Descongelamento, cultivo e Cryopreserving linhas de células de Drosophila

Esses protocolos ajudarão qualquer pesquisador a incorporar o uso de linhas celulares Drosophila para conduzir ou complementar sua agenda de pesquisa. A maioria, se não todas as culturas celulares Drosophila revivem, proliferam e preservam bem quando tratadas de acordo com essas diretrizes. Depois de limpar a superfície de trabalho de um capô de fluxo laminar com 70% de etanol, dispense cinco mililitros do meio apropriado em um frasco T de 25 centímetros quadrados.

Limpe o recipiente da linha celular congelada com 70% de etanol e solte cuidadosamente e dessem solte a tampa. Usando uma pipeta Pasteur, transfira um mililitro de meio de temperatura ambiente do frasco para o frasco crio-límola e misture suavemente para descongelar as células congeladas. Tomando cuidado para que a suspensão celular não transborde, transfira todo o volume da suspensão da célula descongelada para o frasco e enxágue o frasco crio-expresso com meio fresco.

Permita que as células se acomodem no fundo do frasco por pelo menos duas horas em uma incubadora de 25 graus celsius. Não devolva as células congeladas que foram embaladas para viajar de volta ao congelador de menos 80 graus celsius por um período prolongado ou em nitrogênio líquido. Em vez disso, descongele as células o mais rápido possível.

Depois de confirmar o acessório sob um microscópio leve, substitua suavemente o supernatante por cinco mililitros de meio fresco antes de devolver o frasco à incubadora. Alternativamente, após o descongelamento, transfira a suspensão celular para um tubo cônico de 15 mililitros para centrifugação e suspenda a pelota em cinco mililitros de meio fresco antes de semear em um frasco T-25 como apenas demonstrado. Para determinar se as células estão prontas para serem passagem, examine a morfologia e a confluência da cultura sob um microscópio.

Considerando a densidade celular e o tempo de duplicação, a última vez que as células foram subculturadas, e quaisquer sinais de contaminação microrganismo na cultura. Se a cultura parecer altamente confluente, use dez mililitros da cultura supernadante para desalojar suavemente as células do fundo da placa de cultura e determinar a densidade celular contando o número de células viáveis na suspensão celular única resultante. Subcultura as células se a densidade celular é entre cinco a dez vezes dez vezes dez a seis células por mililitro no meio apropriado.

Adicione pelo menos dez vezes à sexta célula por concentração mililitro em uma nova placa de cultura para alcançar a densidade celular desejada. Em seguida, cubra e rotule as placas com as iniciais do operador, data, proporção dividida, densidade celular semeada, identificador de linha celular, médio, número de passagem e quaisquer adições médias, como antibióticos, e coloque as placas em recipiente plástico para sua incubação contínua na incubadora de 25 graus celsius. Para desalojar as células aderentes formam um fundo de prato de cultura de 100 milímetros, primeiro transfira todo o supernasal em um frasco estéril e enxágue as células com uma adição lenta de um mililitro de 0,05% de trippsina EDTA.

Gire suavemente para garantir que a solução de trippsina cubra toda a superfície de crescimento antes de descartar a solução. Em seguida, adicione suavemente um a dois mililitros de 0,05% de trippsina edta fresca à placa e coloque a placa na incubadora de 25 graus celsius por três a dez minutos. Quando a camada celular pode ser observada se desprendendo e deslizando para fora da superfície em crescimento, pare a atividade de trippsina com a adição de nove mililitros do supernatante salvo e misture completamente a suspensão celular para dissociar as aglomerações celulares.

Quando todas as células tiverem sido desalojadas, a superfície em crescimento será clara. Para contar manualmente as células usando um slide de contagem de células Neubauer, primeiro limpe a superfície de um deslizamento hemótmetro e cubra o deslizamento com 70% de álcool. Após a mistura, adicione 15 microliters das células em cada borda ranhurada do hemócito para encher ambas as câmaras.

A suspensão da cela será arrastada para a câmara de contagem por ação capilar. Usando um objetivo de microscópio de 10x, conte entre 100 a 200 células dentro da área quadrada de um milímetro no meio da grade ligada pelas linhas paralelas. Em seguida, repita a enumeração com a segunda câmara e use a média das duas contagens para determinar a densidade celular de acordo com a fórmula.

Para a criopreservação da linha celular Drosophila, suspenda a pelota celular em um volume de meio de congelamento que resultará em uma densidade celular final de pelo menos quatro vezes dez a sete células por mililitro. Adicione um volume apropriado do crio-protetor, sulfóxido de dimetila ou DMSO, na suspensão da célula, de modo que a concentração final de DMSO seja de 10% e misture suavemente a suspensão da célula. Em seguida, adicione cuidadosamente 0,5 mililitros aliquots da suspensão celular em crio-frascos pré-rotulados e coloque os frascos crio-nuicos em um recipiente de congelamento cheio de isopropanol.

Em seguida, transfira o recipiente de congelamento para um congelador de menos 80 graus celsius durante a noite para permitir que a temperatura dos frascos crio-frascos caia lentamente para a temperatura do congelador. Em seguida, transferindo rapidamente os frascos crio-láis para bengalas para inserção em um recipiente de nitrogênio líquido. Alternativamente, transfira os frascos crio-nuicos congelados para uma caixa de congelamento pré-resfriado e armazene os frascos crio-nuicos congelados na fase líquida de um congelador de nitrogênio.

A confluência de uma linha celular pode ser determinada por microscópio leve. Linhas celulares de rápido crescimento que atingem confluência precocemente precisam ser passadas regularmente, até duas vezes por semana. Em contraste, células de crescimento lento podem ser passagemdas pelo menos uma vez a cada duas semanas ou mais, embora essas células precisem ser alimentadas com meio fresco a cada semana.

As linhas celulares derivadas de diferentes fontes teciduais diferem em suas morfologias, propriedades de adesão, requisitos de mídia e tempos de duplicação. Para experimentos quantitativos, a contagem de células é essencial. As células podem ser contadas usando um hemótmetro ou um contador automatizado de partículas.

A confluência celular é um guia visual para quando subcultura para o operador experiente. No entanto, a contagem de células leva a um cronograma previsível de subcultura e facilita a detecção de anomalias de crescimento. Tenha cuidado e use o equipamento de proteção adequado ao trabalhar com nitrogênio líquido.