Tiner dyrking og Cryopreserving Drosophila linjer

Disse protokollene vil hjelpe enhver forsker innlemme bruk av Drosophila cellelinjer for å drive eller utfylle sin forskningsagenda. De fleste om ikke alle Drosophila cellekulturer gjenoppliver, sprer seg og kryo-bevare godt når de håndteres i henhold til disse retningslinjene. Etter å ha tørket ned arbeidsflaten til en laminær strømningshette med 70% etanol, dispenser fem milliliter av det aktuelle mediet i en 25 centimeter kvadrert T-kolbe.

Tørk av beholderen med frossen cellelinje med 70% etanol og løsne og løsne lokket forsiktig. Bruk en Pasteur pipette, overfør en milliliter romtemperaturmedium fra kolben til kryo-hetteglasset og bland forsiktig for å tine de frosne cellene. Ta vare på at cellesuspensjonen ikke renner over, overfør hele volumet av den tinte cellefjæringen til kolben og skyll kryo-hetteglasset med friskt medium.

La cellene bosette seg til bunnen av kolben i minst to timer i en 25 grader celsius inkubator. Ikke returner frosne celler som er pakket for å reise tilbake til minus 80 grader celsius fryser i en lengre periode eller i flytende nitrogen. I stedet tine cellene ASAP.

Etter å ha bekreftet vedlegg under et lett mikroskop, må du forsiktig erstatte supernatanten med fem milliliter friskt medium før kolben returneres til inkubatoren. Alternativt, etter tining, overføre celle suspensjon i en 15 milliliter konisk rør for sentrifugering og re-suspendere pellet i fem milliliter av frisk medium før seeding inn i en T-25 kolbe som nettopp demonstrert. For å finne ut om cellene er klare til å bli passasjer, undersøk kulturens morfologi og samløpet under et mikroskop.

Tatt i bruk celletettheten og doblingstiden, sist gang cellene ble subkulturert, og eventuelle tegn på mikroorganismeforurensning i kulturen. Hvis kulturen ser svært samløpet, bruk ti milliliter av kulturen supernatant for å forsiktig løsne cellene fra kulturplatebunnen og bestemme celletettheten ved å telle antall levedyktige celler i den resulterende enkeltcellesuspensjonen. Underkultur cellene hvis celletettheten er mellom fem til ti ganger ti til de sjette cellene per milliliter i riktig medium.

Legg til minst en ganger ti til de sjette cellene per milliliter konsentrasjon i en ny kulturplate for å oppnå ønsket såing celle tetthet. Dekk og merk deretter platene med operatørinitialene, dato, delt forhold, såing celletetthet, cellelinjeidentifikator, medium, passasjenummer og eventuelle mellomstore tillegg som antibiotika, og legg platene i plastbeholder for deres fortsatte inkubasjon i 25 grader celsius inkubator. For å løsne tilhengerceller danner en 100 millimeter kultur rett bunn, først overføre alle supernatant til en steril kolbe og skyll cellene med en langsom tillegg av en milliliter på 0,05% trypsin EDTA.

Virvle forsiktig for å sikre at trypsinløsningen dekker hele vekstoverflaten før oppløsningen kastes. Deretter legger du forsiktig til en til to milliliter frisk 0,05% trypsin EDTA til platen og plasserer platen i 25 grader celsius inkubatoren i tre til ti minutter. Når cellelaget kan observeres løsne og skyve ut av den voksende overflaten, stopp trypsinaktiviteten med tillegg av ni milliliter av det lagrede supernatantet og bland cellesuspensjonen grundig for å dissosiere celleklumpene.

Når alle cellene har blitt løsnet, vil den voksende overflaten være klar. Hvis du vil telle cellene manuelt ved hjelp av et Neubauer-celletellingslysbilde, må du først tørke av overflaten på et hemocytometersklie og dekkslipp med 70 %alkohol. Etter blanding, tilsett 15 mikroliter av cellene i hver rillet kant av hemocytometeret for å fylle begge kamrene.

Cellefjæringen trekkes inn i tellekammeret ved kapillær virkning. Ved hjelp av et 10x mikroskopmål teller du mellom 100 og 200 celler innenfor det en millimeter kvadrerte området midt i rutenettet som er bundet av parallelllinjene. Gjenta deretter opplistingen med det andre kammeret og bruk gjennomsnittet av de to tellingene til å bestemme celletettheten i henhold til formelen.

For Drosophila cellelinje kryo-bevaring, re-suspendere cellepellet i et volum av frysing medium som vil resultere i en endelig celle tetthet på minst fire ganger ti til de syvende cellene per milliliter. Tilsett et passende volum av kryobeskyttende, dimetylsulfoksid eller DMSO, i cellefjæringsfallet klokt slik at den endelige DMSO-konsentrasjonen er 10%og bland forsiktig cellefjæringen. Deretter legger du forsiktig til 0,5 milliliter aliquots av cellefjæringen i forhåndsmerkede kryo-hetteglass og plasserer kryo-hetteglassene i en frysebeholder fylt med isopropanol.

Overfør deretter frysebeholderen til en minus 80 grader celsius fryser over natten for å la temperaturen på kryo-hetteglassene falle sakte til frysertemperaturen. Deretter overfører du raskt kryo-hetteglassene til stokker for innsetting i en flytende nitrogenbeholder. Alternativt kan du overføre de frosne kryo-hetteglassene til en ferdigkjølt fryseboks og lagre de frosne kryo-hetteglassene i væskefasen av en nitrogenfryser.

Samløpet av en cellelinje kan bestemmes av lysmikroskop. Raskt voksende cellelinjer som når samløpet tidlig må passeres regelmessig, opptil to ganger i uken. I motsetning kan sakte voksende celler bli passasjer minst en gang annenhver uke eller lenger, selv om disse cellene må mates friskt medium hver uke.

Cellelinjer avledet fra varierende vevskilder varierer i deres morfologi, etterlevelsesegenskaper, mediekrav og doblingstider. For kvantitative eksperimenter er celletelling avgjørende. Cellene kan telles ved hjelp av et hemocytometer eller en automatisert partikkelteller.

Celle samløpet er en visuell veiledning for når du skal subkultur for den erfarne operatøren. Celletelling fører imidlertid til en forutsigbar subculturing tidsplan og forenkler påvisning av vekstanomalier. Vær forsiktig og bruk riktig beskyttelsesutstyr når du arbeider med flytende nitrogen.