Name: thawing, culturing, and cryopreserving drosophila cell lines
Uploaded: 2019-04-16T15:00:00
Duration: 7 min 57 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines at JoVE.com

हम राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (पुरस्कार nih P40OD010949) और अनुसंधान समुदाय के विभिंन D. melanogaster डीएनए का उपयोग करने के लिए धंयवाद/वेक्टर/सेल संसाधनों dgrc पर क्यूरेट ।

1. गल रही और जम गई ड्रोसोफिला सेल लाइनों को पुनर्जीवित
<ol><li>७०% इथेनॉल के साथ काम कर सतह पोंछते द्वारा हुड जीवाणुरहित । उपयुक्त माध्यम के 5 मिलीलीटर (तालिका 1) को 25 सेमी2 टी-फ्लास्क (t-25) में बांटना ।</li>
	<li>तरल N2 या सूखी बर्फ से cryovial/ ७०% इथेनॉल के साथ cryovial पोंछ, ध्यान से ढीला और ऐंपुले unseal ।</li>
	<li>एक पाश्चर पिपेट का प्रयोग, टी 25 फ्लास्क से कमरे के तापमान (आरटी) मीडिया के 1 मिलीलीटर वापस ले लो । धीरे से cryovial में मीडिया जोड़ने और धीरे से जमे हुए कोशिकाओं गल मिश्रण, यह सुनिश्चित करना है कि सेल निलंबन ओवरफ्लो नहीं करता है ।</li>
	<li>टी-25 फ्लास्क में एम्पुले से थैड सेल सस्पेंशन की पूरी मात्रा को ट्रांसफर कर दीजिये । यह सुनिश्चित करने के लिए दोहराएं सेल निलंबन पूरी तरह से स्थानांतरित कर दिया गया है ।</li>
	<li>एक 25 ° c इनयूबेटर में फ्लास्क रखें, कोशिकाओं को व्यवस्थित करने की अनुमति देता है और कम से 2 h के लिए पालन करता है । यह सुनिश्चित करने के लिए कि अधिकांश कोशिकाएँ बढ़ती सतह पर बस गई हैं, एक सूक्ष्मदर्शी के अंतर्गत कक्षों का परीक्षण करें. धीरे पुराने मीडिया को हटाने और ताजा मीडिया के 5 मिलीलीटर के साथ बदलें । इनयूबेटर में फ्लास्क को लौटाएं ।</li>
	<li>अगले दिन, धीरे पुराने मीडिया को हटाने और ताजा मीडिया के 5 मिलीलीटर के साथ बदलें । संस्कृति को इनयूबेटर में लौटाएं ।</li>
</ol>2. गल और जम Drosophila सेल लाइनों फूंकने (वैकल्पिक)
<ol><li>एक हुड में, टी टी मीडिया के 1 मिलीलीटर के साथ जमे हुए गोली resuspending द्वारा कोशिकाओं गल । एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में सभी गल सेल निलंबन स्थानांतरण ।</li>
	<li>5 मिनट के लिए १,००० x g पर केंद्रापसारक द्वारा कोशिकाओं गोली. supernatant छोड़ें और ताजा मीडिया के 5 मिलीलीटर में सेल गोली resuspend ।</li>
	<li>सेल निलंबन की पूरी मात्रा को एक टी-25 फ्लास्क में अंतरित करें और संस्कृति को 25 डिग्री सेल्सियस पर सेते ।</li>
	<li>1 से 2 ज बाद में, यह सुनिश्चित करने के लिए माइक्रोस्कोप के अंतर्गत कक्षों की जांच करें कि अधिकांश कोशिकाएँ बढ़ती सतह पर बस गई हैं. अगले दिन, नए मीडिया के 5 मिलीलीटर के साथ पुराने मीडिया की जगह है और इनयूबेटर को संस्कृति वापस ।</li>
</ol>3. Subculturing अर्द्ध आसंन कोशिकाओं १०० मिमी संस्कृति प्लेटों में उगाया
<ol><li>७०% इथेनॉल के साथ पोंछते द्वारा डाकू । मीडिया की बोतलें, पिपेट, pipettes सहायता, और संस्कृति प्लेटों सहित हुड में subculturing के लिए सामग्री लाओ ।</li>
	<li>एक माइक्रोस्कोप के तहत संस्कृति की आकृति विज्ञान और संगम की जांच करें । संस्कृति में microorganismal क्रासॅ के स्पष्ट संकेत के लिए देखो । निर्धारित करें कि क्या कक्ष passaged करने के लिए तैयार हैं, संस्कृति की विशेषताओं के आधार पर: सेल घनत्व और दोहरीकरण समय, पिछली बार वे subcultured थे सहित ।</li>
	<li>यदि संस्कृति अत्यधिक संगामी (चित्रा 1) प्रकट होता है, कोशिका घनत्व का निर्धारण । हुड में, थाली से मध्यम के 10 मिलीलीटर तक के लिए और यह कोशिकाओं पर वितरण के द्वारा बढ़ती सतह से कोशिकाओं को उखाड़ देना । कुछ समय दोहराएं, फोम बनाने के लिए नहीं सुनिश्चित करने, जब तक बढ़ती सतह स्पष्ट हो जाता है । एक hemocytometer या एक स्वचालित कण काउंटर का उपयोग कर कोशिका घनत्व का निर्धारण (धारा 5, चित्रा 3). कोशिकाओं उपसंस्कृति यदि कोशिका घनत्व 5 x 106 और 1 x 107 कोशिकाओं के बीच है/ नोट: 1 x 106 कोशिकाओं/एमएल से नीचे एक कोशिका घनत्व के लिए उपसंस्कृति Drosophila सेल लाइनों मत करो ।</li>
	<li>
तदनुसार कोशिका निलंबन को कम से न्यूनतम 1 x 106 कोशिकाओं/एमएल की अंतिम सीडिंग एकाग्रता के लिए एक उपयुक्त माध्यम का उपयोग कर ।
	<ol>
<li>दिनचर्या passaging और रखरखाव के लिए, एक नई संस्कृति थाली में मध्यम की एक पूर्व निर्धारित मात्रा के लिए वांछित बोने सेल घनत्व को प्राप्त करने के लिए सेल निलंबन की एक उचित मात्रा में जोड़ें ।</li>
		<li>एक संस्कृति स्केलिंग के लिए, एक बड़े फ्लास्क में सभी सेल निलंबन स्थानांतरण । सेल निलंबन वांछित कोशिका घनत्व के माध्यम से एक उचित मात्रा के साथ पतला । पतला सेल निलंबन के समान मात्रा नई प्लेटों को वितरित । यह पद्धति प्लेटों के बीच कोशिका घनत्व में भिन्नता को कम करती है ।</li>
	</ol>
</li>
	<li>ऑपरेटर प्रथमाक्षर, तिथि, विभाजन अनुपात, सीडिंग कोशिका घनत्व, कोशिका रेखा पहचानकर्ता, मीडिया, मार्ग संख्या और एंटीबायोटिक जैसे किसी भी मीडिया परिवर्धन के साथ प्लेट्स को कवर और लेबल करें ।</li>
	<li>प्लेटों को एक प्लास्टिक कंटेनर में रखें और इनयूबेटर को बॉक्स वापस करें । नोट: सारणी 3 में संस्कृति वाहिकाओं को सामान्यतः कल्टुरिंग ड्रोसोफिला कोशिका रेखाओं और संबद्ध कार्य खंडों के लिए प्रयोग किया जाता है ।</li>
</ol>4. १०० मिमी कल्चर प्लेट्स में उगाए गए आसंन कोशिकाओं को अस्त करना
<ol><li>थाली से एक नया बाँझ फ्लास्क के लिए सभी माध्यम स्थानांतरण. मध्यम सहेजें ।</li>
	<li>धीरे से कोशिकाओं कुल्ला ०.०५% trypsin की 1 मिलीलीटर-EDTA थाली को जोड़कर । Swirl धीरे ट्रिप् सिन समाधान सुनिश्चित करने के लिए पूरे विकास की सतह को शामिल किया गया । ट्रिप् सिन समाधान छोड़ें ।</li>
	<li>धीरे से प्लेट में ०.०५% trypsin के 1 मिलीलीटर-EDTA जोड़ें । प्लेट को 3 − 10 मिनट के बीच 25 डिग्री सेल्सियस पर सेते हुए, जबकि कोशिका परत के दृश्यमान संकेतों के लिए मॉनीटर करना और बढ़ती हुई सतह को बंद करना ।</li>
	<li>ट्रिप् सिन गतिविधि को रोकने के लिए प्लेट के लिए बचाया मध्यम के 9 मिलीलीटर जोड़ें । कक्ष को असंबद्ध करने के लिए कक्ष निलंबन मिलाएं । एक बार सभी कोशिकाओं को उखाड़ दिया गया है, बढ़ती सतह स्पष्ट हो जाएगा । नोट: इस तरह के प्रयोग के पाचन एंजाइमों के रूप में ट्रिप् सिन दृढ़ता से आसंन कोशिका लाइनों passaging में एड्स । Trypsin अक्सर सुअर का अग्ंयाशय से व्युत्पंन proteases का एक मिश्रण है और शुद्धता के विभिंन ग्रेड में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है ।</li>
</ol>5. मैनुअल सेल की गिनती का उपयोग कर न्यूबयूअर सेल की मतगणना स्लाइड
<ol><li>७०% शराब के साथ सतह पोंछते द्वारा hemocytometer स्लाइड और coverslip तैयार करें ।</li>
	<li>कोशिका निलंबन का मिश्रण है और hemocytometer के पहले कक्ष को भरने के लिए (चित्रा 3A) कोशिका निलंबन के 15 μl का वितरण करने के लिए । हीमोसेटोमीटर का दूसरा चैम्बर भरें । केशिका क्रिया द्वारा मतगणना कक्ष में सेल सस्पेंशन तैयार किया जाएगा ।</li>
	<li>एक 10x माइक्रोस्कोप उद्देश्य का उपयोग कर, समानांतर लाइनों से बंधे ग्रिड के बीच में 1 मिमी2 क्षेत्र के भीतर कोशिकाओं गिनती (चित्रा 3 सी,डी). डुप्लिकेट काउंटिंग से बचने के लिए, उन कक्षों की गणना करें जो शीर्ष और बाईं सीमाओं को आच्छादित करते हैं, लेकिन उन कक्षों को नहीं जो २०० μm2 वर्गों की दाईं और निचली सीमाएं पार करते हैं । 100 − 200 कोशिकाओं के बीच गणना कीजिए । दूसरे चैंबर के साथ गिनती दोहराएं ।</li>
	<li>दो गणनाओं के औसत की गणना करें और निम्नलिखित सूत्र के अनुसार कोशिका घनत्व का निर्धारण करें: कोशिका घनत्व (कोशिकाओं/एमएल) = औसत कोशिका गणना (n1 + n2/2) x 104. नोट: सेल व्यवहार्यता कुल कोशिकाओं पर व्यवहार्य कोशिकाओं के प्रतिशत के रूप में व्यक्त की है । सेल व्यवहार्यता का निर्धारण करने के लिए, एक समान मात्रा के साथ सेल निलंबन का मिश्रण trypan ब्लू (०.४%) मैनुअल या स्वचालित सेल गिनती से पहले समाधान । जीवित कोशिकाओं को डाई नहीं ले जाएगा, जबकि मृत कोशिकाओं नीले दाग हो जाएगा ।</li>
</ol>6. Drosophila सेल लाइनों के Cryopreservation
<ol><li>स्वस्थ morphology, विकास, और संदूषण की कमी के लिए संस्कृति की जाँच करें । फसल मध्य से देर से संस्कृतियों-लॉग वृद्धि चरण (कदम ३.३, या धारा 4) । कई Drosophila सेल लाइनों के लिए, यह लगभग है के बीच 4 x 106 कोशिकाओं/एमएल से 8 x 106 कोशिकाओं/</li>
	<li>एक 15 मिलीलीटर या ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब में पूरे सेल निलंबन स्थानांतरण । 5 मिनट के लिए १,००० x g पर केंद्रापसारक द्वारा कोशिकाओं को इकट्ठा करने और supernatant त्यागने ।</li>
	<li>जमने वाले मीडियम (सारणी 4) के आयतन में कोशिका गुलिका को पुनः भिजवाएं, जिसके परिणामस्वरूप कम से 4 x 107 कोशिकाओं/एमएल का अंतिम कोशिका घनत्व होगा ।</li>
	<li>ड्रॉप-वार इस सेल में cryoprotectant डाइमेथिल सल्फोक्साइड (DMSO) के उपयुक्त मात्रा में जोड़ें निलंबन ऐसी है कि अंतिम DMSO एकाग्रता 10% है । धीरे से सेल सस्पेंशन मिलाएं ।</li>
	<li>ध्यान से सेल निलंबन के पूर्व के aliquots में ०.५ मिलीलीटर का वितरण-लेबल क्रायोविल्स (~ 2 x 107 कोशिकाओं/ एम्क्यूल्स को आइसोप्रोपानोल से भरे हुए हिमांक कंटेनर में रखें (चित्र 4a) । एक में ठंड कंटेनर स्थानांतरण-८० ° c फ्रीजर रातोंरात cryovials के तापमान को छोड़ने के लिए अनुमति देने के लिए (-1 डिग्री सेल्सियस/</li>
	<li>जमे हुए cryovials बाहर ले लो और तेजी से उन्हें canes (चित्रा 4B) के लिए देते हैं । क्रियोविल्स युक्त canes को एक कनस्तर (चित्रा 4C) में डालें । वैकल्पिक रूप से, एक पूर्व ठंडा हिमांक बॉक्स (चित्रा 4D) के अंदर जमे हुए cryovials प्लेस । N2 फ्रीजर (चित्रा 4e,F) के तरल चरण में जमे हुए cryovials स्टोर । नोट: जब ठंड DMSO युक्त मीडिया का उपयोग कर, आरटी में 30 मिनट तक की देरी कोशिकाओं के लिए हानिकारक नहीं है ।</li>
</ol>

<ol>
	<li>Baum, B., Cherbas, L., Dahmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila:+Methods+and+Protocols.">Drosophila: Methods and Protocols.</a> Methods in Molecular Biology. 420, 391-424 (2008).</li><li>Cherbas, L., Gong, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lines.">Cell lines.</a> Methods. 68 (1), 74-81 (2014).</li><li>Luhur, A., Klueg, K. M., Zelhof, A. 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लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Drosophila सुसंस्कृत कोशिकाओं का उपयोग vivo में पूरक आनुवंशिक विश्लेषण मक्खी और कई बुनियादी जैविक प्रश्नों1,2,3को संबोधित करने के लिए एक प्राथमिक जांच उपकरण के रूप में कार्य करता है । Drosophila सेल लाइनों अलग आनुवंशिक पृष्ठभूमि के साथ विभिन्न ऊतक स्रोतों से व्युत्पंन कोशिकाओं की अनूठी समरूप आबादी प्रदान करते हैं । सेल लाइनों ट्रांसजेनिक जीन अभिव्यक्ति, जीनोमिक्स, transक्रिप्टोमिक्स, proteomics, metabolomics, उच्च थ्रॉपुट आरएनए हस्तक्षेप (Rna) स्क्रीन, सेल बायोलॉजी और माइक्रोस्कोपी सहित कई अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त हैं । महत्वपूर्ण बात, Drosophila सेल संस्कृति का उपयोग ज्ञात उत्तेजनाओं को तत्काल लौकिक प्रतिक्रियाओं के लक्षण वर्णन की सुविधा । इसके अलावा, drosophila सेल संस्कृति crispr करने के लिए उत्तरदाई है-Cas9 जीनोम संपादन, यह अपेक्षाकृत आसान बनाने के लिए विशिष्ट जीनोम संशोधनों के साथ नए सेल लाइनों बनाने के4,5,6, 7.
Drosophila जीनोमिक्स संसाधन केंद्र (DGRC) एक भंडार और drosophila सेल लाइनों के लिए वितरण केंद्र के रूप में कार्य करता है । DGRC के लक्ष्यों में से एक Drosophila सेल संस्कृति संसाधनों का उपयोग करने में अनुसंधान समुदाय के सदस्यों की सहायता करने के लिए है । यह आलेख Drosophila कक्ष रेखाओं की हैंडलिंग के लिए मूल प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है । यह मौजूदा संसाधनों को मदद करने के लिए शोधकर्ताओं drosophila सेल संस्कृतियों हैंडलिंग और उनके प्रयोगों में स्वतंत्रता के एक स्तर को प्राप्त करने के साथ सहज हो पूरक1,2,8,9 ,10.
सबसे अधिक इस्तेमाल किया drosophila सेल लाइनों रहे हैं: schneider लाइनों11, Kc16712, मित्सुबिशी/miyake पूर्णक डिस्क और केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) लाइनों13,14, मिलनर प्रयोगशाला पूर्णक डिस्क लाइनों 15, वयस्क ओवेरियन कोशिका रेखाएं16,17, और रास रेखाएं18 (तालिका 1) । Schneider और Kc167 lines सामांय सभी प्रयोजन कोशिका लाइनों biochemistry, पुनः संयोजक ट्रांसजेनिक जीन अभिव्यक्ति, और रिवर्स आनुवंशिक स्क्रीन में उपयोग के लिए कर रहे हैं । मित्सुबिशी/मियाके प्रयोगशाला (एमएल) लाइनों या तो लार्वा पूर्णक डिस्क या केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) से व्युत्पंन किया गया और वे neurosecretion, प्रतिलेखन विनियमन, और आरएनए प्रसंस्करण से संबंधित अध्ययन के लिए उपयोगी रहा है । मिल्नर (सीएमई) डिस्क लाइनें सिग्नल ट्रांसडक्शन का अध्ययन करने के लिए महत्वपूर्ण रही हैं । उत्परिवर्ती वयस्क अंडाशय से व्युत्पन्न एफजीएस/ओएसएस कोशिका रेखाएँ रोगाणु कोशिका अनुरक्षण और विभेद17,19में गैर-कोडिंग लघु आरएनए जीव विज्ञान के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए महत्वपूर्ण अभिकर्मकों के रूप में बनी रहती हैं । अंत में, रास लाइनें अद्वितीय है क्योंकि इन कोशिकाओं को भ्रूण से व्युत्पंन लाइनों ectopically रास oncogene व्यक्त कर रहे हैं । वे मांसपेशियों के अग्रदूत कोशिकाओं के transअपंग हस्ताक्षर किया है और सक्रिय पीरना मशीनरी20व्यक्त करता है । हाल ही में समीक्षा लेख और पुस्तक अध्याय अधिक विवरण2,3,9के साथ इन लोकप्रिय सेल लाइनों के अनुप्रयोगों को कवर ।
इन सभी सेल लाइनों को उपकल्पि और जम कर किया जा सकता है । वहां एक सेल लाइन बनाए रखा है और cryopreservation के लिए तैयार कैसे के लिए थोड़ा लेकिन महत्वपूर्ण अलग आवश्यकताओं हैं । उदाहरण के लिए, भिंन कक्ष रेखाओं की आवश्यकता होती है विभिंन मीडिया और पूरक (तालिका 1) । रेखाएं भी सतह पालन गुण, morphologies (चित्रा 1 और चित्रा 2), जीनोटाइप और दोहरीकरण समय (तालिका 2) में बदलती हैं । हम बुनियादी प्रोटोकॉल वर्तमान और विभिंन व्यापक रूप से इस्तेमाल किया Drosophila सेल लाइनों से निपटने के लिए अद्वितीय मतभेदों को उजागर ।

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:899px;" width="898">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:354px;">100 mm tissue culture plates</td>
			<td style="width:252px;">Corning&#160;</td>
			<td align="right" style="width:123px;">430167</td>
			<td style="width:171px;">Subculturing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:354px;">25 cm2 T-flask</td>
			<td style="width:252px;">Corning&#160;</td>
			<td align="right" style="width:123px;">430168</td>
			<td>Subculturing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:354px;">35HC Liquid Nitrogen Storage Tank</td>
			<td style="width:252px;">Taylor-Wharton</td>
			<td style="width:123px;">35HCB-11M</td>
			<td>Cryopreservation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:354px;">Automated Cell counter</td>
			<td style="width:252px;">BIO-RAD</td>
			<td style="width:123px;">TC20</td>
			<td>Counting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:354px;">Bactopeptone</td>
			<td style="width:252px;">BD BioSciences</td>
			<td style="width:123px;">211677</td>
			<td>Medium additions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:354px;">Counting Slides</td>
			<td style="width:252px;">BIO-RAD</td>
			<td style="width:123px;">145-0011</td>
			<td>Counting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:354px;">Cryovial 1 mL</td>
			<td style="width:252px;">Greiner&#160;</td>
			<td align="right" style="width:123px;">123263</td>
			<td>Cryopreservation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:354px;">DMSO</td>
			<td style="width:252px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">D5879</td>
			<td>Cryopreservation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:354px;">Freezing Box</td>
			<td style="width:252px;">Nalgene</td>
			<td style="width:123px;">5029-0909</td>
			<td>Cryopreservation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:354px;">Freezing Container</td>
			<td style="width:252px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">15-350-50</td>
			<td>Cryopreservation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:354px;">Hematocytometer</td>
			<td style="width:252px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">#0267110</td>
			<td>Counting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:354px;">Human Insulin</td>
			<td style="width:252px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:123px;">I9278</td>
			<td>Medium additions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:354px;">Hyclone CCM3 media</td>
			<td style="width:252px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:123px;">SH30061.03</td>
			<td>Medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:354px;">Hyclone Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:252px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:123px;">SH30070.03</td>
			<td>Medium additions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Glutamic acid potassium salt monohydrate</td>
			<td style="width:252px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:123px;">G1149</td>
			<td>Medium additions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:354px;">L-Glutathione reduced</td>
			<td style="width:252px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:123px;">G6013</td>
			<td>Medium additions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:354px;">Potassium Bicarbonate</td>
			<td style="width:252px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:123px;">237205</td>
			<td>Medium additions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:354px;">Select Yeast Extract&#160;</td>
			<td style="width:252px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:123px;">Y1000</td>
			<td>Medium additions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:354px;">Shields and Sang&#39;s M3 Insect medium</td>
			<td style="width:252px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:123px;">S8398</td>
			<td>Medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:354px;">Trpsin-EDTA (0.05 %), phenol red&#160;</td>
			<td style="width:252px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">25300054</td>
			<td>Subculturing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:354px;">Trypan Blue (0.4%)</td>
			<td style="width:252px;">BIO-RAD</td>
			<td style="width:123px;">145-0013</td>
			<td>Counting</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

thawing, culturing, and cryopreserving drosophila cell lines

वहां वर्तमान में १६० अलग drosophila सेल Drosophila जीनोमिक्स संसाधन केंद्र (DGRC) द्वारा वितरित लाइनों से अधिक कर रहे हैं । जीनोम इंजीनियरिंग के साथ, उपंयास सेल लाइनों की संख्या में वृद्धि की उंमीद है । DGRC को पूरक और उनके अनुसंधान एजेंडा ड्राइव करने के लिए एक प्रयोगात्मक उपकरण के रूप में Drosophila सेल लाइनों का उपयोग कर के साथ शोधकर्ताओं परिचित करना है । अलग विशेषताओं के साथ Drosophila सेल लाइनों की एक किस्म के साथ काम करने के लिए प्रक्रियाओं, thawing के लिए प्रोटोकॉल सहित प्रदान की जाती हैं, culturing, और cryopreserving सेल लाइनों । महत्वपूर्ण बात यह है कि यह प्रकाशन सबसे अच्छा करने के लिए drosophila सेल लाइनों के साथ काम करने के लिए आवश्यक प्रथाओं को दर्शाता है कि अपस्थानिक सूक्ष्मजीवों या अंय सेल लाइनों से क्रासॅ के जोखिम को कम । शोधकर्ताओं ने जो इन प्रक्रियाओं से परिचित हो कई अनुप्रयोगों है कि biochemistry सहित Drosophila सुसंस्कृत कोशिकाओं का उपयोग में तल्लीन करने में सक्षम हो जाएगा, कोशिका जीव विज्ञान और कार्यात्मक जीनोमिक्स ।

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Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Drosophila सेल लाइनों मौलिक और जैव चिकित्सा अनुसंधान दोनों के लिए महत्वपूर्ण अभिकर्मकों हैं । यह लेख thawing के लिए प्रोटोकॉल प्रदान करता है, subculturing, और आमतौर पर इस्तेमाल किया Drosophila सेल लाइनों के cryopreservation अपने अनुसंधान में इन अभिकर्मकों के उपयोग को शामिल करने में शोधकर्ताओं की सहायता के लिए ।

गल, Culturing, और Cryopreserving Drosophila सेल लाइनों

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...

ये प्रोटोकॉल किसी भी शोधकर्ता को अपने शोध एजेंडे को चलाने या पूरक करने के लिए ड्रोसोफिला सेल लाइनों के उपयोग को शामिल करने में मदद करेंगे। इन दिशा-निर्देशों के अनुसार संरक्षित होने पर सभी ड्रोसोफिला सेल संस्कृतियां पुनर्जीवित, पैदा होती हैं और क्रायो-संरक्षित अच्छी तरह से होती हैं। 70% इथेनॉल के साथ एक लेमिनार प्रवाह हुड की काम की सतह को पोंछने के बाद, उपयुक्त माध्यम के पांच मिलीलीटर को 25 सेंटीमीटर चुकता टी-फ्लास्क में बांटें।70% इथेनॉल के साथ जमे हुए सेल लाइन के कंटेनर को पोंछें और ढक्कन को ध्यान से ढीला और अनसील करें। एक पाश्चर पिपेट का उपयोग करके, कमरे के तापमान माध्यम के एक मिलीलीटर को फ्लास्क से क्रायो-शीशी में स्थानांतरित करें और जमे हुए कोशिकाओं को पिघलाने के लिए धीरे-धीरे मिलाएं। यह ध्यान रखते हुए कि सेल निलंबन ओवरफ्लो नहीं होता है, गल सेल निलंबन की पूरी मात्रा को फ्लास्क में स्थानांतरित करें और ताजा माध्यम के साथ क्रायो-शीशी को कुल्ला दें।कोशिकाओं को 25 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में कम से कम दो घंटे के लिए फ्लास्क के नीचे बसने की अनुमति दें। जमे हुए कोशिकाओं है कि एक लंबी अवधि के लिए या तरल नाइट्रोजन में शून्य से ८० डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में वापस यात्रा के लिए पैक किया गया है वापस मत करो । इसके बजाय कोशिकाओं ASAP गल ।एक हल्के माइक्रोस्कोप के तहत लगाव की पुष्टि करने के बाद, धीरे से इनक्यूबेटर को फ्लास्क लौटने से पहले ताजा माध्यम के पांच मिलीलीटर के साथ supernatant की जगह । वैकल्पिक रूप से, विगलन के बाद, सेल निलंबन को अपकेंद्रित्र के लिए 15 मिलीलीटर शंकु नली में स्थानांतरित करें और टी-25 फ्लास्क में बोने से पहले ताजा माध्यम के पांच मिलीलीटर में गोली को फिर से निलंबित करें जैसा कि सिर्फ प्रदर्शन किया गया था। यह निर्धारित करने के लिए कि कोशिकाएं पारित होने के लिए तैयार हैं या नहीं, माइक्रोस्कोप के नीचे संस्कृति के आकृति विज्ञान और संगम की जांच करें।कोशिका घनत्व और दोहरीकरण समय को ध्यान में रखते हुए, पिछली बार कोशिकाओं को उप-संस्कारी, और संस्कृति में सूक्ष्मजीव संदूषण के किसी भी संकेत थे। यदि संस्कृति अत्यधिक अनुकूल प्रतीत होती है, तो संस्कृति प्लेट नीचे से कोशिकाओं को धीरे-धीरे उखाड़ फेंकने के लिए संस्कृति सुपरनेट्टर के दस मिलीलीटर का उपयोग करें और परिणामस्वरूप एकल कोशिका निलंबन में व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या की गणना करके कोशिका घनत्व का निर्धारण करें। उप संस्कृति कोशिकाओं अगर कोशिका घनत्व के बीच पांच से दस गुना दस के बीच उपयुक्त माध्यम में मिलीलीटर प्रति छठी कोशिकाओं के लिए है ।वांछित सीडिंग सेल घनत्व प्राप्त करने के लिए एक नई संस्कृति प्लेट में मिलीलीटर एकाग्रता प्रति छठी कोशिकाओं में कम से कम एक गुना दस जोड़ें। फिर ऑपरेटर प्रथमाक्षर, तिथि, विभाजन अनुपात, सीडिंग सेल घनत्व, सेल लाइन पहचानकर्ता, मध्यम, मार्ग संख्या, और एंटीबायोटिक दवाओं जैसे किसी भी मध्यम परिवर्धन के साथ प्लेटों को कवर और लेबल करें, और प्लेटों को 25 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में अपने निरंतर इनक्यूबेशन के लिए प्लास्टिक कंटेनर में रखें। अनुयायी कोशिकाओं को उखाड़ फेंकने के लिए एक 100 मिलीमीटर संस्कृति पकवान नीचे बनाते हैं, पहले सभी सुपरनटेंट को बाँझ फ्लास्क में स्थानांतरित करते हैं और कोशिकाओं को 0.05% ट्राइप्सिन ईडीटीए के एक मिलीलीटर के धीमी गति से जोड़ते हैं।धीरे-धीरे यह सुनिश्चित करने के लिए घूमता है कि ट्राइप्सिन समाधान समाधान को त्यागने से पहले पूरे विकास की सतह को कवर करता है। इसके बाद, धीरे-धीरे प्लेट में ताजा 0.05% ट्राइप्सिन ईडीटीए के एक से दो मिलीलीटर जोड़ें और प्लेट को तीन से दस मिनट के लिए 25 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखें। जब सेल परत को बढ़ती सतह से अलग और फिसलने के लिए देखा जा सकता है, तो बचाया गया सुपरनेट के नौ मिलीलीटर के अलावा ट्राइप्सिन गतिविधि को रोकें और सेल झुरमुटों को अलग करने के लिए सेल निलंबन को अच्छी तरह से मिलाएं।जब सभी कोशिकाओं को उखाड़ दिया गया है, तो बढ़ती सतह स्पष्ट हो जाएगी। न्यूबॉयर सेल काउंटिंग स्लाइड का उपयोग करके कोशिकाओं को मैन्युअल रूप से गिनने के लिए, पहले एक हीमोसाइटोमीटर स्लाइड की सतह को मिटा दें और 70% अल्कोहल के साथ पर्ची को कवर करें। मिश्रण के बाद, दोनों कक्षों को भरने के लिए हीमोसाइटोमीटर के प्रत्येक ग्रूव किनारे में कोशिकाओं के 15 माइक्रोलीटर जोड़ें।कक्ष निलंबन केशिका कार्रवाई कर मतगणना कक्ष में तैयार किया जाएगा। 10x माइक्रोस्कोप उद्देश्य का उपयोग करना, समानांतर लाइनों से बंधे ग्रिड के बीच में एक मिलीमीटर चुकता क्षेत्र के भीतर 100 से 200 कोशिकाओं के बीच गिनती। फिर गणना को दूसरे कक्ष के साथ दोहराएं और सूत्र के अनुसार सेल घनत्व निर्धारित करने के लिए दो मामलों के औसत का उपयोग करें।ड्रोसोफिला सेल लाइन क्रायो-संरक्षण के लिए, ठंड माध्यम की मात्रा में सेल पेलेट को फिर से निलंबित करें जिसके परिणामस्वरूप प्रति मिलीलीटर सातवीं कोशिकाओं को कम से कम चार गुना दस का अंतिम सेल घनत्व होगा। क्रायो-प्रोटेक्टेंट, डाइमथाइल सल्फोक्साइड या डीएमएसओ की उचित मात्रा को सेल सस्पेंशन ड्रॉप वार में जोड़ें ताकि अंतिम डीएमएसओ एकाग्रता 10% हो और धीरे-धीरे सेल निलंबन को मिलाएं। इसके बाद, सावधानी से सेल सस्पेंशन के 0.5 मिलीलीटर एलिकोट्स को प्री-लेबल वाले क्रायो-शीशियों में जोड़ें और क्रायो-शीशियों को आइसोप्रोपैनॉल से भरे फ्रीजिंग कंटेनर में रखें।फिर ठंड कंटेनर को रात में शून्य से 80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में स्थानांतरित करें ताकि क्रायो-शीशियों के तापमान को फ्रीजर तापमान में धीरे-धीरे छोड़ दिया जा सके। इसके बाद, क्रायो-शीशियों को तरल नाइट्रोजन कनस्तर में डालने के लिए गन्ने में स्थानांतरित करें। वैकल्पिक रूप से, जमे हुए क्रायो-शीशियों को पूर्व-ठंडा फ्रीजिंग बॉक्स में स्थानांतरित करें और एक नाइट्रोजन फ्रीजर के तरल चरण में जमे हुए क्रायो-शीशियों को स्टोर करें।सेल लाइन का संगम हल्के माइक्रोस्कोप से तय किया जा सकता है। संगम तक पहुंचने वाली तेजी से बढ़ती सेल लाइनों को सप्ताह में दो बार नियमित रूप से पारित करने की आवश्यकता होती है। इसके विपरीत, धीमी गति से बढ़ती कोशिकाओं को हर दो सप्ताह या उससे अधिक समय में कम से एक बार पारित किया जा सकता है, हालांकि इन कोशिकाओं को हर हफ्ते ताजा माध्यम खिलाया जाना चाहिए ।अलग-अलग ऊतक स्रोतों से प्राप्त सेल लाइनें उनके आकृति विज्ञान, पालन गुणों, मीडिया आवश्यकताओं और दोहरीकरण समय में भिन्न होती हैं। मात्रात्मक प्रयोगों के लिए, सेल गिनती आवश्यक है। कोशिकाओं को हीमोसाइटोमीटर या स्वचालित कण काउंटर का उपयोग करके गिना जा सकता है।सेल संगम अनुभवी ऑपरेटर के लिए उपसंस्कृति के लिए एक दृश्य गाइड है। हालांकि, सेल काउंटिंग एक उम्मीद के मुताबिक उपसंधारण अनुसूची की ओर जाता है और विकास विसंगतियों का पता लगाने में सुविधा प्रदान करता है। सावधान रहें और तरल नाइट्रोजन के साथ काम करते समय उचित सुरक्षात्मक गियर का उपयोग करें।

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

की परख ब्लड सेल आबादी<em&gt; ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर</em&gt; लार्वा

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila ...

Establishment of Genome-edited Human Pluripotent Stem Cell Lines: From Targeting to Isolation

जीनोम संपादित मानव स्टेम सेल लाइनों की स्थापना: अलगाव को लक्षित से

Genome-editing of human pluripotent stem cells (hPSCs) provides a genetically controlled and clinically relevant platform from which to understand human ...

Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research

बेसिक और preclinical अनुसंधान के लिए एक संलग्न सेल संस्कृति प्रणाली में मानव pluripotent और तंत्रिका स्टेम सेल संवर्धन

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety ...

Imaging of Cell Shape Alteration and Cell Movement in Drosophila Gastrulation Using DE-cadherin Reporter Transgenic Flies

Imaging of Cell Shape Alteration and Cell Movement in Drosophila Gastrulation Using DE-cadherin Reporter Transgenic Flies

सेल आकार परिवर्तन और में सेल आंदोलन की इमेजिंग<em&gt; ड्रोसोफिला</em&gt; Gastrulation का उपयोग डे-cadherin रिपोर्टर ट्रांसजेनिक मक्खियों

Gastrulation is the first set of morphologically dynamic events that occur during the embryonic development of multicellular animals such as Drosophila. ...

Derivation of Stem Cell Lines from Mouse Preimplantation Embryos

चूहा प्रत्यारोपण भ्रूण से स्टेम सेल लाइनों के व्युत्पत्ति

Mouse embryonic stem cell (mESC) derivation is the process by which pluripotent cell lines are established from preimplantation embryos. These lines ...

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

विच्छेदन और Drosophila Pupal अंडाशय के दाग

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a ...

An Efficient Strategy for Generating Tissue-specific Binary Transcription Systems in Drosophila by Genome Editing

An Efficient Strategy for Generating Tissue-specific Binary Transcription Systems in Drosophila by Genome Editing

जीनोम संपादन द्वारा Drosophila में ऊतक विशिष्ट द्विआधारी प्रतिलेखन प्रणाली पैदा करने के लिए एक कुशल रणनीति

Binary transcription systems are powerful genetic tools widely used for visualizing and manipulating cell fate and gene expression in specific groups of ...

In Vitro Assays to Evaluate the Migration, Invasion, and Proliferation of Immortalized Human First-trimester Trophoblast Cell Lines

विट्रो में प्रवास का मूल्यांकन करने के लिए assays, आक्रमण, और अमर मानव के प्रसार के पहले-trimester ट्रोफोब्लास्ट सेल लाइनों

Cell movement is a critical property of trophoblasts during placental development and early pregnancy. The significance of proper trophoblast migration ...

Culturing and Measuring Fetal and Newborn Murine Long Bones

मुर्गियों को मारने और मापने भ्रूण और नवजात Murine लंबी हड्डियों

Long bones are complex and dynamic structures, which arise from endochondral ossification via a cartilage intermediate. The limited access to healthy ...

Cell-cell Fusion of Genome Edited Cell Lines for Perturbation of Cellular Structure and Function

सेलुलर संरचना और समारोह के क्षोभ के लिए जीनोम संपादित सेल लाइनों के सेल सेल फ्यूजन

Life is spatially partitioned within lipid membranes to allow the isolated formation of distinct molecular states inside cells and organelles. Cell fusion ...