이 프로토콜은 어떤 연구원든지 그들의 연구 의제를 몰거나 보완하기 위하여 Drosophila 세포주 사용을 통합하는 것을 도울 것입니다. 대부분의 경우 모든 Drosophila 세포 배양 부활, 증식, 그리고 이 지침에 따라 처리 될 때 잘 냉동 보존. 70%에탄올로 라미나르 유동 후드의 작업 표면을 닦은 후 적절한 배지의 5밀리리터를 25센티미터 제곱 T-플라스크로 분배합니다.
냉동 셀라인의 용기를 70%에탄올로 닦고 뚜껑을 조심스럽게 풀고 밀봉합니다. 파스퇴르 파이펫을 사용하여 플라스크에서 냉동 유리병에 실온 매체 1 밀리리터를 옮기고 부드럽게 혼합하여 냉동 셀을 해동시십시오. 세포 현탁액이 넘쳐나지 않도록 주의를 기울이고, 해동된 세포 현탁액의 전체 부피를 플라스크로 옮기고 냉동 유리병을 신선한 배지로 헹구는다.
세포가 25도 섭씨 인큐베이터에서 적어도 2 시간 동안 플라스크 의 바닥에 정착하도록 허용하십시오. 장기간 또는 액체 질소로 영하 80도 냉동고로 다시 이동하기 위해 포장 된 냉동 된 세포를 반환하지 마십시오. 대신 가능한 한 세포를 해동합니다.
가벼운 현미경으로 부착물을 확인한 후, 상체를 5밀리리터의 신선한 배지로 부드럽게 교체한 후 플라스크를 인큐베이터로 되돌리십시오. 또는, 해동 후, 원심분리를 위해 15밀리리터 원추형 튜브로 세포 현탁액을 옮기고 T-25 플라스크로 파종하기 전에 신선한 배지의 5밀리리터로 펠릿을 다시 중단한다. 세포가 통과 될 준비가되어 있는지 여부를 확인하려면 현미경으로 배양의 형태와 합류를 검사하십시오.
세포 밀도와 두 배의 시간을 고려하여, 세포가 하위 배양된 마지막 시간, 배양시 미생물 오염의 징후. 배양이 매우 혼잡해 보이는 경우, 배양판 바닥에서 세포를 부드럽게 빼내고 결과 단일 세포 현탁액에서 실행 가능한 세포의 수를 계산하여 세포 밀도를 결정하기 위해 배양 상류체의 10 밀리리터를 사용한다. 세포 밀도가 적절한 배지에서 밀리리터 당 제6 세포당 5~10배 에서 10배 사이인 경우 세포를 하위 배양한다.
원하는 파종 세포 밀도를 달성하기 위해 새로운 배양판에 밀리리터 농도당 여섯 번째 세포에 10배 이상 첨가한다. 그런 다음 작업자 이니셜, 날짜, 분할 비율, 파종 세포 밀도, 세포주 식별자, 중간, 통로 번호 및 항생제와 같은 임의의 중간 첨가물로 플레이트를 덮고 라벨을 부착하고, 25도 섭씨 인큐베이터에서 계속 된 인큐베이션을 위해 플레이트를 플라스틱 용기에 넣습니다. 부착 세포를 빼내기 위해 100밀리미터 배양 접시 바닥을 형성하고, 먼저 모든 상체를 멸균 플라스크로 옮기고 0.05%의 트립신 EDTA의 1밀리리터를 느리게 첨가하여 세포를 헹구십시오.
트립신 솔루션이 솔루션을 폐기하기 전에 전체 성장 표면을 덮도록 부드럽게 소용돌이합니다. 다음으로, 신선한 0.05%의 트립신 EDTA를 1~2밀리리터에 부드럽게 넣고 접시를 섭씨 25도 인큐베이터에 넣고 3~10분 간 배치합니다. 세포 층이 성장하는 표면에서 분리 및 슬라이딩을 관찰 할 수 있을 때, 저장된 상체체의 9 밀리리터를 첨가하여 트립신 활성을 중지하고 세포 현탁액을 철저히 혼합하여 세포 덩어리를 해리시한다.
모든 세포가 제거되면 성장하는 표면이 분명해집니다. Neubauer 셀 카운팅 슬라이드를 사용하여 세포를 수동으로 계산하려면 먼저 혈전계 슬라이드의 표면을 닦고 70 % 알코올로 미끄러짐을 덮습니다. 혼합 후, 두 챔버를 채우기 위해 혈종계의 각 홈 가장자리에 세포의 15 마이크로 리터를 추가합니다.
세포 현탁액은 모세관 작용에 의해 카운팅 챔버로 그려집니다. 10배 현미경 목표를 사용하여, 평행선에 의해 결합된 그리드의 중간에 있는 1밀리미터 제곱 영역 내에서 100에서 200 셀 사이를 계산합니다. 그런 다음 제2 챔버와 열거를 반복하고 두 카운트의 평균을 사용하여 수식에 따라 세포 밀도를 결정합니다.
Drosophila 세포주 극저온 보존을 위해, 밀리리터 당 7세포에 적어도 4배 의 최종 세포 밀도를 초래할 동결 배지의 부피에서 세포 펠릿을 다시 중단한다. 냉동 보호제, 디메틸 설산화물 또는 DMSO의 적절한 부피를 세포 현탁액에 넣고 최종 DMSO 농도가 10 %이고 부드럽게 세포 현탁액을 혼합할 수 있도록 세포 현탁액을 현명하게 떨어 뜨립니다. 다음으로, 셀 현탁액의 0.5 밀리리터 알리쿼트를 미리 표지된 냉동 유리병에 넣고 저온 바이알을 이소프로파놀로 채워진 냉동 용기에 넣습니다.
그런 다음 냉동 용기를 밤새 영하 80도의 냉동고로 옮겨 냉동고 온도가 천천히 떨어지도록 합니다. 다음으로, 액체 질소 캐니스터에 삽입하기 위해 낙동 유리병을 지팡이로 신속하게 이송합니다. 또는 냉동 냉동 고리 알병을 미리 냉각된 냉동 상자에 옮기고 냉동 냉동고의 액체 상에 냉동 냉동 고리 알병을 보관하십시오.
세포선의 합류는 빛 현미경에 의해 결정될 수 있다. 일찍 합류에 도달하는 빠르게 성장하는 세포주는 일주일에 두 번까지 정기적으로 통과해야합니다. 대조적으로, 느린 성장 세포는 이 세포가 매주 신선한 매체를 공급될 필요가 있더라도, 적어도 2 주 마다 한 번 또는 더 이상 통과될 수 있습니다.
다양한 조직 소스에서 파생 된 세포주 그들의 형태에서 다른, 준수 속성, 미디어 요구 사항, 그리고 두 배 시간. 정량적 실험의 경우 세포 계수가 필수적입니다. 세포는 혈종계 또는 자동화된 입자 카운터를 사용하여 계산될 수 있다.
세포 합류는 숙련된 연산자에 대한 하위 문화권에 대한 시각적 가이드입니다. 그러나, 세포 세는 예측 가능한 subculturing 일정에 이르게하고 성장 이상의 검출을 용이하게합니다. 액체 질소로 작업 할 때주의하고 적절한 보호 장비를 사용합니다.
