ذوبان الجليد واستزراع كريوبريسيرفينج خطوط الخلايا المورفولوجية

ستساعد هذه البروتوكولات أي باحث على دمج استخدام خطوط خلايا دروسوفيليا لدفع أو استكمال جدول أعمالهم البحثي. معظم إن لم يكن كل Drosophila الثقافات الخلية إحياء، تتكاثر، والبكاء- الحفاظ جيدا عندما تعامل وفقا لهذه المبادئ التوجيهية. بعد مسح أسفل سطح العمل من غطاء محرك تدفق لارينار مع 70٪ الإيثانول، الاستغناء عن خمسة ملليلتر من المتوسطة المناسبة في 25 سم مربع T-قارورة.

مسح حاوية من خط الخلية المجمدة مع 70٪ الإيثانول وتخفيف بعناية وفك الغطاء. باستخدام ماصة باستور، نقل ملليلتر واحد من متوسط درجة حرارة الغرفة من القارورة إلى قارورة التبريد والزجاجة بلطف مزيج لإذابة الخلايا المجمدة. مع الحرص على أن تعليق الخلية لا تجاوز، نقل كامل حجم تعليق الخلية المذاب إلى القارورة وشطف القارورة cryo-مع المتوسطة الطازجة.

السماح للخلايا لتسوية إلى الجزء السفلي من قارورة لمدة ساعتين على الأقل في حاضنة درجة مئوية 25. لا تعود الخلايا المجمدة التي تم تعبئتها للسفر مرة أخرى إلى الفريزر ناقص 80 درجة مئوية لفترة طويلة أو في النيتروجين السائل. بدلا من ذلك ذوبان الخلايا في اسرع وقت ممكن.

بعد التأكد من التعلق تحت مجهر خفيف ، استبدل المابير بلطف بخمس ملليلترات من الوسط الطازج قبل إعادة القارورة إلى الحاضنة. بدلا من ذلك، بعد ذوبان، ونقل تعليق الخلية في أنبوب مخروطي 15 ملليلتر للطرد المركزي وإعادة تعليق بيليه في خمسة ملليلتر من المتوسطة الطازجة قبل البذر في قارورة T-25 كما أظهرت للتو. لتحديد ما إذا كانت الخلايا جاهزة للمرور ، قم بفحص مورفولوجيا والتقاء الثقافة تحت المجهر.

النظر في كثافة الخلايا ومضاعفة الوقت، في المرة الأخيرة كانت الخلايا دون المستزرعة، وأي علامات على تلوث الكائنات الحية الدقيقة في الثقافة. إذا كانت الثقافة تبدو شديدة الالتقاء، استخدم عشرة ملليلترات من الثقافة الفائقة لإزاحة الخلايا بلطف من أسفل لوحة الثقافة وتحديد كثافة الخلايا عن طريق حساب عدد الخلايا القابلة للحياة في تعليق الخلية المفردة الناتجة. الفرعية زراعة الخلايا إذا كانت كثافة الخلية بين خمسة إلى عشرة أضعاف عشر إلى الخلايا السادسة لكل ملليلتر في الوسط المناسب.

إضافة في ما لا يقل عن واحد مرات عشر إلى الخلايا السادسة في تركيز المليلتر في لوحة ثقافة جديدة لتحقيق كثافة الخلايا البذر المطلوب. ثم تغطية وتسمية لوحات مع الأحرف الأولى المشغل، والتاريخ، ونسبة الانقسام، وكثافة الخلية البذر، معرف خط الخلية، متوسطة، رقم مرور، وأي إضافات متوسطة مثل المضادات الحيوية، ووضع لوحات في حاوية بلاستيكية لاحتضانها المستمر في الحاضنة 25 درجة مئوية. لطرد الخلايا المرتبطة تشكل 100 ملليمتر ثقافة طبق القاع، أولا نقل كل من عظمى في قارورة معقمة وشطف الخلايا مع إضافة بطيئة من ملليلتر واحد من 0.05٪ التربسين EDTA.

دوامة بلطف لضمان أن الحل التربسين يغطي سطح النمو بأكمله قبل التخلص من الحل. بعد ذلك، أضف بلطف 1 إلى 2 ملليلتر من 0.05٪ EDTA الطازجة التربسين إلى لوحة ووضع لوحة في الحاضنة درجة 25 درجة مئوية لمدة ثلاث إلى عشر دقائق. عندما يمكن ملاحظة طبقة الخلية فصل وانزلاق الخروج من السطح المتزايد، ووقف نشاط التربسين مع إضافة تسعة ملليلتر من عظمى المحفوظة وخلط تعليق الخلية جيدا لفصل كتل الخلية.

عندما يتم إزاحة جميع الخلايا، فإن السطح المتزايد يكون واضحًا. لحساب الخلايا يدويا باستخدام شريحة العد خلية Neubauer، أولا مسح سطح شريحة مقياس الهيمواي وزلة الغطاء مع 70٪ الكحول. بعد الاختلاط، إضافة 15 ميكرولترات من الخلايا في كل حافة مخدد من قياس الهيموسيتلت لملء كلا الغرف.

سيتم سحب تعليق الخلية إلى غرفة العد عن طريق إجراء الشعيرات الدموية. باستخدام هدف المجهر 10x، عد ما بين 100 إلى 200 خلية داخل منطقة مربعة ملليمتر واحد في منتصف الشبكة المقيدة بخطوط متوازية. ثم كرر التعداد مع الغرفة الثانية واستخدام متوسط التهم اثنين لتحديد كثافة الخلية وفقا للصيغة.

بالنسبة لـ Drosophila cell-reo-preservation، إعادة تعليق بيليه الخلية في وحدة تخزين من التجمد المتوسط الذي سيؤدي إلى كثافة الخلية النهائية لا تقل عن أربعة أضعاف عشرة إلى الخلايا السابعة لكل ملليلتر. إضافة حجم مناسب من cryo-protectant، ثنائي الفينيل، سلفوكسيد أو DMSO، في تعليق الخلية قطرة الحكمة بحيث تركيز DMSO النهائي هو 10٪، وخلط بلطف تعليق الخلية. المقبل، بعناية إضافة 0.5 ملليلتر aliquots من تعليق الخلية في قوارير التبريد المسمى مسبقا ووضع قوارير التبريد في وعاء تجميد مليئة isopropanol.

ثم نقل حاوية التجمد إلى ثلاجة ناقص 80 درجة مئوية خلال الليل للسماح لدرجة حرارة قوارير التبريد لتنخفض ببطء إلى درجة حرارة الفريزر. بعد ذلك، نقل بسرعة قوارير التبريد إلى قصب لإدراجها في علبة النيتروجين السائل. بدلا من ذلك، نقل قوارير التبريد المجمدة في مربع تجميد المبردة قبل التبريد وتخزين قوارير التبريد المجمدة في المرحلة السائلة من ثلاجة النيتروجين.

يمكن تحديد التقاء خط الخلية بواسطة المجهر الخفيف. تحتاج خطوط الخلايا المتنامية بسرعة التي تصل إلى التقاء مبكرة إلى أن يتم تمريرها بانتظام ، تصل إلى مرتين في الأسبوع. في المقابل، يمكن تمرير الخلايا بطيئة النمو مرة واحدة على الأقل كل أسبوعين أو أكثر، على الرغم من أن هذه الخلايا تحتاج إلى تغذية المتوسطة الطازجة كل أسبوع.

خطوط الخلية المستمدة من مصادر الأنسجة المختلفة تختلف في مورفولوجيا، خصائص الالتزام، متطلبات وسائل الإعلام، وأوقات مضاعفة. بالنسبة للتجارب الكمية، يعد عد الخلايا أمرًا ضروريًا. يمكن عد الخلايا باستخدام مقياس للهيموسيت أو عداد الجسيمات الآلي.

التقاء الخلية هو دليل مرئي عن متى إلى ثقافة فرعية للمشغل ذوي الخبرة. ومع ذلك، عد الخلايا يؤدي إلى جدول زمني subcturing يمكن التنبؤ بها ويسهل الكشف عن حالات الشذوذ النمو. كن حذراً واستخدم معدات الحماية المناسبة عند العمل مع النيتروجين السائل.