Optøning, dyrkning og Cryopreserving Drosophila cellelinjer

Disse protokoller vil hjælpe enhver forsker indarbejde brugen af Drosophila celle linjer til at drive eller supplere deres forskning dagsorden. De fleste, hvis ikke alle Drosophila cellekulturer genoplive, formere sig, og kryo-bevare godt, når de håndteres i henhold til disse retningslinjer. Efter aftørring af arbejdsfladen af en laminar flow hætte med 70% ethanol, dispensere fem milliliter af passende medium i en 25 centimeter kvadreret T-kolbe.

Tør beholderen af frosne cellelinje med 70% ethanol og forsigtigt løsne og unseal låget. Ved hjælp af en Pasteur pipette overføres en milliliter rumtemperaturmedium fra kolben til kryohætteglasset og blandes forsigtigt for at tø de frosne celler op. Pas på, at cellesuspensionen ikke overløb, overføres hele volumen af den optøede celleaffjedring til kolben, og kryohætteglasset skylles med frisk medium.

Lad cellerne falde til bunden af kolben i mindst to timer i en 25 grader celsius inkubator. Må ikke returnere frosne celler, der er pakket til at rejse tilbage i minus 80 grader celsius fryser i en længere periode eller i flydende nitrogen. Tø i stedet cellerne ASAP.

Efter bekræftelse af fastgørelsen under et let mikroskop skal supernatanten udskiftes forsigtigt med fem milliliter frisk medium, før kolben returneres til inkubatoren. Alternativt overføres cellesuspensionen efter optøning til et konisk 15 milliliterrør til centrifugering, og pelleten suspenderes igen i fem milliliter frisk medium, før der sås i en T-25-kolbe som netop påvist. For at afgøre, om cellerne er klar til at blive passaget, undersøge morfologi og sammenløb af kulturen under et mikroskop.

I betragtning af celletætheden og fordoblingstiden blev cellerne sidst subperkultureret, og eventuelle tegn på mikroorganismel forurening i kulturen. Hvis kulturen ser ud til at være meget sammenløbet, skal du bruge ti milliliter af kultursupernatanten til forsigtigt at løsne cellerne fra kulturpladens bund og bestemme celletætheden ved at tælle antallet af levedygtige celler i den resulterende enkeltcellesuspension. Cellerne underkulturen, hvis celletætheden er mellem fem og ti gange ti til de sjette celler pr. milliliter i det relevante medium.

Der tilsættes mindst en gange ti til den sjette celle pr. milliliterkoncentration i en ny kulturplade for at opnå den ønskede såningscelletæthed. Derefter dække og mærke pladerne med operatøren initialer, dato, split ratio, såning celletæthed, celle linje identifikator, medium, passage nummer, og eventuelle medium tilføjelser såsom antibiotika, og placere pladerne i plastbeholder til deres fortsatte inkubation i 25 grader celsius inkubator. For at løsne klæbende celler danner en 100 millimeter kultur skål bund, først overføre alle supernatant i en steril kolbe og skyl cellerne med en langsom tilsætning af en milliliter på 0,05% trypsin EDTA.

Hvirvel forsigtigt for at sikre, at trypsinopløsningen dækker hele vækstfladen, før opløsningen kasseres. Dernæst forsigtigt tilføje en til to milliliter frisk 0,05% trypsin EDTA til pladen og placere pladen i 25 grader celsius inkubator i tre til ti minutter. Når cellelaget kan observeres afmontere og glide ud af den voksende overflade, stoppe trypsin aktivitet med tilsætning af ni milliliter af den gemte supernatant og bland celle suspension grundigt at adskille celleklumper.

Når alle cellerne er blevet forskubbet, vil den voksende overflade være klar. Hvis du manuelt vil tælle cellerne ved hjælp af et Neubauer-celletællingsdias, skal du først tørre overfladen af et hæmocytometer dias og dække slip med 70% alkohol. Efter blanding tilsættes 15 mikroliter af cellerne i hver rillet kant af hæmocytometeret for at fylde begge kamre.

Cellesuspensionen trækkes ind i tællekammeret ved kapillær handling. Ved hjælp af en 10x mikroskop mål, tælle mellem 100 til 200 celler inden for en millimeter kvadreret område i midten af gitteret bundet af de parallelle linjer. Gentag derefter optællingen med det andet kammer, og brug gennemsnittet af de to tal til at bestemme celletætheden i henhold til formlen.

For Drosophila celle linje kryo-konservering, re-suspendere celle pellet i et volumen af frysende medium, der vil resultere i en endelig celletæthed på mindst fire gange ti til den syvende celler pr milliliter. Der tilsættes et passende volumen af kryo-protectant, dimethylsulfoxid eller DMSO, i cellesuspensionsfaldet med omktå, at den endelige DMSO-koncentration er 10 %, og cellesuspensionen blandes forsigtigt. Dernæst forsigtigt tilsættes 0,5 milliliter aliquots af cellen suspension i formærkede kryo-hætteglas og placere kryo-hætteglas i en frysende beholder fyldt med isopropanol.

Derefter overføres frysebeholderen til en minus 80 grader celsius fryser i løbet af natten for at tillade temperaturen af kryo-hætteglas til at falde langsomt til fryseren temperatur. Dernæst hurtigt overføre kryo-hætteglas til dåser til indsættelse i en flydende nitrogen beholder. Alternativt kan de frosne kryohætteglas overføres til en forkølet frysekasse og opbevares i den flydende fase af en nitrogenfryser.

Sammenløbet af en cellelinje kan bestemmes af lysmikroskop. Hurtigt voksende cellelinjer, der når sammenløbet tidligt, skal passages regelmæssigt, op til to gange om ugen. I modsætning hertil kan langsomt voksende celler passage mindst en gang hver anden uge eller længere, selv om disse celler skal fodres frisk medium hver uge.

Cellelinjer, der stammer fra forskellige vævskilder, adskiller sig i deres morfologi, overholdelsesegenskaber, mediekrav og fordoblingstider. For kvantitative eksperimenter er celletælling afgørende. Cellerne kan tælles ved hjælp af et hæmocytometer eller en automatiseret partikeltæller.

Celle sammenløb er en visuel guide til, hvornår de skal subkultur for den erfarne operatør. Celletælling fører imidlertid til en forudsigelig subkulturplan og letter påvisning af vækstanomalier. Vær forsigtig og brug det relevante beskyttelsesudstyr, når du arbejder med flydende nitrogen.