Ontdooien, kweken en Cryopreserving van Drosophila cellijnen

Deze protocollen zullen elke onderzoeker helpen het gebruik van Drosophila-cellijnen op te nemen om hun onderzoeksagenda te besturen of aan te vullen. De meeste, zo niet alle Drosophila celculturen te doen herleven, vermenigvuldigen, en cryo-behouden goed wanneer behandeld volgens deze richtlijnen. Na het afvegen van het werkoppervlak van een laminaire stroomkap met 70%-ethanol, doe vijf milliliter van het juiste medium af in een 25 centimeter kwadraat T-kolf.

Veeg de container van bevroren cellijn met 70% ethanol en maak het deksel voorzichtig los en maak het deksel los. Breng met behulp van een Pasteur pipet een milliliter kamertemperatuurmedium over van de kolf naar de cryo-flacon en meng voorzichtig om de bevroren cellen te ontdooien. Zorg ervoor dat de celsuspensie niet overloopt, breng het volledige volume van de ontdooide celsuspensie over naar de kolf en spoel de cryo-flacon af met vers medium.

Laat de cellen zich minstens twee uur in een couveuse van 25 graden Celsius op de bodem van de kolf nestelen. Breng bevroren cellen die zijn verpakt voor reizen terug in min 80 graden Celsius vriezer voor een langere periode of in vloeibare stikstof. In plaats daarvan ontdooien de cellen Zo snel mogelijk.

Na bevestiging van de bevestiging onder een lichte microscoop, voorzichtig vervangen van de supernatant met vijf milliliter vers medium alvorens de kolf terug te keren naar de couveuse. U de celsuspensie na ontdooien in een conische buis van 15 milliliter voor centrifugatie overbrengen en de pellet opnieuw opschorten in vijf milliliter vers medium voordat u in een T-25-kolf wordt gezaaid, zoals zojuist is aangetoond. Om te bepalen of de cellen klaar zijn om te worden doorgang, onderzoekt u de morfologie en samenvloeiing van de cultuur onder een microscoop.

Gezien de celdichtheid en verdubbelingstijd, de laatste keer dat de cellen onderkweekt waren, en tekenen van micro-organismenbesmetting in de cultuur. Als de cultuur lijkt zeer confluent, gebruik dan tien milliliter van de cultuur supernatant om voorzichtig los te maken van de cellen van de bodem van de kweekplaat en de celdichtheid te bepalen door het tellen van het aantal levensvatbare cellen in de resulterende eencellige suspensie. Sub-cultuur van de cellen als de celdichtheid tussen vijf tot tien keer tien tot de zesde cellen per milliliter in het aangewezen middel is.

Voeg ten minste een keer tien aan de zesde cellen per milliliter concentratie in een nieuwe kweekplaat om de gewenste zaadceldichtheid te bereiken. Bedek en label de platen vervolgens met de initialen van de operator, datum, gesplitste verhouding, zaadceldichtheid, cellijn-id, medium, passagenummer en eventuele middelgrote toevoegingen zoals antibiotica, en plaats de platen in plastic container voor hun voortdurende incubatie in de 25 graden Celsius incubator. Om aanhangende cellen te verjagen vormen een 100 millimeter kweekschaalbodem, breng je eerst alle supernatant over in een steriele kolf en spoel je de cellen af met een langzame toevoeging van een milliliter van 0,05% trypsine EDTA.

Draai voorzichtig om ervoor te zorgen dat de trypsineoplossing het gehele groeioppervlak bedekt voordat de oplossing wordt weggegooid. Voeg vervolgens voorzichtig een tot twee milliliter verse 0,05% trypsin EDTA toe aan de plaat en plaats de plaat drie tot tien minuten in de 25 graden celsius incubator. Wanneer de cellaag kan worden waargenomen losmakend en glijden van het groeiende oppervlak, stop de trypsine activiteit met de toevoeging van negen milliliter van de opgeslagen supernatant en meng de cel suspensie grondig om de celklontjes te scheiden.

Wanneer alle cellen zijn losgemaakt, zal het groeiende oppervlak duidelijk zijn. Om handmatig de cellen te tellen met behulp van een Neubauer cel tellen dia, veeg eerst het oppervlak van een hemocytometer dia en cover slip met 70%alcohol. Voeg na het mengen 15 microliter van de cellen toe aan elke gegroefde rand van de hemocytometer om beide kamers te vullen.

De celsuspensie wordt door capillaire actie in de telkamer getrokken. Met behulp van een 10x microscoop doelstelling, tellen tussen 100 tot 200 cellen binnen de een millimeter kwadraat gebied in het midden van het raster gebonden door de parallelle lijnen. Herhaal vervolgens de opsomsoming met de tweede kamer en gebruik het gemiddelde van de twee tellingen om de celdichtheid te bepalen op basis van de formule.

Voor Drosophila cellijn cryo-behoud, opnieuw opschorten de cel pellet in een volume van bevriezing medium dat zal resulteren in een uiteindelijke celdichtheid van ten minste vier keer tien tot de zevende cellen per milliliter. Voeg een passend volume van de cryo-protectant, dimethylsulfoxide of DMSO, toe aan de celsuspensiedruppel, zodat de uiteindelijke DMSO-concentratie 10% is en meng voorzichtig de celsuspensie. Voeg vervolgens voorzichtig 0,5 milliliter aliquots van de celsuspensie toe in voorgelabelde cryo-flesjes en plaats de cryo-flesjes in een vriescontainer gevuld met isopropanol.

Breng vervolgens 's nachts de vriescontainer over in een vriesvriezer van min 80 graden Celsius, zodat de temperatuur van de cryo-flesjes langzaam naar de vriestemperatuur kan dalen. Vervolgens, snel overbrengen van de cryo-flesjes naar stokken voor het inbrengen in een vloeibare stikstof bus. U ook de bevroren cryo-flesjes in een voorgekoelde vriesdoos overbrengen en de bevroren cryo-flesjes opslaan in de vloeibare fase van een stikstofvriezer.

De samenvloeiing van een cellijn kan worden bepaald door een lichtmicroscoop. Snelgroeiende cellijnen die samenvloeiing vroeg bereiken, moeten regelmatig worden doorgetrokken, tot twee keer per week. In tegenstelling, langzaam groeiende cellen kunnen worden doorgegangerd ten minste eens in de twee weken of langer, hoewel deze cellen moeten worden gevoed vers medium elke week.

Cellijnen afgeleid van verschillende weefselbronnen verschillen in hun morfologie, aanhankelijkheidseigenschappen, mediavereisten en verdubbelingstijden. Voor kwantitatieve experimenten is celtelling essentieel. De cellen kunnen worden geteld met behulp van een hemocytometer of een geautomatiseerde deeltjesteller.

Cel samenvloeiing is een visuele gids voor wanneer subcultuur voor de ervaren operator. Celtelling leidt echter tot een voorspelbaar subculatieschema en vergemakkelijkt de detectie van groeiafwijkingen. Wees voorzichtig en gebruik de juiste beschermende kleding bij het werken met vloeibare stikstof.