إلى لوحة لوقف نشاط التربسين. مزيج من تعليق خلية ننأى بكتل الخلية. بمجرد قد تم فكها كافة الخلايا، السطح المتزايدة سوف يكون واضحا. ملاحظة: استخدام إنزيمات الهضم مثل التربسين الإيدز في باساجينج خطوط الخلايا ملتصقة بشدة. التربسين هو خليط البروتياز غالباً ما تستمد من بنكرياس الخنزير ويتوفر تجارياً في درجات مختلفة من النقاء.</li>
</ol>5-دليل خلية عد استخدام الخلية نويباور عد الشريحة
<ol><li>إعداد الشرائح هيموسيتوميتير وساترة بمسح السطح بالكحول 70%.</li>
	<li>مزيج تعليق خلية والاستغناء عن 15 ميليلتر من تعليق خلية في حافة مخدد هيموسيتوميتير (الشكل 3A) لملء الدائرة الأولى هيموسيتوميتير. ملء الدائرة الثانية هيموسيتوميتير. سوف يوجه تعليق خلية في قاعة فرز الأصوات بعمل شعري.</li>
	<li>استخدام 10 × الهدف المجهر، عد الخلايا داخل منطقة2 1 ملم في وسط الشبكة ملزمة بخطوط متوازية (الشكل 3،د). لتجنب تكرار العد، عد الخلايا التي تراكب أعلى وحدود الأيسر، ولكن لا الخلايا التي تعبر الحدود اليمنى والسفلي من المربعات2 200 ميكرومتر. عد بين الخلايا 100−200. تكرار العد مع الدائرة الثانية.</li>
	<li>حساب متوسط تهمتين وتحديد كثافة الخلية وفقا للصيغة التالية: الخلية الكثافة (خلايا/مل) = عدد الخلايا متوسط (ن1 + ن22) × 104. ملاحظة: بقاء الخلية عبر كنسبة مئوية خلايا قابلة للحياة مجموع الخلايا. لتحديد صلاحية الخلية، مزيج تعليق خلية مع حجم متساو تريبان الأزرق (0.4%) الحل قبل عد الخلايا يدوياً أو تلقائياً. لا تبت الخلايا الحية الصبغة، بينما الخلايا الميتة وسوف تكون الملون الأزرق.</li>
</ol>6-تجميد خطوط الخلايا المورفولوجية
<ol><li>التحقق من البيانات الموروثة مورفولوجية صحية، والنمو، وعدم وجود تلوث. حصاد الثقافات من منتصف مرحلة النمو أواخر سجل (الخطوة 3، 3 أو المادة 4). للعديد من خطوط الخلايا المورفولوجية ، تقريبا بين 4 × 106 خلايا/مل إلى 8 × 106 خلايا/مل.</li>
	<li>نقل تعليق الخلية بأكملها في أنبوب مخروطي 15 مل أو 50 مل. جمع الخلايا باستخدام الطرد المركزي في 1,000 س ز لمدة 5 دقائق وتجاهل المادة طافية.</li>
	<li>ريسوسبيند بيليه الخلية في وحدة تخزين المتوسطة التجميد (الجدول 4) سوف تؤدي إلى كثافة خلية الأخيرة على الأقل 4 × 107 خلايا/مل.</li>
	<li>إضافة dropwise المقدار المناسب من كريوبروتيكتانت ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس]) إلى تعليق خلية مثل أن التركيز [دمس] النهائي هو 10%. المزيج بلطف بتعليق خلية.</li>
	<li>عناية الاستغناء عن 0.5 مل تعليق خلية في مختبرين كريوفيالس قبل المسمى (~ 2 × 107 خلايا/فيال). ضع امبولات في حاوية تجميد مليئة الايزوبروبانول (الشكل 4 أ). نقل الحاوية التجميد في ثلاجة-80 درجة مئوية بين عشية وضحاها درجة الحرارة من كريوفيالس الانخفاض ببطء (-1 درجة مئوية/دقيقة) بدرجة حرارة الثلاجة.</li>
	<li>إخراج كريوفيالس المجمدة وسرعة إرفاقها بالعصي (الشكل 4 باء). إدراج قصب يحتوي على كريوفيالس في اسطوانة (الشكل 4). وبدلاً من ذلك، ضع كريوفيالس المجمدة داخل مربع يبرد قبل تجميد (الشكل 4). مخزن تجميد كريوفيالس في الطور السائل من مجمدات2 ن (4E الشكل،و). ملاحظة: عند استخدام تجميد وسائل الإعلام التي تحتوي على [دمس]، تأخير لمدة تصل إلى 30 دقيقة في الرايت لا تضر بالخلايا.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Baum, B., Cherbas, L., Dahmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila:+Methods+and+Protocols.">Drosophila: Methods and Protocols.</a> Methods in Molecular Biology. 420, 391-424 (2008).</li><li>Cherbas, L., Gong, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lines.">Cell lines.</a> Methods. 68 (1), 74-81 (2014).</li><li>Luhur, A., Klueg, K. M., Zelhof, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+and+working+with+Drosophila+cell+cultures:+Current+challenges+and+opportunities.">Generating and working with Drosophila cell cultures: Current challenges and opportunities.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: Developmental Biology. , e339 (2018).</li><li>Franz, A., Brunner, E., Basler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+genome-modified+Drosophila+cell+lines+using+SwAP.">Generation of genome-modified Drosophila cell lines using SwAP.</a> Fly (Austin). 11 (4), 303-311 (2017).</li><li>Housden, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+potential+drug+targets+for+tuberous+sclerosis+complex+by+synthetic+screens+combining+CRISPR-based+knockouts+with+RNAi.">Identification of potential drug targets for tuberous sclerosis complex by synthetic screens combining CRISPR-based knockouts with RNAi.</a> Science Signaling. 8 (393), r9 (2015).</li><li>Kunzelmann, S., Bottcher, R., Schmidts, I., Forstemann, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comprehensive+Toolbox+for+Genome+Editing+in+Cultured+Drosophila+melanogaster+Cells.">A Comprehensive Toolbox for Genome Editing in Cultured Drosophila melanogaster Cells.</a> G3 (Bethesda). 6 (6), 1777-1785 (2016).</li><li>Ishizu, H., Sumiyoshi, T., Siomi, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+CRISPR-Cas9+system+for+genome+editing+in+cultured+Drosophila+ovarian+somatic+cells.">Use of the CRISPR-Cas9 system for genome editing in cultured Drosophila ovarian somatic cells.</a> Methods. 126, 186-192 (2017).</li><li>Echalier, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Drosophila Cells in Culture. , (1997).</li><li>Echalier, G., Perrimon, N., Mohr, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Drosophila cells in culture. 2nd edition. , (2017).</li><li>Cherbas, L., Cherbas, P., Roberts, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Drosophila: A practical approach. 10, 319-346 (1998).</li><li>Schneider, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lines+derived+from+late+embryonic+stages+of+Drosophila+melanogaster.">Cell lines derived from late embryonic stages of Drosophila melanogaster.</a> Journal of Embryollgy and Experimental Morphology. 27 (2), 353-365 (1972).</li><li>Echalier, G., Ohanessian, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolement,+en+cultures+in+vitro,+de+lignees+cellulaires+diploides+de+Drosophila+melanogaster.">Isolement, en cultures in vitro, de lignees cellulaires diploides de Drosophila melanogaster.</a> Comptes rendus de l'Acad&#233;mie des Sciences. 268, 1771-1773 (1969).</li><li>Ui, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Newly+established+cell+lines+from+Drosophila+larval+CNS+express+neural+specific+characteristics.">Newly established cell lines from Drosophila larval CNS express neural specific characteristics.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology &#8722; Animal. 30A (4), 209-216 (1994).</li><li>Ui, K., Ueda, R., Miyake, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lines+from+imaginal+discs+of+Drosophila+melanogaster.">Cell lines from imaginal discs of Drosophila melanogaster.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology. 23 (10), 707-711 (1987).</li><li>Currie, D. A., Milner, M. J., Evans, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+growth+and+differentiation+in+vitro+of+leg+and+wing+imaginal+disc+cells+from+Drosophila+melanogaster.">The growth and differentiation in vitro of leg and wing imaginal disc cells from Drosophila melanogaster.</a> Development. 102, 805-814 (1988).</li><li>Niki, Y., Yamaguchi, T., Mahowald, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+stable+cell+lines+of+Drosophila+germ-line+stem+cells.">Establishment of stable cell lines of Drosophila germ-line stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (44), 16325-16330 (2006).</li><li>Saito, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+regulatory+circuit+for+piwi+by+the+large+Maf+gene+traffic+jam+in+Drosophila.">A regulatory circuit for piwi by the large Maf gene traffic jam in Drosophila.</a> Nature. 461 (7268), 1296-1299 (2009).</li><li>Simcox, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+genetic+method+for+establishing+Drosophila+cell+lines+unlocks+the+potential+to+create+lines+of+specific+genotypes.">Efficient genetic method for establishing Drosophila cell lines unlocks the potential to create lines of specific genotypes.</a> PLoS Genetics. 4 (8), e1000142 (2008).</li><li>Sumiyoshi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+l(3)mbt+leads+to+acquisition+of+the+ping-pong+cycle+in+Drosophila+ovarian+somatic+cells.">Loss of l(3)mbt leads to acquisition of the ping-pong cycle in Drosophila ovarian somatic cells.</a> Genes &amp; Development. 30 (14), 1617-1622 (2016).</li><li>Dequeant, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+progenitor+cell+signatures+by+time-series+synexpression+analysis+during+Drosophila+embryonic+cell+immortalization.">Discovery of progenitor cell signatures by time-series synexpression analysis during Drosophila embryonic cell immortalization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (42), 12974-12979 (2015).</li><li>Young, L., Sung, J., Stacey, G., Masters, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Mycoplasma+in+cell+cultures.">Detection of Mycoplasma in cell cultures.</a> Nature Protocols. 5 (5), 929-934 (2010).</li><li>Shields, G., Sang, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+medium+for+culture+of+Drosophila+embryonic+cells.">Improved medium for culture of Drosophila embryonic cells.</a> Drosophila Information Service. 52, 161 (1977).</li><li>Freshney, R. I., Capes-Davis, A., Gregory, C., Przyborski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Culture of animal cells : a manual of basic technique and specialized applications. Seventh edition. edn. , (2016).</li><li>Lee, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+copy+number+evolution+in+Drosophila+cell+lines.">DNA copy number evolution in Drosophila cell lines.</a> Genome Biology. 15 (8), R70 (2014).</li></ol>

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

المورفولوجية خلية الثقافات هي الكواشف الأولية للشاشات المستندة إلى خلية إنتاجية عالية. ويكمل استعمالها أيضا المجراة في البحوث الجينية بتوفير عدد سكان متجانسة من الخلايا مناسبة للكيمياء الحيوية واختبار نيات المعدلة وراثيا قبل الحقن في الذباب وبيولوجيا الخلايا، والفحص المجهري، وفي الآونة الأخيرة الخلية الجسمية الوراثي السريع التلاعب جينوم التحرير1،2،3،،من89،10.
البقاء والانتعاش المجمدة المورفولوجية الخلايا حساس لتقلبات جذرية حتى في درجات الحرارة المنخفضة. دجرك يخزن خطوط الخلايا المجمدة في الطور السائل (-196 درجة مئوية) ن2 وينقلهم في الثلج الجاف (-78.50 درجة مئوية). ينبغي عدم نقل امبولات المجمدة التي تنقل في الثلج الجاف إلى السائل ن2 أو ثلاجة-80 درجة مئوية للتخزين. بدلاً من ذلك، ينبغي أن تكون إذابة الخلايا المجمدة وريسيديد في كثافة عالية خلية وقت ممكن عند الوصول (المادة 1 من البروتوكول) ومثقف لأغراضها (القسم 3 من البروتوكول). إذا لم تستخدم خطوط الخلية فورا لإجراء تجارب عليها، cryopreserved الخلايا يجب أن تكون الأسطر (المادة 6 من البروتوكول) حتى تكون جاهزة للاستخدام.
بعض خطوط الخلايا، مثل خطوط مل-BG2-c2 و Ras بحاجة إلى عدة أيام للتعافي من آثار يجري إحياؤها من الدولة كريوبريسيرفيد. كمية كبيرة من الحطام الخلوية ترافق هذه خطوط الخلايا في الأيام القليلة الأولى بعد ذوبان الجليد. بقي دون عائق، سيتم استرداد الخلايا وتتكاثر. وقد تم العديد من خطوط الخلايا المورفولوجية في دجرك تكييف تنمو في M3 تقوم وسائل الإعلام22. لخطوط الخلايا التي تكون بطيئة للتعافي من آثار ذوبان الجليد، قد يكون من المفيد استخدام وسائل مكيفة. يحتمل مكيفة الوسائط تحتوي على عوامل النمو يفرز من الخلايا إلى وسائل الإعلام التي قد تشجع على الانتعاش وانتشار الخلايا بعد ذوبان الجليد.
تتبع خطوط الخلايا عموما منحنى نمو نمطية المكونة من مرحلة انتقالية ومرحلة الأسى، مرحلة الهضبة ومرحلة تدهور. تنتشر العديد من خطوط الخلايا المورفولوجية في السجل-مرحلة النمو عند أنها تستزرع في كثافة بين 1 × 106 و 1 × 107 خلايا/مل عند 25 درجة مئوية. فمن الضروري أن خطوط الخلية هي باساجيد أن هم دائماً في مرحلة النمو الأسى.
التقاء الثقافة، كنسبة مئوية، يصف نمو المساحة التي تغطيها خلايا. التقاء خلية لخط خلية يعتمد على خلية الشكل والحجم. خطوط الخلية متميزة لها مورفولوجيس مختلفة وخصائص الانضمام. كنتيجة لذلك، قد يكون خطوط الخلايا المختلفة في التقاء مماثلة تقريبا كثافة الخلايا متميزة إلى حد كبير (الشكل 1). قد لا يكون التقاء الثقافة مؤشرا مثاليا باساجينج الثقافات الخلية المورفولوجية لخطوط الخلايا المورفولوجية لا تزال تتكاثر أما بواسطة تتراكم فوق بعضها البعض البؤر أو في تعليق حتى بعد سطح النمو غطت (الشكل 1). ومع ذلك، المستخدمين ذوي الخبرة مع خطوط الخلايا المحددة قد غالباً ما تستخدم التقاء كدليل مرئي سريع لعند إلى ثقافة فرعية.
وفي حين أنه من الممكن أن تنمو المورفولوجية خطوط المحيطة RT بين 19−25 درجة مئوية، لا ينصح لتقلبات درجة الحرارة المحيطة قد تؤثر على معدل انتشار. يوصي باستخدام حاضنة مخصصة 25 درجة مئوية. لا تحتاج حاضنة للثقافات الخلية المورفولوجية لتيسير تبادل الغازات CO2 أن لا تستخدم المورفولوجية خلية ثقافة الإعلام CO2 للتخزين المؤقت. الرطوبة داخل الحاضنة لاستزراع خطوط الخلية عاملاً هاما لا يمكن تجاهلها عند استزراع الخلايا في لوحات. اعتماداً على نوع حاضنة وبيئة العمل، قد يكون من الضروري لوضع كوب الماء المعقم داخل الحاضنة. للتقليل من تبخر وسائل الإعلام، استخدام T-قارورة مغلقة أو تخزين لوحات الثقافة في وعاء من بلاستيك محكم مختومة بينما داخل الحاضنة.
من المهم وضع جدول زمني سوبكولتورينج خطوط الخلايا المورفولوجية . لتقدير مدى اتساق مراقبة ومعدل النمو، أنها ملائمة لثقافة فرعية في نسبة حتى هندسية (تقسيم نسبة 1:2, 1:4, 1:8). على سبيل المثال، يمكن تقسيم لوحة المتلاقية 10 مل من الخلايا Kc167 في 8 × 106 خلايا/مل في نسبة 1:8 لتحقيق كثافة بذر 1 × 106 خلايا/مل (1.25 مل تعليق خلية مخفف إلى 8.75 مل وسائط جديدة). ح 72، يتوقع أن تنتشر بكثافة 8 × 106 خلايا/مل، نظراً لمضاعفة وقت ح 24 الثقافات Kc167. ولذلك نسبة تقسيم عازمة على تسهيل روتين ثقافة فرعية ملائمة لتصل إلى مرتين في أسبوع، ضمان أن الخلايا تستزرع دائماً في مرحلة سجل المتسارع النمو. وهذا يسمح لجدول منتظم سوبكولتورينج الخلايا حيث يكون الوقت لالتقاء لا قصيرة جداً أو طويلة جداً. إذا كان الوقت لالتقاء قصيرة جداً، هي سوبكولتوريد الخلايا في خلية أقل كثافة (أعلى نسبة الانقسام). وبالمثل، إذا كان الوقت للتوصل إلى التقاء طويل جداً، هي سوبكولتوريد الخلايا في كثافة خلية أعلى (انخفاض نسبة الانقسام). من المهم أن نلاحظ أن معظم خطوط الخلية المورفولوجية حساسة جداً لخلية منخفض الكثافة (< 1 × 105 خلايا/مل)، وفي الخلايا التي لا يكاد تتكاثر وقد يموت في نهاية المطاف.
تختلف خطوط الخلايا المورفولوجية في خصائص النمو والتشكل. كنتيجة لذلك، قد يكون خطوط الخلايا مع خصائص مميزة التعامل معها بشكل مختلف. معظم خطوط الخلية المورفولوجية شبه ملتصقة. في انخفاض كثافة الخلية، أنها تلتزم بأقوى سطح النمو وعندما تصبح الثقافة المتلاقية، الخلايا تصبح أقل ملتصقة وفصلها بسهولة. يسهل هذا التغيير التدريجي في الخلية الانضمام سوبكولتورينج سهلة لخطوط الخلايا المورفولوجية الأكثر استخداماً (شنايدر، خطوط كيه سي والقرص إيماجينال وخطوط الجهاز العصبي المركزي) كما أنه يسمح للمشغل ببساطة التخلي عن وسائل الإعلام على مدى المونولاير خلية لإزاحة لهم من على سطح النمو عند الثقافة كثيفة. للخطوط التي ملتصقة السطحية مثل خط جرثومة الإناث غمد جسدية الجذعية/المبيض (fGS/برمجيات المصدر المفتوح) وخطوط Ras، الضروري لاحتضان الخلايا في التربسين لمدة قصيرة للمساعدة في فصل الخلايا من سطح النمو.
وتشمل الإضافات وسائل الإعلام لمعظم خطوط الخلية المورفولوجية مصل العجل الجنين (FCS). الأنسولين واستخراج يطير الكبار (FEX) مطلوبة من أجل بعض بنود محددة. FEX يحتوي على غير معرف مكونات أساسية لنمو خطوط محددة القرص imaginal اليرقات وخطوط الخلايا المبيض البالغين. تستعد دجرك، ويجعل FEX الكبار المتاحة المستمدة من 1 أسبوع من العمر أوريغون-R-مودينكودي الذباب (رريد: BDSC_25211) في مختبرين 2.5 مل و 10 مل. دجرك أيضا يوفر إرشادات حول صغيرة الحجم إعداد FEX على موقعها < https://dgrc.bio.indiana.edu/include/file/additions_to_medium.pdf>. ومع ذلك، إعداد FEX، تستغرق وقتاً طويلاً ويتطلب كمية كبيرة من الذباب الكبار.
تجميد خطوط الخلية المورفولوجية يوفر الوقت والمواد الكاشفة لصيانة خطوط الخلايا لا في الاستخدام الفوري. للواسمات يتحقق عن طريق تجميد الخلايا (-1 درجة مئوية/دقيقة) ببطء إلى-80 درجة مئوية في متوسط تحتوي على [دمس]، عامل كريوبروتيكتيفي. خطوة التبريد البطيء أمر حاسم لنجاح تجميد. في ثلاجة-80 درجة مئوية، يتم تبريد ampule الخلايا بمعدل قدرة-1 درجة مئوية/دقيقة عند وضعها في حاوية تجميد مليئة بالكحول. بدءاً من 25 درجة مئوية درجة الحرارة المحيطة، سوف يستغرق ما يصل إلى 2 س لدرجة الحرارة في امبولات تصل إلى-80 درجة مئوية. من المستحسن ترك امبولات لتجميد بين عشية وضحاها.
يجب سرعة ثم نقل امبولات المجمدة في الطور السائل من النيتروجين للتخزين فترات طويلة. في درجة حرارة الغرفة، وسوف يسخن كريوفيال سرعة في حوالي 10 درجة مئوية/دقيقة وسوف يتعرض للخطر في البقاء أعلاه-50 درجة مئوية23. للاحتفاظ بالنقل سريع، التعامل مع امبولات على دفعات صغيرة لتقليل التعرض لدرجة الحرارة المحيطة. وبدلاً من ذلك، وضع كريوفيالس المجمدة على الثلج الجاف بينما كان يستعد لنقلها إلى سائل ن2- إذا لم يتوفر النيتروجين السائل، قد يتم تخزين الخلايا في ثلاجة-80 درجة مئوية، على الرغم من أن تنطوي على خطر تدهور كبير على مر الزمن.
كثافة الخلية أمر بالغ الأهمية لنعد الناجحة، وإحياء خطوط الخلايا اللاحقة. وبصفة عامة، تجميد خلية جديدة ينبغي تجميد خطوط لإنشاء الأولية (امبولات 1−3) حالما يتوفر فائض في الخلايا. بمجرد قد تم خط الخلية مثقف كذلك ستابلي، ينبغي إنشاء مخزون مجمدة من امبولات 10−20. ثم يتم إذابة هذا المخزون للتحقق للانتعاش بعد تجميد الخلايا والجدوى، بعد ذلك يتم نشر للتجريب أو لاستبدال المخزون عندما ينخفض عدد امبولات الأرصدة المجمدة أقل من خمس. وأخيراً، من المهم التحقق من أن الخلايا المذابة الاحتفاظ بخصائص الأسهم الأبوية كما هي معروفة خطوط الخلايا تتطور3،24.
وفي الختام، يقدم هذا المقال تمهيدي للعمل مع الثقافات الخلية المورفولوجية بتوفير المعلومات الأساسية عن مختلف خطوط، وأفضل الممارسات، والبروتوكولات السمعي البصري على المعالجة الأساسية لخطوط الخلايا المورفولوجية . هو يعني هذا المورد موجوداً لتخفيف مقدمة للعمل مع مثقف المورفولوجية الخلايا بسلاسة واستكمال الأدلة التدريبية الموجودة في أي مختبر البحوث.

استخدام المورفولوجية استزراع الخلايا يكمل المجراة في الطيران التحليل الجيني ويخدم كأداة تحقيق الابتدائي لمعالجة العديد من المسائل البيولوجية الأساسية1،،من23. وتوفر خطوط الخلايا المورفولوجية السكان متجانسة فريدة من الخلايا المشتقة من مصادر مختلفة من الأنسجة مع الخلفيات الوراثية المتميزة. خطوط الخلية مناسبة للعديد من التطبيقات بما في ذلك تعبير الجينات المعدلة وراثيا، وعلم الجينوم، transcriptomics، البروتيوميات، جميع، إنتاجية عالية الحمض النووي الريبي التدخل ([رني]) الشاشات وبيولوجيا الخلايا والفحص المجهري. الأهم من ذلك، يسهل استخدام المورفولوجية خلية ثقافة توصيف الردود الزمانية المباشرة للمنبهات المعروفة. وعلاوة على ذلك، المورفولوجية خلية ثقافة قابلة للجينوم كريسبر-Cas9 والتحرير، مما يجعل من السهل نسبيا لإنشاء خطوط الخلايا الجديدة مع الجينوم محددة التعديلات4،،من56، 7.
بمثابة مركز الموارد الجينومية المورفولوجية (دجرك) مركز المستودع وتوزيع لخطوط الخلايا المورفولوجية . أحد الأهداف دجرك مساعدة أعضاء المجتمع للبحث في استخدام موارد الثقافة الخلية المورفولوجية . ويعرض هذا المقال البروتوكولات الأساسية للتعامل مع خطوط الخلايا المورفولوجية . وهو يكمل الموارد الموجودة لمساعدة الباحثين تصبح مريحة مع التعامل مع الثقافات الخلية المورفولوجية وتحقيق مستوى استقلال في تلك التجارب1،2،8،9 ،10.
خطوط الخلية المورفولوجية الأكثر استخداماً: خطوط شنايدر11، Kc16712، قرص imaginal ميتسوبيشي/مياكي والجهاز العصبي المركزي (CNS) خطوط13،14، ميلنر مختبر القرص imaginal خطوط 15،16،خطوط الخلايا المبيض البالغين17، و خطوط رأس18 (الجدول 1). خطوط شنايدر و Kc167 خطوط الخلية جميع الأغراض العامة لاستخدامها في الكيمياء الحيوية والجينات المعدلة وراثيا المؤتلف، وعكس شاشات الجينية. خطوط المختبرية (ML) ميتسوبيشي/مياكي مستمدة من أقراص imaginal اليرقات أو الجهاز العصبي المركزي (CNS) وأنها كانت مفيدة للدراسات المتعلقة نيوروسيكريشن وتنظيم النسخ، وتجهيز الجيش الملكي النيبالي. وكانت خطوط القرص ميلنر (CME) هامة لدراسة توصيل الإشارة. تبقى خطوط الخلايا fGS/برمجيات المصدر المفتوح المستمدة من المبايض الكبار متحولة الكواشف هامة لدراسة التأثير غير الترميز البيولوجيا رنا الصغيرة في الخلية الجرثومية الصيانة والتمايز17،19. وأخيراً، خطوط رأس فريدة من نوعها لأن هذه خطوط الخلايا المشتقة من الأجنة اكتوبيكالي الإعراب عن السرطاني Ras. أنهم على التوقيع النسخي خلايا السلائف العضلات، وتعرب عن piRNA النشطة الآلية20. الأخيرة مراجعة المقالات وفصول الكتب تغطي الطلبات المقدمة من هذه الخطوط الخليوي شعبية مع مزيد من التفاصيل2،3،9.
يمكن سوبكولتوريد جميع خطوط الخلية هذه والمجمدة. هناك متطلبات مختلفة طفيفا ولكن هاما لكيفية المحافظة على كل خط الخلية ومستعدة لتجميد. على سبيل المثال، خطوط الخلايا متميزة تتطلب وسائل الإعلام المختلفة والمكملات الغذائية (الجدول 1). الخطوط تختلف أيضا في خصائص الالتزام السطحية، مورفولوجيس (الشكل 1 و الشكل 2)، النمط الوراثي ومضاعفة الوقت (الجدول 2). نحن الحاضر البروتوكولات الأساسية، وتسليط الضوء على الاختلافات فريدة من نوعها للتعامل مع خطوط الخلية المورفولوجية المختلفة المستخدمة على نطاق واسع.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:899px;" width="898">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:354px;">100 mm tissue culture plates</td>
			<td style="width:252px;">Corning&#160;</td>
			<td align="right" style="width:123px;">430167</td>
			<td style="width:171px;">Subculturing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:354px;">25 cm2 T-flask</td>
			<td style="width:252px;">Corning&#160;</td>
			<td align="right" style="width:123px;">430168</td>
			<td>Subculturing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:354px;">35HC Liquid Nitrogen Storage Tank</td>
			<td style="width:252px;">Taylor-Wharton</td>
			<td style="width:123px;">35HCB-11M</td>
			<td>Cryopreservation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:354px;">Automated Cell counter</td>
			<td style="width:252px;">BIO-RAD</td>
			<td style="width:123px;">TC20</td>
			<td>Counting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:354px;">Bactopeptone</td>
			<td style="width:252px;">BD BioSciences</td>
			<td style="width:123px;">211677</td>
			<td>Medium additions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:354px;">Counting Slides</td>
			<td style="width:252px;">BIO-RAD</td>
			<td style="width:123px;">145-0011</td>
			<td>Counting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:354px;">Cryovial 1 mL</td>
			<td style="width:252px;">Greiner&#160;</td>
			<td align="right" style="width:123px;">123263</td>
			<td>Cryopreservation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:354px;">DMSO</td>
			<td style="width:252px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">D5879</td>
			<td>Cryopreservation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:354px;">Freezing Box</td>
			<td style="width:252px;">Nalgene</td>
			<td style="width:123px;">5029-0909</td>
			<td>Cryopreservation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:354px;">Freezing Container</td>
			<td style="width:252px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">15-350-50</td>
			<td>Cryopreservation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:354px;">Hematocytometer</td>
			<td style="width:252px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">#0267110</td>
			<td>Counting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:354px;">Human Insulin</td>
			<td style="width:252px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:123px;">I9278</td>
			<td>Medium additions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:354px;">Hyclone CCM3 media</td>
			<td style="width:252px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:123px;">SH30061.03</td>
			<td>Medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:354px;">Hyclone Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:252px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:123px;">SH30070.03</td>
			<td>Medium additions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Glutamic acid potassium salt monohydrate</td>
			<td style="width:252px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:123px;">G1149</td>
			<td>Medium additions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:354px;">L-Glutathione reduced</td>
			<td style="width:252px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:123px;">G6013</td>
			<td>Medium additions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:354px;">Potassium Bicarbonate</td>
			<td style="width:252px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:123px;">237205</td>
			<td>Medium additions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:354px;">Select Yeast Extract&#160;</td>
			<td style="width:252px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:123px;">Y1000</td>
			<td>Medium additions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:354px;">Shields and Sang&#39;s M3 Insect medium</td>
			<td style="width:252px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:123px;">S8398</td>
			<td>Medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:354px;">Trpsin-EDTA (0.05 %), phenol red&#160;</td>
			<td style="width:252px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">25300054</td>
			<td>Subculturing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:354px;">Trypan Blue (0.4%)</td>
			<td style="width:252px;">BIO-RAD</td>
			<td style="width:123px;">145-0013</td>
			<td>Counting</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

thawing, culturing, and cryopreserving drosophila cell lines

وهناك حاليا أكثر من 160 خطوط الخلية المورفولوجية متميزة موزعة حسب مركز الموارد المورفولوجية الجينوم (دجرك). مع هندسة الجينوم، يتوقع العدد خطوط الخلايا رواية زيادة. دجرك يهدف إلى تعريف الباحثين باستخدام خطوط الخلايا المورفولوجية كأداة تجريبية لتكملة ودفع جدول أعمالهم البحثية. وترد الإجراءات المتعلقة بالعمل مع مجموعة متنوعة من خطوط الخلايا المورفولوجية ذات الخصائص المميزة، بما في ذلك البروتوكولات لذوبان الجليد واستزراع كريوبريسيرفينج خطوط الخلايا. الأهم من ذلك، يوضح هذا المنشور أفضل الممارسات اللازمة للعمل مع خطوط الخلايا المورفولوجية التقليل من مخاطر التلوث من الكائنات المجهرية العارض أو من خطوط الخلايا الأخرى. الباحثين الذين أصبحوا على دراية بهذه الإجراءات سيكون قادراً على الخوض في العديد من التطبيقات التي تستخدم الخلايا المورفولوجية مثقف بما في ذلك الكيمياء الحيوية وبيولوجيا الخلايا وعلم الجينوم الوظيفي.

Watch this Scientific Journal Video about Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines at JoVE.com

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

خطوط الخلية المورفولوجية هي الكواشف هامة للبحوث الأساسية والطب الأحيائي على حد سواء. توفر هذه المقالة بروتوكولات لذوبان الجليد، وسوبكولتورينج، ونعد من خطوط الخلايا المورفولوجية المستخدمة عادة لمساعدة الباحثين في إدماج استخدام هذه الكواشف في أبحاثهم.

ذوبان الجليد واستزراع كريوبريسيرفينج خطوط الخلايا المورفولوجية

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...

ستساعد هذه البروتوكولات أي باحث على دمج استخدام خطوط خلايا دروسوفيليا لدفع أو استكمال جدول أعمالهم البحثي. معظم إن لم يكن كل Drosophila الثقافات الخلية إحياء، تتكاثر، والبكاء- الحفاظ جيدا عندما تعامل وفقا لهذه المبادئ التوجيهية. بعد مسح أسفل سطح العمل من غطاء محرك تدفق لارينار مع 70٪ الإيثانول، الاستغناء عن خمسة ملليلتر من المتوسطة المناسبة في 25 سم مربع T-قارورة.مسح حاوية من خط الخلية المجمدة مع 70٪ الإيثانول وتخفيف بعناية وفك الغطاء. باستخدام ماصة باستور، نقل ملليلتر واحد من متوسط درجة حرارة الغرفة من القارورة إلى قارورة التبريد والزجاجة بلطف مزيج لإذابة الخلايا المجمدة. مع الحرص على أن تعليق الخلية لا تجاوز، نقل كامل حجم تعليق الخلية المذاب إلى القارورة وشطف القارورة cryo-مع المتوسطة الطازجة.السماح للخلايا لتسوية إلى الجزء السفلي من قارورة لمدة ساعتين على الأقل في حاضنة درجة مئوية 25. لا تعود الخلايا المجمدة التي تم تعبئتها للسفر مرة أخرى إلى الفريزر ناقص 80 درجة مئوية لفترة طويلة أو في النيتروجين السائل. بدلا من ذلك ذوبان الخلايا في اسرع وقت ممكن.بعد التأكد من التعلق تحت مجهر خفيف ، استبدل المابير بلطف بخمس ملليلترات من الوسط الطازج قبل إعادة القارورة إلى الحاضنة. بدلا من ذلك، بعد ذوبان، ونقل تعليق الخلية في أنبوب مخروطي 15 ملليلتر للطرد المركزي وإعادة تعليق بيليه في خمسة ملليلتر من المتوسطة الطازجة قبل البذر في قارورة T-25 كما أظهرت للتو. لتحديد ما إذا كانت الخلايا جاهزة للمرور ، قم بفحص مورفولوجيا والتقاء الثقافة تحت المجهر.النظر في كثافة الخلايا ومضاعفة الوقت، في المرة الأخيرة كانت الخلايا دون المستزرعة، وأي علامات على تلوث الكائنات الحية الدقيقة في الثقافة. إذا كانت الثقافة تبدو شديدة الالتقاء، استخدم عشرة ملليلترات من الثقافة الفائقة لإزاحة الخلايا بلطف من أسفل لوحة الثقافة وتحديد كثافة الخلايا عن طريق حساب عدد الخلايا القابلة للحياة في تعليق الخلية المفردة الناتجة. الفرعية زراعة الخلايا إذا كانت كثافة الخلية بين خمسة إلى عشرة أضعاف عشر إلى الخلايا السادسة لكل ملليلتر في الوسط المناسب.إضافة في ما لا يقل عن واحد مرات عشر إلى الخلايا السادسة في تركيز المليلتر في لوحة ثقافة جديدة لتحقيق كثافة الخلايا البذر المطلوب. ثم تغطية وتسمية لوحات مع الأحرف الأولى المشغل، والتاريخ، ونسبة الانقسام، وكثافة الخلية البذر، معرف خط الخلية، متوسطة، رقم مرور، وأي إضافات متوسطة مثل المضادات الحيوية، ووضع لوحات في حاوية بلاستيكية لاحتضانها المستمر في الحاضنة 25 درجة مئوية. لطرد الخلايا المرتبطة تشكل 100 ملليمتر ثقافة طبق القاع، أولا نقل كل من عظمى في قارورة معقمة وشطف الخلايا مع إضافة بطيئة من ملليلتر واحد من 0.05٪ التربسين EDTA.دوامة بلطف لضمان أن الحل التربسين يغطي سطح النمو بأكمله قبل التخلص من الحل. بعد ذلك، أضف بلطف 1 إلى 2 ملليلتر من 0.05٪ EDTA الطازجة التربسين إلى لوحة ووضع لوحة في الحاضنة درجة 25 درجة مئوية لمدة ثلاث إلى عشر دقائق. عندما يمكن ملاحظة طبقة الخلية فصل وانزلاق الخروج من السطح المتزايد، ووقف نشاط التربسين مع إضافة تسعة ملليلتر من عظمى المحفوظة وخلط تعليق الخلية جيدا لفصل كتل الخلية.عندما يتم إزاحة جميع الخلايا، فإن السطح المتزايد يكون واضحًا. لحساب الخلايا يدويا باستخدام شريحة العد خلية Neubauer، أولا مسح سطح شريحة مقياس الهيمواي وزلة الغطاء مع 70٪ الكحول. بعد الاختلاط، إضافة 15 ميكرولترات من الخلايا في كل حافة مخدد من قياس الهيموسيتلت لملء كلا الغرف.سيتم سحب تعليق الخلية إلى غرفة العد عن طريق إجراء الشعيرات الدموية. باستخدام هدف المجهر 10x، عد ما بين 100 إلى 200 خلية داخل منطقة مربعة ملليمتر واحد في منتصف الشبكة المقيدة بخطوط متوازية. ثم كرر التعداد مع الغرفة الثانية واستخدام متوسط التهم اثنين لتحديد كثافة الخلية وفقا للصيغة.بالنسبة لـ Drosophila cell-reo-preservation، إعادة تعليق بيليه الخلية في وحدة تخزين من التجمد المتوسط الذي سيؤدي إلى كثافة الخلية النهائية لا تقل عن أربعة أضعاف عشرة إلى الخلايا السابعة لكل ملليلتر. إضافة حجم مناسب من cryo-protectant، ثنائي الفينيل، سلفوكسيد أو DMSO، في تعليق الخلية قطرة الحكمة بحيث تركيز DMSO النهائي هو 10٪، وخلط بلطف تعليق الخلية. المقبل، بعناية إضافة 0.5 ملليلتر aliquots من تعليق الخلية في قوارير التبريد المسمى مسبقا ووضع قوارير التبريد في وعاء تجميد مليئة isopropanol.ثم نقل حاوية التجمد إلى ثلاجة ناقص 80 درجة مئوية خلال الليل للسماح لدرجة حرارة قوارير التبريد لتنخفض ببطء إلى درجة حرارة الفريزر. بعد ذلك، نقل بسرعة قوارير التبريد إلى قصب لإدراجها في علبة النيتروجين السائل. بدلا من ذلك، نقل قوارير التبريد المجمدة في مربع تجميد المبردة قبل التبريد وتخزين قوارير التبريد المجمدة في المرحلة السائلة من ثلاجة النيتروجين.يمكن تحديد التقاء خط الخلية بواسطة المجهر الخفيف. تحتاج خطوط الخلايا المتنامية بسرعة التي تصل إلى التقاء مبكرة إلى أن يتم تمريرها بانتظام ، تصل إلى مرتين في الأسبوع. في المقابل، يمكن تمرير الخلايا بطيئة النمو مرة واحدة على الأقل كل أسبوعين أو أكثر، على الرغم من أن هذه الخلايا تحتاج إلى تغذية المتوسطة الطازجة كل أسبوع.خطوط الخلية المستمدة من مصادر الأنسجة المختلفة تختلف في مورفولوجيا، خصائص الالتزام، متطلبات وسائل الإعلام، وأوقات مضاعفة. بالنسبة للتجارب الكمية، يعد عد الخلايا أمرًا ضروريًا. يمكن عد الخلايا باستخدام مقياس للهيموسيت أو عداد الجسيمات الآلي.التقاء الخلية هو دليل مرئي عن متى إلى ثقافة فرعية للمشغل ذوي الخبرة. ومع ذلك، عد الخلايا يؤدي إلى جدول زمني subcturing يمكن التنبؤ بها ويسهل الكشف عن حالات الشذوذ النمو. كن حذراً واستخدم معدات الحماية المناسبة عند العمل مع النيتروجين السائل.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

يعاير بالسكان خلية الدم لل<em&gt; ذبابة الفاكهة السوداء البطن</em&gt; اليرقة

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila ...

Establishment of Genome-edited Human Pluripotent Stem Cell Lines: From Targeting to Isolation

إنشاء الجينوم تحريره المحفزة الإنسان خطوط الخلايا الجذعية: من استهداف لعزل

Genome-editing of human pluripotent stem cells (hPSCs) provides a genetically controlled and clinically relevant platform from which to understand human ...

Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research

زراعة متعددة القدرات البشرية والعصبية الخلايا الجذعية في نظام زراعة الخلايا المغلقة للبحوث الأساسية وقبل السريرية

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety ...

Imaging of Cell Shape Alteration and Cell Movement in Drosophila Gastrulation Using DE-cadherin Reporter Transgenic Flies

Imaging of Cell Shape Alteration and Cell Movement in Drosophila Gastrulation Using DE-cadherin Reporter Transgenic Flies

التصوير من التعديلات خلية الشكل والحركة الخلية في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; المعيدة عن طريق DE-كادهيرين مراسل الذباب المعدلة وراثيا

Gastrulation is the first set of morphologically dynamic events that occur during the embryonic development of multicellular animals such as Drosophila. ...

Derivation of Stem Cell Lines from Mouse Preimplantation Embryos

اشتقاق خطوط الخلايا الجذعية من الأجنة الجيني الماوس

Mouse embryonic stem cell (mESC) derivation is the process by which pluripotent cell lines are established from preimplantation embryos. These lines ...

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

تشريح وتلطيخ المبايض المورفولوجية الخوادر

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a ...

An Efficient Strategy for Generating Tissue-specific Binary Transcription Systems in Drosophila by Genome Editing

An Efficient Strategy for Generating Tissue-specific Binary Transcription Systems in Drosophila by Genome Editing

استراتيجية فعالة لتوليد النظم الخاصة بالانسجة النسخ ثنائي في المورفولوجية بتحرير الجينوم

Binary transcription systems are powerful genetic tools widely used for visualizing and manipulating cell fate and gene expression in specific groups of ...

In Vitro Assays to Evaluate the Migration, Invasion, and Proliferation of Immortalized Human First-trimester Trophoblast Cell Lines

في المختبر فحوصات تقييم الهجرة، والغزو، وانتشار خطوط الخلايا مخلدة تروفوبلست البشرية في الاثلوث الأول

Cell movement is a critical property of trophoblasts during placental development and early pregnancy. The significance of proper trophoblast migration ...

Culturing and Measuring Fetal and Newborn Murine Long Bones

زراعه وقياس الجنين والوليد العظام الطويلة Murine

Long bones are complex and dynamic structures, which arise from endochondral ossification via a cartilage intermediate. The limited access to healthy ...

Cell-cell Fusion of Genome Edited Cell Lines for Perturbation of Cellular Structure and Function

خلايا خليه الانصهار من الجينوم تحرير خطوط الخلايا لاضطراب الهيكل الخلوي والوظيفة

Life is spatially partitioned within lipid membranes to allow the isolated formation of distinct molecular states inside cells and organelles. Cell fusion ...