Dégel, cultivant et cryoconservation des lignées de cellules de drosophile

Ces protocoles aideront tout chercheur à intégrer l’utilisation des lignées cellulaires Drosophila pour conduire ou compléter son programme de recherche. La plupart sinon toutes les cultures cellulaires de Drosophila ressuscitent, prolifèrent et cryo-préservent bien lorsqu’elles sont manipulées conformément à ces lignes directrices. Après avoir essuyé la surface de travail d’un capot d’écoulement laminaire avec 70% d’éthanol, distribuez cinq millilitres du milieu approprié dans un t-flacon carré de 25 centimètres.

Essuyez le contenant de la lignée cellulaire congelée avec 70 % d’éthanol et relâchez soigneusement et déscellez le couvercle. À l’aide d’une pipette Pasteur, transférer un millilitre de milieu de température ambiante du flacon au cryosol et mélanger délicatement pour décongeler les cellules gelées. En prenant soin que la suspension cellulaire ne déborde pas, transférez tout le volume de la suspension cellulaire décongelée dans le flacon et rincez le cryo-flacon avec un milieu frais.

Laissez les cellules s’installer au fond du flacon pendant au moins deux heures dans un incubateur de 25 degrés Celsius. Ne retournez pas les cellules congelées qui ont été emballées pour retourner dans un congélateur de moins 80 degrés Celsius pendant une période prolongée ou dans de l’azote liquide. Au lieu de décongeler les cellules dès que possible.

Après confirmation de l’attachement au microscope léger, remplacer délicatement le supernatant par cinq millilitres de milieu frais avant de retourner le flacon à l’incubateur. Alternativement, après la décongélation, transférer la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 millilitres pour centrifugation et suspendre à nouveau la pastille en cinq millilitres de milieu frais avant l’ensemencement dans un flacon T-25 comme nous venons de le démontrer. Pour déterminer si les cellules sont prêtes à être passages, examinez la morphologie et la confluence de la culture au microscope.

Compte tenu de la densité cellulaire et le temps de doublement, la dernière fois que les cellules ont été sous-cultivés, et tous les signes de contamination micro-cutanée dans la culture. Si la culture semble très confluente, utilisez dix millilitres de la culture supernatant pour déloger doucement les cellules du fond de la plaque de culture et déterminer la densité cellulaire en comptant le nombre de cellules viables dans la suspension cellulaire unique qui en résulte. Sous-culture des cellules si la densité cellulaire est entre cinq à dix fois dix à la sixième cellule par millilitre dans le milieu approprié.

Ajouter au moins une fois dix à la sixième cellule par concentration millilitre dans une nouvelle plaque de culture pour atteindre la densité de cellules d’ensemencement souhaitée. Couvrez et étiquetez ensuite les plaques avec les initiales de l’opérateur, la date, le ratio fractionnement, la densité des cellules d’ensemencement, l’identificateur de la lignée cellulaire, le milieu, le numéro de passage et tout ajout moyen comme les antibiotiques, et placez les plaques dans un contenant en plastique pour leur incubation continue dans l’incubateur de 25 degrés Celsius. Pour déloger les cellules adhérentes forment un fond de plat de culture de 100 millimètres, transférez d’abord tout le supernatant dans un flacon stérile et rincez les cellules avec un ajout lent d’un millilitre de 0,05% trypsine EDTA.

Tourbillonnez doucement pour vous assurer que la solution trypsine couvre toute la surface de croissance avant de jeter la solution. Ensuite, ajoutez doucement un à deux millilitres d’EDTA frais de 0,05 % trypsine à l’assiette et placez la plaque dans l’incubateur de 25 degrés Celsius pendant trois à dix minutes. Lorsque la couche cellulaire peut être observée se détacher et glisser hors de la surface de croissance, arrêter l’activité de la trypsine avec l’ajout de neuf millilitres du supernatant sauvé et mélanger la suspension cellulaire à fond pour dissocier les touffes cellulaires.

Lorsque toutes les cellules ont été délogées, la surface de croissance sera claire. Pour compter manuellement les cellules à l’aide d’une glissière de comptage cellulaire Neubauer, essuyez d’abord la surface d’une glissade d’hémomètre et couvrez le glissement avec 70 % d’alcool. Après le mélange, ajouter 15 microlitres des cellules dans chaque bord rainuré de l’hémocytomètre pour remplir les deux chambres.

La suspension de la cellule sera entraînée dans la chambre de comptage par action capillaire. À l’aide d’un objectif de microscope de 10 x, comptez entre 100 et 200 cellules dans la zone carrée d’un millimètre au milieu de la grille reliée par les lignes parallèles. Répétez ensuite l’énumération avec la deuxième chambre et utilisez la moyenne des deux dénombrements pour déterminer la densité cellulaire selon la formule.

Pour la cryo-préservation de la lignée cellulaire Drosophila, suspendre à nouveau la pastille cellulaire dans un volume de milieu de congélation qui se traduira par une densité cellulaire finale d’au moins quatre fois dix à sept cellules par millilitre. Ajoutez un volume approprié du cryo-protectant, du sulfoxyde de diméthyle ou du DMSO, dans la suspension cellulaire goutte sage de sorte que la concentration finale DMSO est de 10% et mélanger doucement la suspension cellulaire. Ensuite, ajouter soigneusement 0,5 millilitre aliquots de la suspension cellulaire dans des cryo-flacons pré-étiquetés et placer les cryo-flacons dans un récipient de congélation rempli d’isopropanol.

Ensuite, transférez le contenant de congélation dans un congélateur de moins 80 degrés Celsius pendant la nuit pour permettre à la température des cryo-flacons de baisser lentement à la température du congélateur. Ensuite, transférez rapidement les cryo-flacons sur les cannes pour l’insertion dans une boîte d’azote liquide. Alternativement, transférez les cryo-flacons congelés dans une boîte de congélation pré-refroidie et stockez les cryo-flacons congelés dans la phase liquide d’un congélateur à azote.

La confluence d’une lignée cellulaire peut être déterminée par microscope léger. Les lignées cellulaires à croissance rapide qui atteignent la confluence tôt doivent être passages régulièrement, jusqu’à deux fois par semaine. En revanche, les cellules à croissance lente peuvent être ad passage au moins une fois toutes les deux semaines ou plus, bien que ces cellules doivent être nourries en milieu frais chaque semaine.

Les lignées cellulaires dérivées de diverses sources tissulaires diffèrent dans leur morphologie, leurs propriétés d’adhérence, leurs besoins en médias et leurs temps de doublement. Pour les expériences quantitatives, le comptage cellulaire est essentiel. Les cellules peuvent être comptées à l’aide d’un hémocytomètre ou d’un compteur de particules automatisé.

La confluence cellulaire est un guide visuel pour savoir quand sous-culture pour l’opérateur expérimenté. Cependant, le comptage cellulaire conduit à un calendrier de subcultation prévisible et facilite la détection des anomalies de croissance. Soyez prudent et utilisez l’équipement de protection approprié lorsque vous travaillez avec de l’azote liquide.