Name: thawing, culturing, and cryopreserving drosophila cell lines
Uploaded: 2019-04-16T15:00:00
Duration: 7 min 57 s
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我々 は、DGRC のキュレーションショージョーバエ ・ DNA/ベクトル/セルのさまざまなリソースを利用するため健康の国民の協会 (NIH P40OD010949 賞) と研究コミュニティをありがとうございます。

1. 解凍・冷凍ショウジョウバエ細胞の復活
<ol><li>70% のエタノールと作業面を拭くことによってフードを滅菌します。25 cm2 T フラスコ (T-25) に適切な媒体 (表 1) の 5 mL を調剤します。</li>
	<li>リキッド N2またはドライアイスからクリオバイアル/アンプルを削除します。70% エタノール クリオバイアルを拭く、慎重に緩め、アンプルを開封します。</li>
	<li>パスツール ピペットを使用して、T-25 フラスコから部屋の温度 (RT) メディアの 1 mL を撤回します。ゆっくりと、クリオバイアルにメディアを追加し、優しく細胞懸濁液がオーバーフローしないことを確認、凍結細胞の解凍がミックスします。</li>
	<li>T-25 フラスコにアンプルから解凍細胞懸濁液のボリューム全体を転送します。細胞懸濁液を完全に転送されていることを確認するを繰り返します。</li>
	<li>25 の ° C の定温器にフラスコを置き、ほとんどの細胞が成長表面に定住していることを確認するには顕微鏡下で細胞を調べる解決し少なくとも 2 における付着細胞をことができます。優しく古いメディアを削除し、5 mL の新鮮なメディアに置き換えます。インキュベーターにフラスコを返します。</li>
	<li>次の日に軽く古いメディアを削除し、5 ml の新鮮なメディア置き換えます。文化をインキュベーターに戻ります。</li>
</ol>2. 解凍・冷凍ショウジョウバエ細胞 (代替) の復活
<ol><li>無菌フードで再 RT メディアの 1 mL の冷凍餌によって細胞を解凍します。解凍の細胞懸濁液を 15 mL の円錐管に転送します。</li>
	<li>上澄み 1,000 x gで 5 分間破棄での遠心分離によって細胞をペレットし、5 mL の新鮮な培地で細胞ペレットを再懸濁します。</li>
	<li>T-25 フラスコ細胞懸濁液の全体ボリュームを転送し、25 ° C で文化を孵化させなさい</li>
	<li>1 ~ 2 時間後、ほとんどの細胞が成長表面に定住していることを確保するために、顕微鏡下で細胞を調べます。次の日に 5 mL の新鮮なメディアと古いメディアを交換し、インキュベーターにカルチャを返します。</li>
</ol>3. 培養半付着細胞 100 mm 培養皿で栽培
<ol><li>70% のエタノールで拭くフードを滅菌します。フード、びん、ピペット、ピペットの援助、培養皿などに培養のための滅菌材料をもたらします。</li>
	<li>形態と顕微鏡下で文化の合流点を調べます。Microorganismal の汚染文化の明確な兆候を探します。文化の特性に基づいて細胞を継代する準備ができているかどうかを判断: 細胞密度と倍加時間、彼らが継代された最後の時間を含みます。</li>
	<li>文化が高く表示される場合 (図 1)、合流がセル密度を決定します。無菌フード プレートから培地 10 mL までをピペッティングおよびそれのセル上で成長の表面から細胞を取り除きます。成長の表面が明らかになるまで泡を作成することを確保するに数回を繰り返します。診断または自動粒子カウンター (セクション 5、図 3) を使用してセル密度を決定します。サブカルチャー細胞細胞密度は、5 × 106と 1 x 107セル/mL の場合。 注:1 x 106セル/mL 以下の細胞密度にサブカルチャーショウジョウバエ細胞を行います。</li>
	<li>
少なくとも 1 x 106セル/mL の最終的な播種濃度を適切な媒体を使用してそれに応じて細胞懸濁液を希釈します。
	<ol>
<li>ルーチン継やメンテナンスのため目的の播種細胞密度を達成するために新しい培養プレート中のあらかじめ決められた量に細胞懸濁液の適切な量を追加します。</li>
		<li>文化をスケールの大きなフラスコに細胞懸濁液を転送します。媒体の適切なボリュームと必要な細胞密度に細胞懸濁液を希釈します。新しいプレートに希釈した細胞懸濁液の平等なボリュームを配布します。このメソッドは、プレートの間の細胞密度の変化を最小限に抑えます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>カバー、ラベルの演算子のイニシャル、日付、分割比率、播種細胞密度、セルの行識別子、メディア、通路番号抗生物質などの任意のメディア追加とプレート。</li>
	<li>プラスチックの容器にプレートを置き、インキュベーターにボックスを返します。 注: 表 3 ショウジョウバエ細胞と関連する作業ボリュームを培養するために一般的に使用される培養容器が一覧表示されます。</li>
</ol>4. 100 mm 培養皿で育った付着性細胞を外れ
<ol><li>新しい生殖不能のフラスコにプレートからすべてのメディアを転送します。媒体を保存します。</li>
	<li>ゆっくりとプレートに 0.05% トリプシン-EDTA の 1 mL を追加することによって細胞をすすいでください。トリプシン溶液全体の成長表面を覆うように優しく旋回します。トリプシン溶液を破棄します。</li>
	<li>優しくプレートに 0.05% トリプシン-EDTA の 1 mL を追加します。沖成長表面の細胞層のデタッチの目に見える兆候の監視とスライディングしながら 3−10 分間 25 ° C でプレートを孵化させなさい。</li>
	<li>トリプシン活性を停止するプレートに保存した媒体の 9 mL を追加します。細胞塊を分離するに細胞懸濁液を混ぜます。すべてのセルを外れている、成長の表面はクリアになります。 注:トリプシンなどの消化酵素の使用は、強く付着性のセルラインを継に役立ちます。トリプシンはしばしばブタ膵臓由来プロテアーゼの混合物であるし、純度の異なった等級で市販されています。</li>
</ol>5. 手動細胞数スライドを数えるノイバウアー セルを使用して
<ol><li>70% アルコールで表面を拭くことによって検定スライドと coverslip を準備します。</li>
	<li>細胞懸濁液を混合し、検定 (図 3 a)、検定の最初の部屋を埋めるための溝の端に細胞懸濁液の 15 μ L を分注します。第二商工会議所の検定をご記入ください。細胞懸濁液は、毛管作用によってカウントのチャンバ内に描画されます。</li>
	<li>対物レンズ × 10 を使用すると、(図 3、D) 平行線によってバインド グリッドの中央に 1 mm2の領域内のセルをカウントします。重複カウントを避けるため、200 μ m2の正方形の右と下の境界を越えるセルではなく、トップと左の境界をオーバーレイする細胞を数えます。100−200 細胞間をカウントします。2 番目の箱の数を繰り返します。</li>
	<li>2 つの数の平均を計算し、次の式に従ってセル密度を決定する: 細胞の密度 (セル/mL) = 10 x の平均細胞数 (n1 + n22)4。 注:細胞生存率は合計のセルに実行可能なセルの割合として表されます。細胞生存率を調べるには、トリパン ブルー色素の等量とセル中断 (0.4%) を混ぜる手動または自動のセルを数える前に、ソリューション。死んだ細胞、青色に染色される間、染料を生きた細胞には行いません。</li>
</ol>6.ショウジョウバエ細胞の凍結保存
<ol><li>健康的な形態、成長、および汚染の欠如の文化を確認します。収穫から文化、半ば後半ログ成長段階 (ステップ 3.3、またはセクション 4)。多くのショウジョウバエの細胞の約 4 x 106セル/8 x 106セル/mL に mL の間です。</li>
	<li>15 mL や 50 mL の円錐管に全体の細胞懸濁液を転送します。5 分 1,000 × gで遠心分離によって細胞を収集し、上澄みを廃棄します。</li>
	<li>少なくとも 4 x 107セル/mL の最終的な細胞密度になります凍結中 (表 4) の容積の細胞ペレットを再懸濁します。</li>
	<li>追加滴下凍結ジメチルスルホキシド (DMSO) の適切な量細胞懸濁液に、最終の DMSO 濃度が 10%。細胞懸濁液を軽く混ぜます。</li>
	<li>慎重に事前ラベル クリオバイアル (2 〜 107セル/バイアル x) の因数に細胞懸濁液 0.5 mL を調剤します。イソプロパノール (図 4 a) でいっぱい冷凍コンテナーに、アンプルを配置します。ゆっくり落としクリオバイアルの温度まで一晩に-80 ° C のフリーザー冷凍コンテナーに転送 (-1 ° C/分) 冷凍庫温度に。</li>
	<li>冷凍のクリオバイアルを取り出して、急速に杖 (図 4 b) にそれらを添付します。クリオバイアルを含んでいる小さなかん (図 4) に杖を挿入します。また、予冷凍結ボックス (図 4) 内冷凍クリオバイアルを配置します。ストア N2冷凍庫 (図 4 e,F) の液体相におけるクリオバイアルを凍結します。 注:凍結メディア含む DMSO を使用している場合、RT で最大 30 分の遅れは、細胞に悪影響ではないです。</li>
</ol>

<ol>
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著者が明らかに何もありません。

ショウジョウバエ培養細胞は、高スループット セル ベースの画面の主な試薬です。使用も細胞生化学、急速なハエ、細胞生物学、顕微鏡、最近では遺伝子の体細胞に注入する前に遺伝子構造のテストに適した均質な人口を提供することで生体内での遺伝子研究を補完します。1,2,3,8,9,10を編集のゲノムによって操作します。
生存率と凍結のショウジョウバエの細胞の回復は、低温でも急激な変動に敏感です。DGRC は N2 (-196 ° C) の液体相における凍結細胞ラインを格納し、ドライアイス (-78.50 ° C) で転送します。ドライアイスで運ばれている凍結アンプルをリキッド N2またはストレージの-80 ° C のフリーザーに転送してはいけません。凍結細胞の解凍、できるだけ早く到着 (プロトコル セクション 1) 高細胞密度で再シード、意図された目的 (プロトコル セクション 3) 培養がする必要があります代わりに。実験のための細胞株がすぐに利用されていないセルの行をする必要があります使用する準備ができるまで (プロトコル セクション 6), 凍結保存。
ML BG2 c2 Ras ラインなどのいくつかの細胞株では、数日凍結状態から復活する効果から回復する必要があります。細胞の残骸のかなりの量はこれらの細胞株に融解後最初の数日間を伴います。妨げられていない残って、細胞は回復し、増殖します。ショウジョウバエのセル行数、DGRC は M3 ベース メディア22での成長に適応されています。細胞融解の影響から回復に時間がかかる、調節されたメディアの使用が役に立つ可能性があります。調節されたメディア可能性にはには、回復と融解後の細胞の増殖を促す可能性がありメディアに細胞によって分泌される成長因子が含まれています。
細胞一般に遅れ位相、指数段階、プラトー相と劣化相から成るステレオタイプ的な成長曲線に従います。1 x 10 の6と 1 x 107セル/mL 25 ° C での密度で培養している多くのショウジョウバエの細胞成長のログ段階で増殖します。急激な成長段階で常にように、細胞は継代が不可欠です。
パーセンテージ、文化の合流点では、細胞によって覆われている成長表面領域について説明します。セルラインのセルの合流点は、その細胞の形とサイズに依存します。異なる細胞が異なる形態と付着性あります。その結果、およそ似たような合流点で異なる細胞株は大幅に異なるセル密度 (図 1) があります。文化の合流はショウジョウバエ細胞が成長表面がされた後も、互いの上に盛り、巣または懸濁液中のいずれかを増殖し続けるので、ショウジョウバエ培養細胞を継の理想的な指標にできない場合があります。カバー (図 1)。ただし、特定のセルの行を持つ経験豊富なユーザーの急速な視覚的なガイドとしてサブカルチャーに合流使用が頻繁。
19−25 ° C 周囲常温ショウジョウバエラインを育てることは可能ですが、周囲温度の変動は増殖率に影響を与えるのでないお勧め。専用の 25 ° C の定温器の使用をお勧めします。ショウジョウバエ培養細胞のためのインキュベーターは、ショウジョウバエの細胞培養媒体は、バッファリングの CO2を使用しないために、CO2ガス交換を容易にする必要はありません。細胞を培養するためのインキュベーターの湿度は、プレートで細胞を培養するとき見落とされないための重要な要因です。インキュベーターと作業環境の種類によっては、インキュベーター内の滅菌水のビーカーを配置する必要があります。メディアの蒸発を最小限に抑えるために閉じた T フラスコを使用またはインキュベーターの中の堅く密封されたプラスチック容器で培養皿を格納します。
ショウジョウバエ細胞二次培養のスケジュールを開発することが重要です。成長率とモニターの一貫性を推定するには、(分割比 1:2、1:4、1:8) も幾何学的な比率でサブカルチャーに便利です。たとえば、8 x 106セル/mL Kc167 細胞の 10 mL 合流プレートは、1 x 106セル/mL (1.25 mL の新鮮なメディアの 8.75 mL に希釈した細胞懸濁液) の播種密度を達成するために 1:8 の比率で分割できます。72 h、24 h の倍加時間を与え 8 × 10、6セル/ml の密度に増殖する Kc167 文化が期待されます。したがって、分割比は成長の彼らの指数ログの段階で細胞を培養している常にことを確認、週に 2 回までの便利なサブカルチャー ルーチンを容易にするために決定されます。合流する時間が短すぎるも長くなるように、セルを subculturing のための規則的なスケジュールが可能になります。合流に時間が短すぎる場合、セルはセル密度が低い (より高い分割比) で継代します。同様に、合流点に到達する時間が長すぎる場合、細胞は細胞密度が高い (低い分割比) で継代します。ほとんどショウジョウバエ細胞が低細胞密度に非常に敏感に注意することが重要だ (< 1 x 10 の5セル/mL)、セルはほとんど増殖し、最終的には死ぬかもしれない。
ショウジョウバエの細胞の成長特性と形態によって異なります。その結果、異なるプロパティを持つ細胞は、異なる方法で処理する必要があります。ほとんどショウジョウバエ細胞は半付着性です。細胞密度が低い、彼らは成長の表面に強く付着と文化は、コンフルエントになると、セル少ない付着性になるし、簡単にデタッチします。この細胞接着性の漸進的な変更それにより、単にそれらを除去する細胞膜上のメディアを分配する演算子として最も広く使われているショウジョウバエ細胞株 (シュナイダー、Kc 線、成虫ディスクおよび中枢神経系の線) の簡単な継代培養が容易になります成長表面のカルチャが密な場合。表面付着をラインの女性生殖系列幹/卵巣体シース (fGS/OSS) と Ras ライン、それは成長面からセルを取り外すときに支援するために短い期間のトリプシンで細胞をインキュベートする不可欠です。
ほとんどショウジョウバエ細胞に対するメディアの追加には、牛胎児血清 (FCS) が含まれます。インスリンと大人フライ エキス (FEX) いくつかの特定の行に必要です。FEX には、特定の幼虫成虫ディスク ラインと大人の卵巣細胞の成長に必要不可欠な未定義の部品が含まれています。DGRC の準備となります利用可能なアダルト FEX に由来する 1 週齢のオレゴン州 R modENCODE ハエ (RRID: BDSC_25211) 2.5 mL と 10 mL の因数で。DGRC も説明します小規模 FEX 準備のウェブサイトに < https://dgrc.bio.indiana.edu/include/file/additions_to_medium.pdf>。ただし、FEX 準備は時間がかかり、成虫の大規模な量を必要とします。
ショウジョウバエの細胞の凍結保存は、即戦力ではなく時間と細胞の維持のための試薬を保存します。凍結保存は-80 ° C における凍害防御剤、DMSO を含有する培地にゆっくりと凍結細胞 (-1 ° C/分) によって実現されます。遅い冷却ステップは、凍結保存の成功にとって重要です。-80 ° C のフリーザーで細胞のアンプルはイソプロパノールでいっぱい冷凍コンテナーに配置時の-1 ° C/分の速度で冷却されます。周囲温度 25 ° C で始まる、それは-80 ° C に到達するアンプル内の温度の 2 h までかかります一晩を凍結するアンプルのままにすることをお勧めします。
凍結アンプルは、長期貯蔵窒素の液体段階に急速に転送する必要があります。周囲温度、クリオバイアルはおよそ 10 ° C/分で急速に再加熱し、23-50 ° C の上で生存率が低下します。転送を高速に保つために、周囲温度への露出を最小限に抑えるために少量でアンプルを処理します。また、液体 N への移転のため準備中にドライアイス冷凍クリオバイアルを配置2.液体窒素が使用できないセルは時間の経過とともに劣化のリスクが、-80 ° C の冷凍庫に格納場合があります。
細胞密度は、凍結保存の成功と細胞のそれに続く復活のため重要です。一般に、細胞の過剰が利用可能になるとすぐに、新しいセルの行は初期の作成に冷凍する必要がありますは (1 − 3 アンプル) をフリーズします。細胞ラインでさらに安定して培養された、10−20 アンプルの冷凍ストックを作成する必要があります。その後凍結細胞回復と生存率、その後、それは実験の伝播を確認するまたは冷凍ストック アンプル数を下回る 5 株式を交換する、この株式は解凍し。最後に、解凍のセルが親株式の特性を維持して3,24を進化する細胞が知られていることを検証することが重要です。
結論として、この記事はショウジョウバエ細胞の基本的な処理の様々 なライン、ベスト ・ プラクティス、および視聴覚プロトコルに関する基本的な情報を提供して、ショウジョウバエ培養細胞を操作するためのプライマーを示します。このアクセス可能なリソースは、スムーズにショウジョウバエの培養細胞での作業への導入を容易にするため、任意の研究所で、既存のトレーニング ガイドを補完するものです。

ショウジョウバエの培養細胞補完する生体内で遺伝子解析を飛ぶし、多く基本的な生物学的質問1,2,3に対処するための主なお問い合わせツールとしてです。ショウジョウバエの細胞は異なる遺伝的背景の異なるティッシュ ソース由来細胞のユニークな同種個体を提供しています。細胞は形質転換遺伝子発現、ゲノミクス、トランスクリプトミクス、プロテオミクス、メタボロミクス、スループットの高い RNA 干渉 (RNAi) 画面、細胞生物学、顕微鏡を含む多くのアプリケーションに適しています。重要なは、ショウジョウバエ細胞培養の使用知られている刺激に対する即時の時間応答の評価が容易になります。さらに、ショウジョウバエの細胞培養は CRISPR Cas9 ゲノム編集、特定ゲノムの変更4,5,6,と新しい細胞ラインの作成が比較的容易に従う7。
ショウジョウバエ ゲノム リソース センター (DGRC) はショウジョウバエの細胞のリポジトリ、流通センターとして機能します。ショウジョウバエ細胞文化資源の研究コミュニティのメンバーを支援するために、DGRC の目標の 1 つです。この記事では、ショウジョウバエのセル行の処理のための基本プロトコルを示します。ショウジョウバエ培養細胞を処理すると快適になるし、実験1,2,8,9 の独立のレベルを達成するための研究者を支援する既存のリソースを補完します。 ,10。
最も一般的に使用されるショウジョウバエのセル行: シュナイダー線11, Kc16712, 三菱/三宅成虫ディスクそして中枢神経系 (CNS)13,14、ミルナー研究室成虫ディスク ライン15、成体卵巣細胞ライン16,17、および Ras 行18 (表 1)。シュナイダーと Kc167 行は、生化学、遺伝子組換え遺伝子組換え遺伝子発現、および逆遺伝的画面で使用するための一般的な万能細胞です。三菱/三宅研究室 (ML) ラインは幼虫成虫ディスクまたは中枢神経系 (CNS) のいずれかから派生した、彼らは惹か、転写調節、RNA プロセシングに関する研究に有用されています。ミルナー (CME) ディスク ラインは、シグナル伝達の勉強のために重要されています。FGS/OSS 細胞変異アダルト卵巣由来のまま生殖細胞維持と分化の17,のための19の小さな RNA 生物の非コーディングの影響を研究する重要な試薬。最後に、これらは Ras 癌遺伝子を表現する異所萌出への胚由来細胞株であるために、Ras ライン、一意です。彼らは筋前駆細胞の転写署名しアクティブ ピルナ機械20を表現します。最近のレビュー記事や書籍の章は、詳細詳細2,3,9これら人気のある細胞のアプリケーションをカバーしています。
すべてのこれらの細胞は継代、凍結できます。わずかであるけれども重要な各セルラインの維持方法と凍結のために準備方法についてさまざまな要件があります。たとえば、異なる細胞さまざまなメディアとサプリメント (表 1) が必要です。遺伝子型と倍加時間 (表 2)、ラインは表面密着性、形態 (図 1および図 2) で異なります。我々 は現在の基本的なプロトコルと様々 な広く使われているショウジョウバエの細胞を処理するため一意の違いを強調します。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:899px;" width="898">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:354px;">100 mm tissue culture plates</td>
			<td style="width:252px;">Corning&#160;</td>
			<td align="right" style="width:123px;">430167</td>
			<td style="width:171px;">Subculturing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:354px;">25 cm2 T-flask</td>
			<td style="width:252px;">Corning&#160;</td>
			<td align="right" style="width:123px;">430168</td>
			<td>Subculturing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:354px;">35HC Liquid Nitrogen Storage Tank</td>
			<td style="width:252px;">Taylor-Wharton</td>
			<td style="width:123px;">35HCB-11M</td>
			<td>Cryopreservation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:354px;">Automated Cell counter</td>
			<td style="width:252px;">BIO-RAD</td>
			<td style="width:123px;">TC20</td>
			<td>Counting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:354px;">Bactopeptone</td>
			<td style="width:252px;">BD BioSciences</td>
			<td style="width:123px;">211677</td>
			<td>Medium additions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:354px;">Counting Slides</td>
			<td style="width:252px;">BIO-RAD</td>
			<td style="width:123px;">145-0011</td>
			<td>Counting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:354px;">Cryovial 1 mL</td>
			<td style="width:252px;">Greiner&#160;</td>
			<td align="right" style="width:123px;">123263</td>
			<td>Cryopreservation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:354px;">DMSO</td>
			<td style="width:252px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">D5879</td>
			<td>Cryopreservation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:354px;">Freezing Box</td>
			<td style="width:252px;">Nalgene</td>
			<td style="width:123px;">5029-0909</td>
			<td>Cryopreservation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:354px;">Freezing Container</td>
			<td style="width:252px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">15-350-50</td>
			<td>Cryopreservation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:354px;">Hematocytometer</td>
			<td style="width:252px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">#0267110</td>
			<td>Counting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:354px;">Human Insulin</td>
			<td style="width:252px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:123px;">I9278</td>
			<td>Medium additions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:354px;">Hyclone CCM3 media</td>
			<td style="width:252px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:123px;">SH30061.03</td>
			<td>Medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:354px;">Hyclone Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:252px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:123px;">SH30070.03</td>
			<td>Medium additions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Glutamic acid potassium salt monohydrate</td>
			<td style="width:252px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:123px;">G1149</td>
			<td>Medium additions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:354px;">L-Glutathione reduced</td>
			<td style="width:252px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:123px;">G6013</td>
			<td>Medium additions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:354px;">Potassium Bicarbonate</td>
			<td style="width:252px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:123px;">237205</td>
			<td>Medium additions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:354px;">Select Yeast Extract&#160;</td>
			<td style="width:252px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:123px;">Y1000</td>
			<td>Medium additions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:354px;">Shields and Sang&#39;s M3 Insect medium</td>
			<td style="width:252px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:123px;">S8398</td>
			<td>Medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:354px;">Trpsin-EDTA (0.05 %), phenol red&#160;</td>
			<td style="width:252px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">25300054</td>
			<td>Subculturing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:354px;">Trypan Blue (0.4%)</td>
			<td style="width:252px;">BIO-RAD</td>
			<td style="width:123px;">145-0013</td>
			<td>Counting</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

thawing, culturing, and cryopreserving drosophila cell lines

ショウジョウバエ ゲノム リソース センター (DGRC) での分散 160 の異なるショウジョウバエの細胞の現在があります。ゲノム工学と新規細胞株の数が増加すると予想します。DGRC は、補完し、彼らの研究の議題をドライブ実験ツールとしてショウジョウバエ細胞株を用いた研究を理解を目指しています。解凍、養殖、セルラインをトウキョウにプロトコルを含むさまざまな異なる特性を持つショウジョウバエ細胞を操作するための手順が提供されます。重要なは、この出版物は、ショウジョウバエ細胞不定微生物や他の細胞からの汚染のリスクを最小限に抑えるために動作するように必要なベスト プラクティスを示します。なるこれらの手順に精通している者は、ショウジョウバエ培養細胞生化学、細胞生物学、ゲノム機能学を含むを使用する多くのアプリケーションに掘り下げて調査することができます。

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Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

ショウジョウバエの細胞株は、基礎・生物医学研究のための重要な試薬です。この資料では、融解、培養、研究のこれらの試薬の使用を組み込むことで研究者を支援するために一般的に使用されるショウジョウバエの細胞の凍結保存にプロトコルを提供します。

解凍、養殖、ショウジョウバエ細胞をトウキョウ

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...

これらのプロトコルは、任意の研究者が彼らの研究アジェンダを駆動または補完するためにショウジョウバエ細胞株の使用を組み込むのに役立ちます.すべてのショウジョウバエ細胞培養が、これらのガイドラインに従って取り扱われると、ほとんどが蘇生し、増殖し、凍結保存が良好である。70%エタノールで層流フードの作業面を拭き取った後、適切な媒体の5ミリリットルを25センチメートル平方のTフラスコに分配する。70%エタノールで冷凍セルラインの容器を拭き、蓋を慎重に緩めて開封します。パスツールピペットを使用して、フラスコからクリオバイアルに室温培地1ミリリットルを移し、凍結した細胞を解凍するために穏やかに混合します。細胞懸濁液があふれないように注意し、解凍した細胞懸濁液の全容をフラスコに移し、新しい培地でクライオバイアルをすすいする。細胞を25°Cインキュベーターで少なくとも2時間フラスコの底に沈下させます。長期間または液体窒素にマイナス80度の冷凍庫に戻って旅行のためにパッケージ化された凍結細胞を返さないで下さい。代わりに、できるだけ早く細胞を解凍します。軽顕微鏡で付着を確認した後、フラスコをインキュベーターに戻す前に、上清を5ミリリットルの新鮮な培地にそっと交換します。あるいは、解凍後、細胞懸濁液を遠心分離のために15ミリリットル円錐形チューブに移し、ちょうど実証したようにT-25フラスコに播種する前に新鮮な培地の5ミリリットルでペレットを再懸濁させる。細胞が通過する準備ができているかどうかを判断するには、顕微鏡下で培養の形態と合流を調べる。細胞密度と倍時間を考慮すると、細胞を最後にサブ培養した時、および培養中の微生物汚染の兆候がある。培養が非常にコンフルエントに見える場合は、培養上清の10ミリリットルを使用して、培養プレート底部から細胞を穏やかに外し、得られた単一細胞懸濁液中の生存細胞数を数えることによって細胞密度を決定する。細胞密度が適切な培地中で1ミリリットル当たり10〜6番目の細胞の間であれば細胞をサブ培養する。新しい培養プレートに1ミリリットル当たり6番目の細胞に少なくとも10倍10回加え、所望の播種細胞密度を達成する。次に、オペレータイニシャル、日付、分割比、播種細胞密度、細胞ライン識別子、媒体、通過数、および抗生物質などの媒体の添加物でプレートを覆い、ラベルを付け、25°Cインキュベーターで継続的なインキュベートのためにプレートをプラスチック容器に入れます。付着細胞を100ミリ培養皿底部から外すために、まず上清のすべてを滅菌フラスコに移し、0.05%トリプシンEDTAの1ミリリットルのゆっくりとした添加で細胞をすすい出す。トリプシン溶液が溶液を廃棄する前に成長面全体を覆っていることを確認するために穏やかに旋回します。次に、新鮮な0.05%トリプシンEDTAを1~2ミリリットルのプレートにそっと加え、25°Cインキュベーターにプレートを3~10分間入れます。細胞層が成長面から剥離し、滑り落ちるのを観察できる場合は、保存した上澄み物の9ミリリットルを添加してトリプシン活性を停止し、細胞の塊を解離するために細胞懸濁液を十分に混合する。すべての細胞が外れると、成長する表面は明らかになるでしょう。Neubauer細胞計数スライドを使用して細胞を手動でカウントするには、まずヘモサイトメータースライドの表面を拭き、スリップを70%アルコールでカバーします。混合後、ヘモサイトメーターの各溝付きエッジに15マイクロリットルの細胞を加えて、両方のチャンバーを充填します。細胞懸濁液は毛細管作用によって計数室に引き込まれる。10x顕微鏡の目的を使用して、平行線で結ばされたグリッドの中央にある1ミリメートルの平方領域内の100〜200個の細胞を数えます。次に、2番目のチャンバーで列挙を繰り返し、2つのカウントの平均を使用して、式に従って細胞密度を決定します。ショウジョウバエ細胞株凍結保存のために、細胞ペレットを凍結培地の体積で再中断し、1ミリリットル当たり少なくとも10〜7番目の細胞の最終細胞密度をもたらす。最終的なDMSO濃度が10%になるように、細胞懸濁液に適切な量の凍結保護剤、ジメチルスルホキシドまたはDMSOを加え、細胞懸濁液を穏やかに混合する。次に、細胞懸濁液の0.5ミリリットルのアリコートを事前ラベル付けされたクライオバイアルに慎重に加え、イソプロパノールで満たされた凍結容器にクライオバイアルを入れます。その後、凍結容器を一晩でマイナス80度の冷凍庫に移し、クライオバイアルの温度が冷凍庫の温度までゆっくりと下がるようにします。次に、液体窒素キャニスターに挿入するために、すぐに凍結バイアルを缶に移す。あるいは、冷凍クライオバイアルを冷却済みの冷凍ボックスに移し、凍結したクライオバイアルを窒素冷凍庫の液相に保管します。細胞株の合流は、光顕微鏡によって決定することができる。早期に合流に達する急速に成長する細胞株は、週に2回まで定期的に通過する必要があります。対照的に、成長の遅い細胞は、少なくとも2週間に1回以上通過することができるが、これらの細胞は毎週新鮮な培地を供給する必要がある。様々な組織源から誘導される細胞株は、その形態、付着特性、メディア要件、および倍時間が異なります。定量実験では、細胞数計が不可欠です。細胞は、ヘモサイトメーターまたは自動粒子カウンターを使用してカウントすることができます。細胞合流は、経験豊富なオペレータのためのサブ培養するタイミングのための視覚的なガイドです。しかし、細胞数は予測可能なサブカルリングスケジュールにつながり、成長異常の検出を容易にします。液体窒素を使用する場合は、注意して適切な保護具を使用してください。

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

の血液細胞集団のアッセイ<em&gt;キイロショウジョウバエ</em&gt;幼虫

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila ...

Establishment of Genome-edited Human Pluripotent Stem Cell Lines: From Targeting to Isolation

ゲノム編集したヒト多能性幹細胞株の樹立：分離へのターゲティングから

Genome-editing of human pluripotent stem cells (hPSCs) provides a genetically controlled and clinically relevant platform from which to understand human ...

Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research

Basicおよび前臨床研究のための密閉型細胞培養系でヒト多能性および神経幹細胞を培養します

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety ...

Imaging of Cell Shape Alteration and Cell Movement in Drosophila Gastrulation Using DE-cadherin Reporter Transgenic Flies

Imaging of Cell Shape Alteration and Cell Movement in Drosophila Gastrulation Using DE-cadherin Reporter Transgenic Flies

セル形状変化のイメージングと細胞運動で<em&gt;ショウジョウバエ</emDEカドヘリンレポータートランスジェニックハエを使用&gt;原腸陥入

Gastrulation is the first set of morphologically dynamic events that occur during the embryonic development of multicellular animals such as Drosophila. ...

Derivation of Stem Cell Lines from Mouse Preimplantation Embryos

マウス着床前胚幹細胞の誘導

Mouse embryonic stem cell (mESC) derivation is the process by which pluripotent cell lines are established from preimplantation embryos. These lines ...

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

郭清およびショウジョウバエ蛹卵巣の汚損

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a ...

An Efficient Strategy for Generating Tissue-specific Binary Transcription Systems in Drosophila by Genome Editing

An Efficient Strategy for Generating Tissue-specific Binary Transcription Systems in Drosophila by Genome Editing

ショウジョウバエのゲノム編集による組織固有のバイナリ転写システムを生成するための効率的な戦略

Binary transcription systems are powerful genetic tools widely used for visualizing and manipulating cell fate and gene expression in specific groups of ...

In Vitro Assays to Evaluate the Migration, Invasion, and Proliferation of Immortalized Human First-trimester Trophoblast Cell Lines

移行, 侵略, と不死化妊娠初期絨毛細胞の増殖を評価する生体外の試金

Cell movement is a critical property of trophoblasts during placental development and early pregnancy. The significance of proper trophoblast migration ...

Culturing and Measuring Fetal and Newborn Murine Long Bones

胎児と新生児のネズミの長骨の培養と測定

Long bones are complex and dynamic structures, which arise from endochondral ossification via a cartilage intermediate. The limited access to healthy ...

Cell-cell Fusion of Genome Edited Cell Lines for Perturbation of Cellular Structure and Function

細胞構造と機能の摂動のためのゲノム編集細胞株の細胞融合

Life is spatially partitioned within lipid membranes to allow the isolated formation of distinct molecular states inside cells and organelles. Cell fusion ...