गल, Culturing, और Cryopreserving Drosophila सेल लाइनों

ये प्रोटोकॉल किसी भी शोधकर्ता को अपने शोध एजेंडे को चलाने या पूरक करने के लिए ड्रोसोफिला सेल लाइनों के उपयोग को शामिल करने में मदद करेंगे। इन दिशा-निर्देशों के अनुसार संरक्षित होने पर सभी ड्रोसोफिला सेल संस्कृतियां पुनर्जीवित, पैदा होती हैं और क्रायो-संरक्षित अच्छी तरह से होती हैं। 70% इथेनॉल के साथ एक लेमिनार प्रवाह हुड की काम की सतह को पोंछने के बाद, उपयुक्त माध्यम के पांच मिलीलीटर को 25 सेंटीमीटर चुकता टी-फ्लास्क में बांटें।

70% इथेनॉल के साथ जमे हुए सेल लाइन के कंटेनर को पोंछें और ढक्कन को ध्यान से ढीला और अनसील करें। एक पाश्चर पिपेट का उपयोग करके, कमरे के तापमान माध्यम के एक मिलीलीटर को फ्लास्क से क्रायो-शीशी में स्थानांतरित करें और जमे हुए कोशिकाओं को पिघलाने के लिए धीरे-धीरे मिलाएं। यह ध्यान रखते हुए कि सेल निलंबन ओवरफ्लो नहीं होता है, गल सेल निलंबन की पूरी मात्रा को फ्लास्क में स्थानांतरित करें और ताजा माध्यम के साथ क्रायो-शीशी को कुल्ला दें।

कोशिकाओं को 25 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में कम से कम दो घंटे के लिए फ्लास्क के नीचे बसने की अनुमति दें। जमे हुए कोशिकाओं है कि एक लंबी अवधि के लिए या तरल नाइट्रोजन में शून्य से ८० डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में वापस यात्रा के लिए पैक किया गया है वापस मत करो । इसके बजाय कोशिकाओं ASAP गल ।

एक हल्के माइक्रोस्कोप के तहत लगाव की पुष्टि करने के बाद, धीरे से इनक्यूबेटर को फ्लास्क लौटने से पहले ताजा माध्यम के पांच मिलीलीटर के साथ supernatant की जगह । वैकल्पिक रूप से, विगलन के बाद, सेल निलंबन को अपकेंद्रित्र के लिए 15 मिलीलीटर शंकु नली में स्थानांतरित करें और टी-25 फ्लास्क में बोने से पहले ताजा माध्यम के पांच मिलीलीटर में गोली को फिर से निलंबित करें जैसा कि सिर्फ प्रदर्शन किया गया था। यह निर्धारित करने के लिए कि कोशिकाएं पारित होने के लिए तैयार हैं या नहीं, माइक्रोस्कोप के नीचे संस्कृति के आकृति विज्ञान और संगम की जांच करें।

कोशिका घनत्व और दोहरीकरण समय को ध्यान में रखते हुए, पिछली बार कोशिकाओं को उप-संस्कारी, और संस्कृति में सूक्ष्मजीव संदूषण के किसी भी संकेत थे। यदि संस्कृति अत्यधिक अनुकूल प्रतीत होती है, तो संस्कृति प्लेट नीचे से कोशिकाओं को धीरे-धीरे उखाड़ फेंकने के लिए संस्कृति सुपरनेट्टर के दस मिलीलीटर का उपयोग करें और परिणामस्वरूप एकल कोशिका निलंबन में व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या की गणना करके कोशिका घनत्व का निर्धारण करें। उप संस्कृति कोशिकाओं अगर कोशिका घनत्व के बीच पांच से दस गुना दस के बीच उपयुक्त माध्यम में मिलीलीटर प्रति छठी कोशिकाओं के लिए है ।

वांछित सीडिंग सेल घनत्व प्राप्त करने के लिए एक नई संस्कृति प्लेट में मिलीलीटर एकाग्रता प्रति छठी कोशिकाओं में कम से कम एक गुना दस जोड़ें। फिर ऑपरेटर प्रथमाक्षर, तिथि, विभाजन अनुपात, सीडिंग सेल घनत्व, सेल लाइन पहचानकर्ता, मध्यम, मार्ग संख्या, और एंटीबायोटिक दवाओं जैसे किसी भी मध्यम परिवर्धन के साथ प्लेटों को कवर और लेबल करें, और प्लेटों को 25 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में अपने निरंतर इनक्यूबेशन के लिए प्लास्टिक कंटेनर में रखें। अनुयायी कोशिकाओं को उखाड़ फेंकने के लिए एक 100 मिलीमीटर संस्कृति पकवान नीचे बनाते हैं, पहले सभी सुपरनटेंट को बाँझ फ्लास्क में स्थानांतरित करते हैं और कोशिकाओं को 0.05% ट्राइप्सिन ईडीटीए के एक मिलीलीटर के धीमी गति से जोड़ते हैं।

धीरे-धीरे यह सुनिश्चित करने के लिए घूमता है कि ट्राइप्सिन समाधान समाधान को त्यागने से पहले पूरे विकास की सतह को कवर करता है। इसके बाद, धीरे-धीरे प्लेट में ताजा 0.05% ट्राइप्सिन ईडीटीए के एक से दो मिलीलीटर जोड़ें और प्लेट को तीन से दस मिनट के लिए 25 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखें। जब सेल परत को बढ़ती सतह से अलग और फिसलने के लिए देखा जा सकता है, तो बचाया गया सुपरनेट के नौ मिलीलीटर के अलावा ट्राइप्सिन गतिविधि को रोकें और सेल झुरमुटों को अलग करने के लिए सेल निलंबन को अच्छी तरह से मिलाएं।

जब सभी कोशिकाओं को उखाड़ दिया गया है, तो बढ़ती सतह स्पष्ट हो जाएगी। न्यूबॉयर सेल काउंटिंग स्लाइड का उपयोग करके कोशिकाओं को मैन्युअल रूप से गिनने के लिए, पहले एक हीमोसाइटोमीटर स्लाइड की सतह को मिटा दें और 70% अल्कोहल के साथ पर्ची को कवर करें। मिश्रण के बाद, दोनों कक्षों को भरने के लिए हीमोसाइटोमीटर के प्रत्येक ग्रूव किनारे में कोशिकाओं के 15 माइक्रोलीटर जोड़ें।

कक्ष निलंबन केशिका कार्रवाई कर मतगणना कक्ष में तैयार किया जाएगा। 10x माइक्रोस्कोप उद्देश्य का उपयोग करना, समानांतर लाइनों से बंधे ग्रिड के बीच में एक मिलीमीटर चुकता क्षेत्र के भीतर 100 से 200 कोशिकाओं के बीच गिनती। फिर गणना को दूसरे कक्ष के साथ दोहराएं और सूत्र के अनुसार सेल घनत्व निर्धारित करने के लिए दो मामलों के औसत का उपयोग करें।

ड्रोसोफिला सेल लाइन क्रायो-संरक्षण के लिए, ठंड माध्यम की मात्रा में सेल पेलेट को फिर से निलंबित करें जिसके परिणामस्वरूप प्रति मिलीलीटर सातवीं कोशिकाओं को कम से कम चार गुना दस का अंतिम सेल घनत्व होगा। क्रायो-प्रोटेक्टेंट, डाइमथाइल सल्फोक्साइड या डीएमएसओ की उचित मात्रा को सेल सस्पेंशन ड्रॉप वार में जोड़ें ताकि अंतिम डीएमएसओ एकाग्रता 10% हो और धीरे-धीरे सेल निलंबन को मिलाएं। इसके बाद, सावधानी से सेल सस्पेंशन के 0.5 मिलीलीटर एलिकोट्स को प्री-लेबल वाले क्रायो-शीशियों में जोड़ें और क्रायो-शीशियों को आइसोप्रोपैनॉल से भरे फ्रीजिंग कंटेनर में रखें।

फिर ठंड कंटेनर को रात में शून्य से 80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में स्थानांतरित करें ताकि क्रायो-शीशियों के तापमान को फ्रीजर तापमान में धीरे-धीरे छोड़ दिया जा सके। इसके बाद, क्रायो-शीशियों को तरल नाइट्रोजन कनस्तर में डालने के लिए गन्ने में स्थानांतरित करें। वैकल्पिक रूप से, जमे हुए क्रायो-शीशियों को पूर्व-ठंडा फ्रीजिंग बॉक्स में स्थानांतरित करें और एक नाइट्रोजन फ्रीजर के तरल चरण में जमे हुए क्रायो-शीशियों को स्टोर करें।

सेल लाइन का संगम हल्के माइक्रोस्कोप से तय किया जा सकता है। संगम तक पहुंचने वाली तेजी से बढ़ती सेल लाइनों को सप्ताह में दो बार नियमित रूप से पारित करने की आवश्यकता होती है। इसके विपरीत, धीमी गति से बढ़ती कोशिकाओं को हर दो सप्ताह या उससे अधिक समय में कम से एक बार पारित किया जा सकता है, हालांकि इन कोशिकाओं को हर हफ्ते ताजा माध्यम खिलाया जाना चाहिए ।

अलग-अलग ऊतक स्रोतों से प्राप्त सेल लाइनें उनके आकृति विज्ञान, पालन गुणों, मीडिया आवश्यकताओं और दोहरीकरण समय में भिन्न होती हैं। मात्रात्मक प्रयोगों के लिए, सेल गिनती आवश्यक है। कोशिकाओं को हीमोसाइटोमीटर या स्वचालित कण काउंटर का उपयोग करके गिना जा सकता है।

सेल संगम अनुभवी ऑपरेटर के लिए उपसंस्कृति के लिए एक दृश्य गाइड है। हालांकि, सेल काउंटिंग एक उम्मीद के मुताबिक उपसंधारण अनुसूची की ओर जाता है और विकास विसंगतियों का पता लगाने में सुविधा प्रदान करता है। सावधान रहें और तरल नाइट्रोजन के साथ काम करते समय उचित सुरक्षात्मक गियर का उपयोग करें।