Scongelamento, coltura e Cryopreserving linee di cellule di Drosophila

Questi protocolli aiuteranno qualsiasi ricercatore a incorporare l'uso delle linee cellulari Drosophila per guidare o integrare la loro agenda di ricerca. La maggior parte se non tutte le colture cellulari di Drosophila rivivono, proliferano e crio-preservano bene se gestite secondo queste linee guida. Dopo aver pulito la superficie di lavoro di una cappa di flusso laminare con 70% di etanolo, erogare cinque millilitri del mezzo appropriato in un pallone a T squadrato di 25 centimetri.

Pulire il contenitore della linea cellulare congelata con il 70% di etanolo e allentare e sconvolrre accuratamente il coperchio. Utilizzando una pipetta Pasteur, trasferire un millilitro di mezzo a temperatura ambiente dal pallone al crio-flaal e mescolare delicatamente per scongelare le cellule congelate. Facendo attenzione che la sospensione cellulare non trabocca, trasferire l'intero volume della sospensione cellulare scongelata sul pallone e risciacquare il crio-flaal con mezzo fresco.

Consentire alle cellule di depositarsi sul fondo del pallone per almeno due ore in un incubatore di 25 gradi Celsius. Non restituire le cellule congelate che sono state confezionate per viaggiare di nuovo in meno 80 gradi celsius congelatore per un periodo prolungato o in azoto liquido. Invece scongelare le cellule al più presto.

Dopo aver confermato l'attacco al microscopio leggero, sostituire delicatamente il supernatante con cinque millilitri di mezzo fresco prima di restituire il pallone all'incubatore. In alternativa, dopo lo scongelamento, trasferire la sospensione cellulare in un tubo conico da 15 millilitri per la centrifugazione e sospendere il pellet in cinque millilitri di mezzo fresco prima di seminare in un pallone T-25 come appena dimostrato. Per determinare se le cellule sono pronte per essere passo, esaminare la morfologia e la confluenza della coltura al microscopio.

Considerando la densità cellulare e il tempo di raddoppio, l'ultima volta che le cellule sono state sotto-coltivate, e qualsiasi segno di contaminazione microrganisma nella coltura. Se la coltura appare altamente confluente, utilizzare dieci millilitri del supernatante di coltura per rimuovere delicatamente le cellule dal fondo della piastra di coltura e determinare la densità cellulare contando il numero di cellule vitali nella sospensione a singola cella risultante. Sotto-coltura delle cellule se la densità cellulare è compresa tra cinque e dieci per dieci fino alla sesta cella per millilitro nel mezzo appropriato.

Aggiungere almeno una per dieci alla sesta concentrazione di millilitri in una nuova piastra di coltura per ottenere la densità della cellula di semina desiderata. Quindi coprire ed etichettare le piastre con le iniziali dell'operatore, la data, il rapporto di divisione, la densità delle cellule di semina, l'identificatore della linea cellulare, il mezzo, il numero di passaggio e qualsiasi aggiunta media come antibiotici e posizionare le piastre in un contenitore di plastica per la loro continua incubazione nell'incubatore di 25 gradi celsius. Per spodestare le cellule aderenti formare un fondo piatto di coltura di 100 millimetri, prima trasferire tutto il supernatante in un pallone sterile e risciacquare le cellule con una lenta aggiunta di un millilitro dello 0,05% di tripside EDTA.

Ruotare delicatamente per assicurarsi che la soluzione di tripina copra l'intera superficie di crescita prima di scartare la soluzione. Successivamente, aggiungere delicatamente uno o due millilitri di EDTA fresco allo 0,05% di tripsideina alla piastra e posizionare la piastra nell'incubatore di 25 gradi celsius per tre o dieci minuti. Quando lo strato cellulare può essere osservato staccarsi e scivolare fuori dalla superficie in crescita, interrompere l'attività della tripina con l'aggiunta di nove millilitri del supernatante salvato e mescolare accuratamente la sospensione cellulare per dissociare accuratamente i grumi cellulari.

Quando tutte le cellule sono state spodestato, la superficie in crescita sarà chiara. Per contare manualmente le cellule utilizzando una diapositiva di conteggio delle celle Neubauer, pulire prima la superficie di uno scivolo emocitometro e coprire lo scivolamento con il 70% di alcol. Dopo la miscelazione, aggiungere 15 microlitri delle cellule in ogni bordo scanalato dell'emocitometro per riempire entrambe le camere.

La sospensione cellulare verrà prelevata nella camera di conteggio per azione capillare. Usando un obiettivo al microscopio 10x, contare tra 100 e 200 celle all'interno dell'area quadrata di un millimetro al centro della griglia delimitata dalle linee parallele. Quindi ripetere l'enumerazione con la seconda camera e utilizzare la media dei due conteggi per determinare la densità cellulare in base alla formula.

Per la crioconservazione della linea cellulare Drosophila, sospendere di nuovo il pellet cellulare in un volume di mezzo di congelamento che si tradurrà in una densità cellulare finale di almeno quattro volte dieci alla settima cella per millilitro. Aggiungere un volume appropriato del crio-protettore, del solfossido di dimetile o del DMSO, nella caduta della sospensione cellulare in modo che la concentrazione finale di DMSO sia del 10% e mescolare delicatamente la sospensione cellulare. Quindi, aggiungere con cura 0,5 millilitri aliquote della sospensione cellulare in crio-fiale pre-etichettate e posizionare le crio-fiale in un contenitore di congelamento pieno di isopropanolo.

Quindi trasferire il contenitore di congelamento in un congelatore a meno 80 gradi Celsius durante la notte per consentire alla temperatura delle crio-fiale di scendere lentamente alla temperatura del congelatore. Successivamente, trasferire rapidamente le fiale crio-fiale in cante per l'inserimento in un contenitore di azoto liquido. In alternativa, trasferire le fiale crio-fiale congelate in una scatola di congelamento pre-raffreddata e conservare le crio-fiale congelate nella fase liquida di un congelatore di azoto.

La confluenza di una linea cellulare può essere determinata dal microscopio a luce. Le linee cellulari in rapida crescita che raggiungono la confluenza in anticipo devono essere passaggi regolarmente, fino a due volte a settimana. Al contrario, le cellule a crescita lenta possono essere passate almeno una volta ogni due settimane o più, anche se queste cellule devono essere alimentate con mezzo fresco ogni settimana.

Le linee cellulari derivate da fonti tissutali variabili differiscono nella morfologia, nelle proprietà di aderenza, nei requisiti dei supporti e nei tempi di raddoppio. Per gli esperimenti quantitativi, il conteggio delle cellule è essenziale. Le cellule possono essere contate usando un emocitometro o un contatore automatico di particelle.

La confluenza cellulare è una guida visiva per quando sottocultura per l'operatore esperto. Tuttavia, il conteggio delle celle porta a un programma di subcultura prevedibile e facilita il rilevamento delle anomalie di crescita. Fare attenzione e utilizzare l'attrezzatura protettiva appropriata quando si lavora con azoto liquido.