Name: thawing, culturing, and cryopreserving drosophila cell lines
Uploaded: 2019-04-16T15:00:00
Duration: 7 min 57 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines at JoVE.com

אנו מודים מכוני הבריאות הלאומיים (פרס NIH P40OD010949) וקהילת המחקר על ניצול המשאבים השונים של DNA/וקטורים/תא melanogaster ד מספר פעמים ב DGRC.

1. מפשיר, החייאת שורות תאים קפוא דרוזופילה
<ol><li>לחטא את מכסה המנוע על ידי מנגב משטח העבודה עם 70% אתנול. לוותר על 5 מ של המדיום המתאים (טבלה 1) לתוך 25 ס מ2 T-הבקבוק (T-25).</li>
	<li>הסר את cryovial/האמפולה נוזלי N2 או קרח יבש. לנגב את cryovial עם 70% אתנול, בזהירות לשחרר, פתחי את האמפולה.</li>
	<li>באמצעות פיפטה של פסטר, לסגת 1 מ"ל של מדיה בטמפרטורת החדר (RT) הבקבוק T-25. לאט לאט להוסיף התקשורת cryovial ומערבבים בעדינות כדי להפשיר את התאים קפוא, המבטיח כי התליה תא גלישה לא.</li>
	<li>להעביר את כל נפח התא המופשרים ההשעיה מ האמפולה לתוך הבקבוק T-25. חזור על מנת להבטיח שהתליה תא הועבר לחלוטין.</li>
	<li>הכנס את הבקבוקון חממה 25 ° C, המאפשר את התאים כדי ליישב וציות לפחות 2 ח' לבחון את התאים במיקרוסקופ כדי להבטיח כי רוב התאים התיישבו על המשטח גדל והולך. בעדינות להסיר מדיה ישן ותחליף 5 מ של מדיה חדשה. להחזיר את הבקבוק לתוך החממה.</li>
	<li>למחרת, בעדינות מסיר את המדיה הישנה ולהחליף עם 5 מ של מדיה חדשה. להחזיר את התרבות החממה.</li>
</ol>2. מפשיר, החייאת קפוא דרוזופילה שורות תאים (חלופה)
<ol><li>בשכונה סטרילי, להפשיר את התאים על ידי resuspending בגדר קפוא עם 1 מ"ל של RT מדיה. העברת כל התליה תא המופשרים לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל.</li>
	<li>גלולה התאים על ידי צנטריפוגה-1,000 x g עבור 5 דק. להשליך את תגובת שיקוע, resuspend בגדר תא ב 5 מ של מדיה חדשה.</li>
	<li>להעביר את כל נפח התא ההשעיה לתוך בקבוקון T-25, דגירה התרבות ב 25 º C.</li>
	<li>1 עד 2 h מאוחר יותר, לבחון את התאים במיקרוסקופ כדי להבטיח כי רוב התאים התיישבו על המשטח גדל והולך. למחרת, החלף את המדיה הישנה 5 מ של מדיה טריים וחוזרים התרבות החממה.</li>
</ol>3. subculturing תאים חסיד למחצה גדלו ב 100 מ מ תרבות צלחות
<ol><li>לחטא את מכסה המנוע על ידי מנגב עם 70% אתנול. להכניס את החומרים סטרילי עבור subculturing בכיפה, כולל מדיה בקבוקים, פיפטות, סיוע פיפטה של תרבות צלחות.</li>
	<li>בחן את המורפולוגיה זרימה של התרבות תחת מיקרוסקופ. חפש סימנים ברורים של מציג microorganismal בתרבות. לקבוע האם התאים הם מוכנים להיות passaged, בהתבסס על מאפייני התרבות: תא צפיפות ולהכפיל את הזמן, כולל הפעם האחרונה שהם היו subcultured.</li>
	<li>אם התרבות מופיע מאוד confluent (איור 1), לקבוע את צפיפות התאים. בשכונה סטרילי, לסלק תאים מפני השטח גדל על-ידי pipetting עד 10 מ"ל של המדיום מהצלחת מחלק זה על התאים. חזור על מספר פעמים, הבטחת לא ליצירת קצף, עד המשטח גדל הופך ברור. לקבוע את צפיפות התאים באמצעות hemocytometer או מונה הניתן חלקיקים אוטומטי (סעיף 5, איור 3). תת-תרבות התאים אם צפיפות התאים היא בין 5 x 106 עונה 1 פרק 107 תאים/מ ל.... הערה: האם לא תת-תרבות דרוזופילה תא קווי צפיפות תא מתחת עונה 1 פרק 106 תאים/מ ל....</li>
	<li>
לדלל התליה תא בהתאם באמצעות בינוני המתאים של ריכוז זריעה הסופי לפחות 1 x 106 תאים/מ ל....
	<ol>
<li>השגרה passaging ותחזוקה, להוסיף אמצעי אחסון המתאים של השעיה תא נפח שנקבע מראש במדיום צלחת תרבות חדשה כדי להשיג צפיפות תא זריעה הרצוי.</li>
		<li>עבור שינוי קנה מידה את תרבות, להעביר כל התליה תא לתוך בקבוקון גדולים. לדלל התליה תא לצפיפות הרצויה תא עם אמצעי אחסון המתאים של המדיום. להפיץ נפחים שווים של התליה תא מדולל על לוחיות הרישוי. שיטה זו ממזערת את הווריאציות בצפיפות תא בין לוחות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>מכסה, תווית הצלחות עם התיבות המפעיל, תאריך, פיצול יחס, צפיפות תא זריעה, מזהה קו תא, מדיה, מעבר מספר ותוספות בכל מדיה כגון אנטיביוטיקה.</li>
	<li>מקם את הצלחות לתוך מיכל פלסטיק וחוזרים תיבת החממה. הערה: בטבלה 3 רשימות כלי תרבות הנפוץ עבור culturing שורות תאים דרוזופילה ואמצעי האחסון המשויך את העבודה.</li>
</ol>4. מוציאים תאים חסיד גדלו ב 100 מ מ תרבות צלחות
<ol><li>העברת כל המדיום מהצלחת אל בקבוק חדש סטרילי. לשמור את המדיום.</li>
	<li>לשטוף תאים על-ידי הוספת לאט 1 מ"ל של 0.05% טריפסין-EDTA לצלחת. מערבולת בעדינות כדי להבטיח שהפתרון טריפסין מכסה את פני השטח כולו צמיחה. לבטל את הפתרון טריפסין.</li>
	<li>בעדינות מוסיפים 1 מ"ל של 0.05% טריפסין-EDTA לצלחת. דגירה את הצלחת 25 ° c בין מין 3−10 בזמן ניטור עבור סימנים גלויים של ניתוק שכבה תאים הזזה את המשטח גדל.</li>
	<li>להוסיף 9 מ של המדיום ששמרת הצלחת לעצור את פעילות טריפסין. מערבבים התליה תא מביצועם תא גושים. לאחר כבר הוציא את כל התאים, המשטח גדל יהיה ברור. הערה: השימוש של אנזימי עיכול כמו טריפסין מסייעת passaging שורות תאים חסיד חריפה. טריפסין הוא תערובת של פרוטאזות לעיתים קרובות נגזר מן הלבלב חזירי והוא זמין מסחרית דרגות שונות של טוהר.</li>
</ol>5. תא ידנית סופר שימוש בתא נויבאואר ספירת שקופיות
<ol><li>הכן את השקופית hemocytometer ואת coverslip על ידי ניגוב המשטח עם אלכוהול 70%.</li>
	<li>לערבב התליה תא, לוותר על µL 15 של התליה תא אל קצה hemocytometer (איור 3 א) למלא את התא הראשון של hemocytometer מחורץ. למלא את התא השני של hemocytometer. התליה תא יצוייר לתוך החדר ספירה מאת נימיות.</li>
	<li>באמצעות 10 x מיקרוסקופ אובייקטיבי, לספור את התאים בתוך אזור2 1 מ"מ באמצע הרשת מאוגד על ידי קווים מקבילים (איור 3C,יח). כדי להימנע ספירת כפולים, לספור את התאים כיסוי החלק העליון והחלק השמאלי גבולות, אבל לא התאים לחצות את הגבולות הימני והתחתון של הריבועים2 מיקרומטר 200. נחשב בין תאים 100−200. חזור על הרוזן עם החדר השני.</li>
	<li>חשב את הממוצע של שני סעיפים ולקבוע את צפיפות התאים לפי הנוסחה הבאה: תא צפיפות (תאים/mL) = ספירת התאים הממוצע (n1 + n2/2) x 104. הערה: תא הכדאיות מבוטא כאחוז מתוך התאים קיימא הכולל תאים. כדי לקבוע את הכדאיות תא, לערבב התליה תא עם אמצעי אחסון שווה של trypan blue (0.4%) פתרון לפני ספירת תאים ידנית או אוטומטית. תאים חיים לא תרימו את צבען, ואילו תאים מתים מוכתם כחול.</li>
</ol>6. הקפאה קריוגנית של שורות תאים דרוזופילה
<ol><li>בדוק את התרבות מורפולוגיה בריא, צמיחה של היעדר זיהום. הקציר התרבויות מן אמצע לשלב מאוחר-יומן צמיחה (שלב 3.3, או סעיף 4). קווים רבים דרוזופילה התא, הוא בערך בין 4 x 106 תאים למ"ל 8 x 106 תאים/מ ל....</li>
	<li>להעביר את המתלים התא כולו לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל או 50 מ. לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה ב x 1000 g למשך 5 דקות וזורקים את תגובת שיקוע.</li>
	<li>Resuspend בגדר תא באמצעי אחסון בינוני קפוא (טבלה 4) כי תגרום צפיפות תא הסופי לפחות 4 x 107 תאים/מ ל....</li>
	<li>להוסיף dropwise את הכמות המתאימה של cryoprotectant דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד) לתוך התליה תא כזה ריכוז דימתיל סולפוקסיד הסופי הוא 10%. מערבבים בעדינות התליה תא.</li>
	<li>בזהירות לוותר על 0.5 מ"ל של התליה תא לתוך aliquots של cryovials שכותרתו מראש (~ 2 x 107 תאים/מבחנה). מניחים את ampules לתוך מיכל המקפיא מלא אלכוהול איזופרופיל (איור 4A). העברת המכולה מקפיא בפריזר-80 ° C בלילה כדי לאפשר את הטמפרטורה של cryovials לרדת לאט לאט (-1 ° C/דקה) כדי הטמפרטורה למקפיא.</li>
	<li>להוציא את cryovials קפואים, במהירות לצרף אותם שיחי (איור 4B). הכנס את שיחי המכיל cryovials לתוך מיכל (איור 4C). לחלופין, מקום cryovials קפוא בתוך קופסא מקפיא טרום מקורר (איור 4D). חנות קפוא cryovials בשלב הנוזלי של N2 מקפיאים (איור 4E,F). הערה: בעת שימוש מקפיא מדיה המכילה דימתיל סולפוקסיד, באיחור של עד 30 דקות ב- RT אינה מזיקה לתאים.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Baum, B., Cherbas, L., Dahmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila:+Methods+and+Protocols.">Drosophila: Methods and Protocols.</a> Methods in Molecular Biology. 420, 391-424 (2008).</li><li>Cherbas, L., Gong, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lines.">Cell lines.</a> Methods. 68 (1), 74-81 (2014).</li><li>Luhur, A., Klueg, K. M., Zelhof, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+and+working+with+Drosophila+cell+cultures:+Current+challenges+and+opportunities.">Generating and working with Drosophila cell cultures: Current challenges and opportunities.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: Developmental Biology. , e339 (2018).</li><li>Franz, A., Brunner, E., Basler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+genome-modified+Drosophila+cell+lines+using+SwAP.">Generation of genome-modified Drosophila cell lines using SwAP.</a> Fly (Austin). 11 (4), 303-311 (2017).</li><li>Housden, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+potential+drug+targets+for+tuberous+sclerosis+complex+by+synthetic+screens+combining+CRISPR-based+knockouts+with+RNAi.">Identification of potential drug targets for tuberous sclerosis complex by synthetic screens combining CRISPR-based knockouts with RNAi.</a> Science Signaling. 8 (393), r9 (2015).</li><li>Kunzelmann, S., Bottcher, R., Schmidts, I., Forstemann, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comprehensive+Toolbox+for+Genome+Editing+in+Cultured+Drosophila+melanogaster+Cells.">A Comprehensive Toolbox for Genome Editing in Cultured Drosophila melanogaster Cells.</a> G3 (Bethesda). 6 (6), 1777-1785 (2016).</li><li>Ishizu, H., Sumiyoshi, T., Siomi, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+CRISPR-Cas9+system+for+genome+editing+in+cultured+Drosophila+ovarian+somatic+cells.">Use of the CRISPR-Cas9 system for genome editing in cultured Drosophila ovarian somatic cells.</a> Methods. 126, 186-192 (2017).</li><li>Echalier, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Drosophila Cells in Culture. , (1997).</li><li>Echalier, G., Perrimon, N., Mohr, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Drosophila cells in culture. 2nd edition. , (2017).</li><li>Cherbas, L., Cherbas, P., Roberts, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Drosophila: A practical approach. 10, 319-346 (1998).</li><li>Schneider, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lines+derived+from+late+embryonic+stages+of+Drosophila+melanogaster.">Cell lines derived from late embryonic stages of Drosophila melanogaster.</a> Journal of Embryollgy and Experimental Morphology. 27 (2), 353-365 (1972).</li><li>Echalier, G., Ohanessian, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolement,+en+cultures+in+vitro,+de+lignees+cellulaires+diploides+de+Drosophila+melanogaster.">Isolement, en cultures in vitro, de lignees cellulaires diploides de Drosophila melanogaster.</a> Comptes rendus de l'Acad&#233;mie des Sciences. 268, 1771-1773 (1969).</li><li>Ui, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Newly+established+cell+lines+from+Drosophila+larval+CNS+express+neural+specific+characteristics.">Newly established cell lines from Drosophila larval CNS express neural specific characteristics.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology &#8722; Animal. 30A (4), 209-216 (1994).</li><li>Ui, K., Ueda, R., Miyake, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lines+from+imaginal+discs+of+Drosophila+melanogaster.">Cell lines from imaginal discs of Drosophila melanogaster.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology. 23 (10), 707-711 (1987).</li><li>Currie, D. A., Milner, M. J., Evans, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+growth+and+differentiation+in+vitro+of+leg+and+wing+imaginal+disc+cells+from+Drosophila+melanogaster.">The growth and differentiation in vitro of leg and wing imaginal disc cells from Drosophila melanogaster.</a> Development. 102, 805-814 (1988).</li><li>Niki, Y., Yamaguchi, T., Mahowald, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+stable+cell+lines+of+Drosophila+germ-line+stem+cells.">Establishment of stable cell lines of Drosophila germ-line stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (44), 16325-16330 (2006).</li><li>Saito, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+regulatory+circuit+for+piwi+by+the+large+Maf+gene+traffic+jam+in+Drosophila.">A regulatory circuit for piwi by the large Maf gene traffic jam in Drosophila.</a> Nature. 461 (7268), 1296-1299 (2009).</li><li>Simcox, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+genetic+method+for+establishing+Drosophila+cell+lines+unlocks+the+potential+to+create+lines+of+specific+genotypes.">Efficient genetic method for establishing Drosophila cell lines unlocks the potential to create lines of specific genotypes.</a> PLoS Genetics. 4 (8), e1000142 (2008).</li><li>Sumiyoshi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+l(3)mbt+leads+to+acquisition+of+the+ping-pong+cycle+in+Drosophila+ovarian+somatic+cells.">Loss of l(3)mbt leads to acquisition of the ping-pong cycle in Drosophila ovarian somatic cells.</a> Genes &amp; Development. 30 (14), 1617-1622 (2016).</li><li>Dequeant, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+progenitor+cell+signatures+by+time-series+synexpression+analysis+during+Drosophila+embryonic+cell+immortalization.">Discovery of progenitor cell signatures by time-series synexpression analysis during Drosophila embryonic cell immortalization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (42), 12974-12979 (2015).</li><li>Young, L., Sung, J., Stacey, G., Masters, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Mycoplasma+in+cell+cultures.">Detection of Mycoplasma in cell cultures.</a> Nature Protocols. 5 (5), 929-934 (2010).</li><li>Shields, G., Sang, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+medium+for+culture+of+Drosophila+embryonic+cells.">Improved medium for culture of Drosophila embryonic cells.</a> Drosophila Information Service. 52, 161 (1977).</li><li>Freshney, R. I., Capes-Davis, A., Gregory, C., Przyborski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Culture of animal cells : a manual of basic technique and specialized applications. Seventh edition. edn. , (2016).</li><li>Lee, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+copy+number+evolution+in+Drosophila+cell+lines.">DNA copy number evolution in Drosophila cell lines.</a> Genome Biology. 15 (8), R70 (2014).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

תרביות תאים דרוזופילה הם ראשי ריאגנטים עבור מסכי מבוססת תא תפוקה גבוהה. השימוש שלהם גם משלים ויוו מחקר גנטי על ידי מתן אוכלוסיה הומוגנית של תאים מתאים ביוכימיה, מהירה בדיקה של בונה הטרנסגניים לפני הזרקת לתוך זבובים, ביולוגיה של התא, מיקרוסקופיה ולאחרונה תאים סומטיים גנטי מניפולציות על ידי הגנום עריכה1,2,3,8,9,10.
הכדאיות ושחזור של תאים דרוזופילה הקפוא רגיש לתנודות קיצוני אפילו בטמפרטורות נמוכות. DGRC מאחסן שורות תאים קפואה בשלב הנוזלי של N2 (-196 מעלות צלזיוס), מסיע אותם בתוך קרח יבש (78.5 º C). Ampules קפואים שהעביר בתוך קרח יבש כדאי לא יועבר חזרה לתוך נוזל N2 או מקפיא-80 ° C עבור אחסון. במקום זאת, התאים קפוא צריך להיות הקרת, reseeded-צפיפות גבוהה תא בהקדם האפשרי עם ההגעה (פרוטוקול בסעיף 1) ותרבותית למטרות המיועד שלהם (פרוטוקול בסעיף 3). אם הקווים תאים שאינם מנוצלים באופן מיידי לניסויים, התא קווים צריך להיות cryopreserved (פרוטוקול סעיף 6) עד שיהיו מוכנים לשימוש.
שורות תאים מסוימים, כגון השורות ML-BG2-c2 וראס צריך כמה ימים כדי להתאושש מן ההשפעות של קמה לתחייה מהמדינה cryopreserved. כמות משמעותית של פסולת הסלולר מלווה את שורות תאים אלו הימים הראשונים לאחר מפשיר. נותר ללא הפרעה, התאים לשחזר, להתרבות. הרבה שורות תאים דרוזופילה -DGRC הותאמו לגדול M3 מבוסס מדיה22. עבור שורות תאים כי הם איטיים להתאושש מן ההשפעות של מפשיר, בשימוש במדיה ממוזגים עשויה להיות שימושית. סביר ממוזגים המדיה להכיל גורמי גדילה מופרש על ידי תאי לתוך המדיה אשר עשויים לעודד את השחזור ואת התפשטות התאים לאחר מפשיר.
שורות תאים בדרך כלל לעקוב אחר עקומת גדילה סטריאוטיפי המורכב שלב ההשהיה, שלב מעריכית, מישור שלב, שלב ההתדרדרות. שורות רבות של תאים דרוזופילה להתרבות היומן-בשלב של צמיחה, כאשר הם מתורבתים-צפיפות בין עונה 1 פרק 106 עונה 1 פרק 107 תאים למ"ל על 25 מעלות צלזיוס. זה חיוני כי שורות תאים הם passaged כך הם תמיד שלב הגידול המעריכי.
המפגש של תרבות, המבוטא באחוזים, מתאר את הצמיחה פני השטח מכוסה על ידי התאים. תא זרימה עבור קו תא תלוי תא הצורה והגודל שלה. שורות תאים נפרדים יש מורפולוגיות שונות ומאפייני הדבקות. כתוצאה מכך, ייתכן שורות תאים שונים-כ דומה למפגש צפיפות התאים מאוד ברורים (איור 1). תרבות זרימה לא יכול להיות אינדיקטור אידיאלי עבור passaging תרביות תאים דרוזופילה מכיוון שורות תאים דרוזופילה ממשיכים להתרבות גם על ידי ללגוז האחד על השני מוקדים או ההשעיה אפילו לאחר השטח צמיחה מכוסה (איור 1). עם זאת, משתמשים מנוסים עם שורות תאים מסוים עשוי לעתים קרובות להשתמש הנהרות כמדריך חזותי מהירה עבור כאשר תת-תרבות.
אמנם זה אפשרי לגדול דרוזופילה קווים ב RT הסביבה בין 19−25 ° C, לא מומלץ בגלל תנודות טמפרטורת הסביבה משפיעה על קצב התפשטות. השימוש של חממה ייעודית-25 ° C מומלץ. החממה של תרביות תאים דרוזופילה אינו צריך להקל על חילופי גז CO2 כי דרוזופילה תא תרבות המדיה אל תשתמש CO2 לאכסון. הלחות בתוך החממה עבור culturing שורות תאים הוא גורם חשוב לא להתעלם כאשר culturing בתאים צלחות. בהתאם לסוג על החממה ועל סביבת העבודה, ייתכן צורך למקם גביע במים סטריליים בתוך החממה. כדי למזער את המדיה אידוי, להשתמש T-הבקבוק סגור או לאחסן תרבות צלחות במיכל פלסטיק אטומה בחוזקה ואילו בתוך החממה.
חשוב לפיתוח זמנים עבור subculturing שורות תאים דרוזופילה . כדי להעריך צמיחה קצב וצג בעקביות, זה נוח תת-תרבות יחס אפילו גיאומטריים (פיצול יחס 1:2, 1:4, 1:8). לדוגמה, ניתן לפצל צלחת confluent 10 מ"ל של תאים Kc167-8 x 106 תאים למ"ל ביחס 1:8 כדי להשיג צפיפות זריעה של עונה 1 פרק 106 תאים/mL (מ 1.25 ל השעיה תא מדולל 8.75 מ של מדיה טריים). ב- 72 h, Kc167 תרבויות צפויים להתרבות על צפיפות של תאים6 8 x 10/mL, בהתחשב שלה זמן ההכפלה של 24 שעות. היחס פיצול ולכן נקבע כדי להקל על תת-תרבות נוח שיגרה של עד פעמיים בשבוע, המבטיח כי התאים תמיד מתורבתים בשלב שלהם יומן מעריכית של צמיחה. דבר זה מאפשר זמנים קבוע subculturing את התאים כך הוא זמן זרימה לא קצר מדי ולא יותר מדי זמן. אם הזמן למפגש קצר מדי, התאים הם subcultured-צפיפות התא התחתון (יחס פיצול גבוה יותר). באופן דומה, אם הזמן להגיע למפגש ארוך מדי, התאים הם subcultured-צפיפות תא גבוהה יותר (יחס הפיצול נמוכה יותר). חשוב לציין כי רוב שורות תאים דרוזופילה רגישים מאוד צפיפות התאים נמוך (< עונה 1 פרק 105 תאים למ"ל), אילו תאים בקושי להתרבות ואת עלולה למות בסופו של דבר.
דרוזופילה שורות תאים משתנים מאפייני צמיחה מורפולוגיה. כתוצאה מכך, ייתכן שורות תאים עם מאפיינים ברורים להיות מטופלים באופן שונה. רוב דרוזופילה פתוחים למחצה חסיד. צפיפות התאים נמוך יותר, הם דבקים חזקים השטח צמיחה, התרבות הופך confluent, התאים הופכים פחות חסיד ולנתק בקלות. זה שינוי הדרגתי תא הדבקות מקלה על subculturing קל של שורות תאים דרוזופילה הנפוצה ביותר (שניידר, Kc קווים, דיסק דמותי וקווים CNS) שכן היא מאפשרת את המפעיל פשוט לוותר על מדיה מעל טפט תא לנתק אותם מפני השטח גדילה כאשר התרבות היא צפופה. לקווים שאינם מחסידי משטח כגון נבט הנשי-קו גזע/השחלות נדן סומאטית (המדרשה/OSS) וקווים ראס, זה חיוני כדי דגירה התאים טריפסין למשך זמן קצר לסייע ניתוק התאים מפני השטח צמיחה.
תוספות מדיה עבור רוב שורות תאים דרוזופילה כוללות עגל עוברית סרום (FCS). אינסולין ולחלץ לטוס למבוגרים (את פליקס) נדרשים עבור כמה שורות ספציפיות. את פליקס מכילה רכיבים לא מוגדר חיוני לצמיחה של שורות ספציפיות דיסק דמותי זחל והן לקווי תא השחלות למבוגרים. מכין DGRC, ואת עושה את פליקס למבוגרים זמין נגזר בן שבוע זבובים אורגון-R-modENCODE (RRID: BDSC_25211) ב aliquots 2.5 מ ל ו- 10 מ"ל. DGRC מספק גם הנחיות בקנה מידה קטן את פליקס הכנה באתר האינטרנט שלה < https://dgrc.bio.indiana.edu/include/file/additions_to_medium.pdf>. הכנה את פליקס, עם זאת, הוא זמן רב ואינה דורשת כמות גדולה של הזבוב הבוגר.
הקפאה קריוגנית של שורות תאים דרוזופילה שומר ריאגנטים עבור שמירה על שורות תאים וזמן לא נעשה בו שימוש מיידי. הקפאה קריוגנית מושגת על ידי לאט להקפיא את התאים (-1 ° C/דקה)-80 מעלות במדיום המכיל דימתיל סולפוקסיד, סוכן cryoprotective. השלב קירור איטי הוא קריטי עבור הקפאה קריוגנית מוצלחת. במקפיא-80 ° C, האמפולה של תאים מצטנן בקצב של-1 ° C/min כאשר הם ממוקמים בתוך מיכל המקפיא מלא אלכוהול איזופרופיל החל בטמפרטורת החדר 25 ° C, זה יקח עד 2 שעות על הטמפרטורה ב ampules כדי להגיע-80 מעלות צלזיוס. מומלץ להשאיר את ampules כדי להקפיא למשך הלילה.
Ampules קפואים ואז שתתאפשר במהירות לתוך השלב הנוזלי של חנקן עבור אחסון ממושך. בטמפרטורת החדר, cryovial לחמם במהירות כ 10 ° C/דקה, הכדאיות ייחשף ב מעל-50 ° C23. כדי למנוע ההעברה מהירה, לטפל ampules בקבוצות קטנות כדי למזער את החשיפה טמפרטורת הסביבה. לחלופין, במקום את cryovials קפוא על קרח יבש בעת הכנת להעברת שלהם לנוזל N2- אם חנקן נוזלי אינה זמינה, התאים ניתן לאחסן במקפיא-80 ° C, אך עם סיכון של הידרדרות משמעותית לאורך זמן.
תא צפיפות הוא קריטי עבור הקפאה קריוגנית מוצלחת ואת התחייה עוקבות של שורות תאים. באופן כללי, התא החדש קווים אמורים לקפוא ליצירת הראשונית להקפיא (1−3 ampules), ברגע עודף של תאים הופכת לזמינה. ברגע שורת התאים יש כבר תרבותי נוסף stably, מלאי קפוא של 10−20 ampules צריך להיווצר. מלאי זה הוא להפשיר ואז לבדוק את תא ההקפאה שלאחר השחזור ואת הכדאיות, לאחר מכן זה הופץ עבור experimentations או כדי להחליף את המניה כאשר המספר של ampules מניות קפוא יורד מתחת חמש. לבסוף, חשוב לאמת כי התאים המופשרים לשמר את המאפיינים של המניות הורים כמו שורות תאים ידועים להתפתח3,24.
לסיכום, מאמר זה מציג פריימר לעבודה עם תרביות תאים דרוזופילה על-ידי מתן המידע הבסיסי על שונים קווים, שיטות עבודה מומלצות, audiovisual פרוטוקולים לטיפול הבסיסי של שורות תאים דרוזופילה . משאב נגיש זה נועד להקל בצורה חלקה המבוא לעבודה עם תאים בתרבית דרוזופילה וכדי להשלים את המדריכים הקיימים הדרכה בכל מעבדה למחקר.

השימוש דרוזופילה תרבותי תאים משלים ויוו לטוס ניתוח גנטי, משמש ככלי חקירה ראשית למיעון רבות השאלות הביולוגיות הבסיסיות1,2,3. שורות תאים דרוזופילה מציעים ייחודי הומוגנית אוכלוסיות של תאי ממקורות שונים רקמה עם רקע גנטי מובהק. שורות תאים מתאימים עבור יישומים רבים כולל ביטוי גנים הטרנסגניים, גנומיקה, transcriptomics, פרוטאומיקס, גליקומיקס, תפוקה גבוהה RNA הפרעה (RNAi) המסכים, ביולוגיה של התא, מיקרוסקופ. חשוב, השימוש של תרבית תאים דרוזופילה מקלה על אפיון התגובות זמני מיידי לגירויים ידוע. יתר על כן, תרבית תאים דרוזופילה הוא נוטה הגנום CRISPR-Cas9 עריכה, ולכן קל יחסית ליצור שורות תאים חדשים עם הגנום ספציפי שינויים4,5,6, 7.
מרכז משאבים גנומיקה דרוזופילה (DGRC) משמש מרכז מאגר והפצה עבור שורות תאים דרוזופילה . אחת המטרות של DGRC היא לסייע חברי קהילת המחקר באמצעות משאבי התרבות התא דרוזופילה . מאמר זה מציג פקודות בסיסיות לטיפול של שורות תאים דרוזופילה . תתנחם מהמשאבים הקיימים כדי לסייע לחוקרים להיות נוח עם טיפול תרביות תאים דרוזופילה ולהשיג רמת העצמאות שלהם ניסויים1,2,8,9 ,10.
הקווים תא דרוזופילה הנפוצות ביותר הם: שניידר קווים מספר11, Kc16712, דיסק דמותי מיצובישי/מיאקי ואת מערכת העצבים המרכזית (CNS) קווים13,14, מילנר מעבדה דיסק דמותי קווים 15,16,תא השחלות למבוגרים קווים17, ו Ras קווים18 (טבלה 1). השורות שניידר ו- Kc167 הם שורות תאים לכל מטרה כללית לשימוש בביוכימיה, ביטוי גנים הטרנסגניים רקומביננטי, ומסכי גנטי הפוכה. הקווים מעבדה (ML) מיצובישי/מיאקי נגזר דיסקים דמותי זחל או במערכת העצבים המרכזית (CNS), הם היו שימושיים עבור מחקרים בנושא neurosecretion, תקנה שעתוק RNA עיבוד. הקווים דיסק מילנר (CME) היה חשוב ללמוד מעבר אותות. הקווים תא המדרשה/OSS נגזר מוטציה השחלות למבוגרים נותרו ריאגנטים חשוב לחקור את ההשפעה ללא קידוד של הביולוגיה RNA קטנים תא הנבט תחזוקה ובידול17,19. לבסוף, הקווים ראס הם ייחודיים, כי אלה שורות תאים שמקורם עוברי ectopically לבטא את אונקוגן Ras. הם כוללים את החתימה תעתיק של תאי שריר קודמן, מבטא שמריהו פעיל מכונות20. סקירת מאמרים ופרקים לכסות את היישומים שורות אלה תא פופולרי עם יותר פרטים2,3,9.
כל שורות תאים אלה יכולים להיות subcultured, קפוא. יש דרישות שונות קלה, אבל חשוב על איך כל שורה תא ומשופרת לקראת הקפאה קריוגנית. לדוגמה, שורות תאים נפרדים לדרוש מדיה שונים ותוספי מזון (טבלה 1). הקווים משתנים גם במאפייני השטח הדבקות, מורפולוגיות (איור 1 ו- 2 איור), גנוטיפ, זמן ההכפלה (טבלה 2). אנו מציגים פרוטוקולים בסיסיים, להדגיש את ההבדלים ייחודי לטיפול הקווים השונים דרוזופילה בשימוש נרחב תא.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:899px;" width="898">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:354px;">100 mm tissue culture plates</td>
			<td style="width:252px;">Corning&#160;</td>
			<td align="right" style="width:123px;">430167</td>
			<td style="width:171px;">Subculturing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:354px;">25 cm2 T-flask</td>
			<td style="width:252px;">Corning&#160;</td>
			<td align="right" style="width:123px;">430168</td>
			<td>Subculturing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:354px;">35HC Liquid Nitrogen Storage Tank</td>
			<td style="width:252px;">Taylor-Wharton</td>
			<td style="width:123px;">35HCB-11M</td>
			<td>Cryopreservation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:354px;">Automated Cell counter</td>
			<td style="width:252px;">BIO-RAD</td>
			<td style="width:123px;">TC20</td>
			<td>Counting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:354px;">Bactopeptone</td>
			<td style="width:252px;">BD BioSciences</td>
			<td style="width:123px;">211677</td>
			<td>Medium additions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:354px;">Counting Slides</td>
			<td style="width:252px;">BIO-RAD</td>
			<td style="width:123px;">145-0011</td>
			<td>Counting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:354px;">Cryovial 1 mL</td>
			<td style="width:252px;">Greiner&#160;</td>
			<td align="right" style="width:123px;">123263</td>
			<td>Cryopreservation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:354px;">DMSO</td>
			<td style="width:252px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">D5879</td>
			<td>Cryopreservation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:354px;">Freezing Box</td>
			<td style="width:252px;">Nalgene</td>
			<td style="width:123px;">5029-0909</td>
			<td>Cryopreservation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:354px;">Freezing Container</td>
			<td style="width:252px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">15-350-50</td>
			<td>Cryopreservation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:354px;">Hematocytometer</td>
			<td style="width:252px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">#0267110</td>
			<td>Counting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:354px;">Human Insulin</td>
			<td style="width:252px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:123px;">I9278</td>
			<td>Medium additions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:354px;">Hyclone CCM3 media</td>
			<td style="width:252px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:123px;">SH30061.03</td>
			<td>Medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:354px;">Hyclone Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:252px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:123px;">SH30070.03</td>
			<td>Medium additions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Glutamic acid potassium salt monohydrate</td>
			<td style="width:252px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:123px;">G1149</td>
			<td>Medium additions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:354px;">L-Glutathione reduced</td>
			<td style="width:252px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:123px;">G6013</td>
			<td>Medium additions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:354px;">Potassium Bicarbonate</td>
			<td style="width:252px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:123px;">237205</td>
			<td>Medium additions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:354px;">Select Yeast Extract&#160;</td>
			<td style="width:252px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:123px;">Y1000</td>
			<td>Medium additions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:354px;">Shields and Sang&#39;s M3 Insect medium</td>
			<td style="width:252px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:123px;">S8398</td>
			<td>Medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:354px;">Trpsin-EDTA (0.05 %), phenol red&#160;</td>
			<td style="width:252px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">25300054</td>
			<td>Subculturing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:354px;">Trypan Blue (0.4%)</td>
			<td style="width:252px;">BIO-RAD</td>
			<td style="width:123px;">145-0013</td>
			<td>Counting</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

thawing, culturing, and cryopreserving drosophila cell lines

כיום יש מעל 160 ברורים דרוזופילה שורות תאים מופץ על ידי מרכז משאבים גנומיקה דרוזופילה (DGRC). עם הגנום הנדסה, מספר שורות תאים הרומן צפוי לגדול. DGRC שואפת להכיר חוקרים באמצעות שורות תאים דרוזופילה ככלי ניסיוני משלימים ולנסוע שלהם למחקר ופיתוח. נהלי עבודה עם מגוון רחב של שורות תאים דרוזופילה בעלי מאפיינים ברורים הינם מסופקים, לרבות פרוטוקולים עבור מפשיר culturing, cryopreserving שורות תאים. חשוב לציין, פרסום זה מדגים את שיטות עבודה מומלצות שבהן נדרש לעבוד עם דרוזופילה שורות תאים כדי למזער את הסיכון של מציג מיקרואורגניזמים adventitious או שורות תאים אחרים. החוקרים להכיר נהלים אלה יוכלו להתעמק היישומים רבים להשתמש בתאים דרוזופילה תרבותי כולל ביוכימיה, ביולוגיה של התא, גנומיקה תפקודית.

Watch this Scientific Journal Video about Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines at JoVE.com

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

שורות תאים דרוזופילה הם ריאגנטים חשוב למחקר בסיסי והן ביו. מאמר זה מספק פרוטוקולים מפשיר, subculturing של הקפאה קריוגנית של שורות תאים דרוזופילה נפוץ כדי לסייע לחוקרים שילוב השימוש האלה ריאגנטים במחקר שלהם.

מפשיר Culturing, Cryopreserving שורות תאים דרוזופילה

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...

פרוטוקולים אלה יסייעו לכל חוקר לשלב את השימוש בקווי תאים Drosophila כדי לנהוג או להשלים את סדר היום המחקרי שלהם. רוב אם לא כל תרבות התא Drosophila להחיות, להתרבות, קריו לשמר היטב כאשר מטופלים על פי הנחיות אלה. לאחר ניגוב משטח העבודה של מכסה המנוע לזרימה למינארית עם 70%אתנול, מחלקים חמישה מיליליטר של המדיום המתאים לתוך 25 ס"מ בריבוע T-בקבוק.מנגבים את מיכל קו התאים הקפואים עם 70% אתנול ומשחררים בזהירות ומשחררים את המכסה. באמצעות פיפטה פסטר, להעביר מיליליטר אחד של טמפרטורת החדר בינוני מן הבקבוקון כדי cryo-vial בעדינות לערבב להפשיר את התאים הקפואים. טיפול כי ההשעיה התא אינו עולה על גדותיו, להעביר את כל נפח ההשעיה תא מופשר לבקבוק ולשטוף את ההקפאה-בקבוקון עם מדיום טרי.אפשר לתאים להתיישב לתחתית הבקבוק לפחות שעתיים באינקובטור של 25 מעלות צלזיוס. אין להחזיר תאים קפואים הארוזים לנסיעה חזרה למקפיא של מינוס 80 מעלות צלזיוס לתקופה ממושכת או לחנקן נוזלי. במקום זאת להפשיר את התאים בהקדם האפשרי.לאחר אישור התקשרות תחת מיקרוסקופ אור, בעדינות להחליף את supernatant עם חמישה מיליליטר של מדיום טרי לפני החזרת הבקבוק לאנקובטור. לחלופין, לאחר הפשרה, להעביר את ההשעיה התא לתוך צינור חרוט 15 מיליליטר עבור צנטריפוגה מחדש להשעות את גלולה בחמישה מיליליטר של מדיום טרי לפני הזריעה לתוך בקבוק T-25 כפי שהודגם רק. כדי לקבוע אם התאים מוכנים למעבר, בחן את המורפולוגיה והמלומה של התרבות תחת מיקרוסקופ.בהתחשב בצפיפות התאים ובזמן ההכפלה, בפעם האחרונה התאים היו בתת-תרבת, וכל סימן לזיהום מיקרואורגניזם בתרבות. אם התרבות נראית מאוד confluent, להשתמש עשרה מיליליטר של supernatant התרבות בעדינות לנתק את התאים מלמטה צלחת התרבות ולקבוע את צפיפות התא על ידי ספירת מספר התאים קיימא המתלים תא יחיד וכתוצאה מכך. תת-תרבת את התאים אם צפיפות התאים היא בין חמש לעשר פעמים עשר לתא השישי למיליליטר במדיום המתאים.הוסף לפחות פעם אחת עשר לתאים השישיים לריכוז מיליליטר בצלחת תרבות חדשה כדי להשיג את צפיפות תאי הזריעה הרצויה. לאחר מכן לכסות ולתייג את הצלחות עם ראשי התיבות של האופרטור, תאריך, יחס פיצול, צפיפות תא זריעה, מזהה קו התא, בינוני, מספר המעבר, וכל תוספות בינוניות כגון אנטיביוטיקה, ולמקום את הצלחות לתוך מיכל פלסטיק עבור הדגירה המתמשכת שלהם ב 25 מעלות צלזיוס אינקובטור. כדי לנטרל תאים חסידים טופס צלחת תרבות 100 מילימטר התחתון, תחילה להעביר את כל העל טבעי לתוך בקבוק סטרילי ולשטוף את התאים עם תוספת איטית של מיליליטר אחד של 0.05% טריפסין EDTA.בעדינות מערבולת כדי להבטיח כי פתרון טריפסין מכסה את פני השטח הצמיחה כולה לפני השלכת הפתרון. לאחר מכן, מוסיפים בעדינות 1-2 מיליליטר של 0.05% טריים טריים טריים EDTA לצלחת ומ מניחים את הצלחת באינקובטור 25 מעלות צלזיוס במשך שלוש עד עשר דקות. כאשר ניתן לראות את שכבת התא מתנתקה ומחליקה מפני השטח הגדלים, הפסק את פעילות הטרפסין עם תוספת של תשעה מיליליטר של העל-טבעי שנשמר וערבב את מתלי התא ביסודיות כדי לנתק את גושי התאים.כאשר כל התאים כבר נקע, פני השטח הגדלים יהיו ברורים. כדי לספור ידנית את התאים באמצעות שקופית ספירת תאים של Neubauer, נגב תחילה את פני השטח של מגלשת המוציטים וכיסוי עם 70% אלכוהול. לאחר הערבוב, מוסיפים 15 מיקרוליטרים של התאים לכל קצה מחוריץ של ההמוציטומטר כדי למלא את שני התאים.השעיית התא תימשך לתא הספירה על ידי פעולה נימית. באמצעות מטרת מיקרוסקופ 10x, לספור בין 100 ל 200 תאים בתוך אזור בריבוע מילימטר אחד באמצע הרשת מאוגד על ידי הקווים המקבילים. לאחר מכן חזור על הספירה עם התא השני ולהשתמש בממוצע של שני הספירות כדי לקבוע את צפיפות התא על פי הנוסחה.עבור שימור קריו קו תא Drosophila, להשעות מחדש את גלולת התא בנפח של מדיום הקפאה שתביא צפיפות התא הסופי של לפחות ארבע פעמים עשר לתאים השביעי למיליליטר. הוסף נפח מתאים של מגן קריו, דימתיל sulfoxide או DMSO, לתוך ההשעיה התא טיפה חכם, כך ריכוז DMSO הסופי הוא 10% בעדינות לערבב את ההשעיה התא. לאחר מכן, בזהירות להוסיף 0.5 aliquots מיליליטר של ההשעיה התא לתוך הקפאה שכותרתו מראש בקבוקונים ומניחים את ההקפאה בקבוקונים לתוך מיכל הקפאה מלא isopropanol.לאחר מכן מעבירים את מיכל ההקפאה למקפיא מינוס 80 מעלות צלזיוס במהלך הלילה כדי לאפשר לטמפרטורה של הבקבוקונים ההקפאה לרדת לאט לטמפרטורת המקפיא. לאחר מכן, מעבירים במהירות את ההקפאה-בקבוקונים למ מקלות להכנסה לתוך מיכל חנקן נוזלי. לחלופין, מעבירים את הבקבוקונים הקפואים לקופסת הקפאה מקורר מראש ומאחסנים את בקבוקוני ההקפאה הקפואים בשלב הנוזלי של מקפיא חנקן.ההתכנסות של קו תא יכולה להיקבע על ידי מיקרוסקופ אור. קווי תאים הגדלים במהירות ולהגיע להתכנסות מוקדם צריכים לעבור באופן קבוע, עד פעמיים בשבוע. לעומת זאת, תאים הגדלים לאט ניתן לעבור לפחות פעם בשבועיים או יותר, אם כי תאים אלה צריכים להיות מוזן בינוני טרי מדי שבוע.קווי תאים הנגזרים ממקורות רקמה משתנים שונים במורפולוגיה שלהם, במאפייני הדבקה, בדרישות המדיה ובזמנים הכפלתיים. עבור ניסויים כמותיים, ספירת תאים היא חיונית. ניתן לספור את התאים באמצעות מד חמוציט או מונה חלקיקים אוטומטי.התכנסות תאים היא קו עזר חזותי למתי לתת-תרבות עבור האופרטור המנוסה. עם זאת, ספירת תאים מובילה ללוח זמנים צפוי של תת-תרבות ומאפשרת זיהוי של חריגות צמיחה. היזהר ולהשתמש בציוד המגן המתאים בעת עבודה עם חנקן נוזלי.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

אוכלוסיות תאי דם Assaying של<em&gt; תסיסנית melanogaster</em&gt; זחל

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila ...

Establishment of Genome-edited Human Pluripotent Stem Cell Lines: From Targeting to Isolation

הקמת שורות תאי גזע pluripotent האדם בעריכה-הגנום: ממיקוד לבידוד

Genome-editing of human pluripotent stem cells (hPSCs) provides a genetically controlled and clinically relevant platform from which to understand human ...

Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research

Culturing האדם pluripotent ואת עצבי תאי גזע מערכת תרבית תאים סגורות למחקר בסיסי פרה

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety ...

Imaging of Cell Shape Alteration and Cell Movement in Drosophila Gastrulation Using DE-cadherin Reporter Transgenic Flies

Imaging of Cell Shape Alteration and Cell Movement in Drosophila Gastrulation Using DE-cadherin Reporter Transgenic Flies

הדמיה של שינוי צורה של התא ותנועתו ב<em&gt; תסיסנית</em&gt; Gastrulation שימוש Reporter DE-cadherin זבובים טרנסגניים

Gastrulation is the first set of morphologically dynamic events that occur during the embryonic development of multicellular animals such as Drosophila. ...

Derivation of Stem Cell Lines from Mouse Preimplantation Embryos

נגזרת של שורות תאי גזע מעוברים של עכבר

Mouse embryonic stem cell (mESC) derivation is the process by which pluripotent cell lines are established from preimplantation embryos. These lines ...

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

חיתוך, צביעה של השחלות הגולמי דרוזופילה

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a ...

An Efficient Strategy for Generating Tissue-specific Binary Transcription Systems in Drosophila by Genome Editing

An Efficient Strategy for Generating Tissue-specific Binary Transcription Systems in Drosophila by Genome Editing

אסטרטגיית יעיל ליצירת מערכות רקמות ספציפיות שעתוק בינאריים ב דרוזופילה על-ידי עריכת הגנום

Binary transcription systems are powerful genetic tools widely used for visualizing and manipulating cell fate and gene expression in specific groups of ...

In Vitro Assays to Evaluate the Migration, Invasion, and Proliferation of Immortalized Human First-trimester Trophoblast Cell Lines

במבחני חוץ גופית כדי להעריך את ההעברה הפלישה, התפשטות של שורות תאים מונצחים Trophoblast בטרימסטר הראשון אנושי

Cell movement is a critical property of trophoblasts during placental development and early pregnancy. The significance of proper trophoblast migration ...

Culturing and Measuring Fetal and Newborn Murine Long Bones

Culturing ומדידת עוברי והיילוד מורנה עצמות ארוכות

Long bones are complex and dynamic structures, which arise from endochondral ossification via a cartilage intermediate. The limited access to healthy ...

Cell-cell Fusion of Genome Edited Cell Lines for Perturbation of Cellular Structure and Function

תא תא פיוז'ן של הגנום בעריכה קווי תאים עבור פרטורבציה של מבנה הסלולר ותפקוד

Life is spatially partitioned within lipid membranes to allow the isolated formation of distinct molecular states inside cells and organelles. Cell fusion ...