Çözdürme, kültür ve Drosophila hücre hatları Cryopreserving

Bu protokoller herhangi bir araştırmacı sürücü veya araştırma gündemini tamamlamak için Drosophila hücre hatlarının kullanımını dahil yardımcı olacaktır. Çoğu değilse tüm Drosophila hücre kültürleri canlandırmak, çoğalır, ve kriyo-korumak iyi zaman bu kurallara göre ele. %70 etanollü bir laminar akış kaputunun çalışma yüzeyini sildikten sonra, uygun ortamın beş mililitresini 25 santimetre karelik bir T-şişesine dağıtın.

Dondurulmuş hücre hattının kabını %70 etanol ile silin ve kapağı dikkatlice gevşetin ve kapatını açın. Pasteur pipeti kullanarak, bir mililitre oda sıcaklığındaki orta aracı şişeden kriyo-şişeye aktarın ve donmuş hücreleri eritmek için hafifçe karıştırın. Hücre süspansiyonunun taşmayamadığını göz önünde bulundurarak, çözülmüş hücre süspansiyonunun tüm hacmini şişeye aktarın ve kriyo-şişeyi taze orta maddeyle durulayın.

Hücrelerin 25 derecelik bir kuluçka makinesinde en az iki saat boyunca şişenin dibine yerleşmesine izin verin. Uzun bir süre için eksi 80 santigrat derece dondurucuya geri seyahat için paketlenmiş dondurulmuş hücreleri iade etmeyin. Bunun yerine hücreleri en kısa sürede eritin.

Hafif bir mikroskop altında eki doğruladıktan sonra, şişeyi kuvöze geri vermeden önce süpernatantı beş mililitre taze orta ile nazikçe değiştirin. Alternatif olarak, çözüldükten sonra, santrifüj için 15 mililitrelik konik bir tüp içine hücre süspansiyon aktarın ve taze orta beş mililitre pelet yeniden askıya bir T-25 şişesi içine tohumlama önce sadece gösterildiği gibi. Hücrelerin geçişe hazır olup olmadığını belirlemek için, mikroskop altında kültürün morfolojisini ve birleşimini inceleyin.

Hücre yoğunluğu ve iki katına çıkarma süresi göz önüne alındığında, hücreler en son ne zaman alt kültüre alındı ve kültürde mikroorganizmakontaminasyonu belirtileri vardı. Kültür son derece etkili görünüyorsa, kültür tabakasıaltından hücreleri yavaşça çıkarmak ve ortaya çıkan tek hücre süspansiyonu canlı hücrelerin sayısını sayarak hücre yoğunluğunu belirlemek için kültür supernatant on mililitre kullanın. Hücre yoğunluğu uygun ortamda mililitre başına altıncı hücrelere beş ila on kat arasında ise alt kültür hücreleri.

İstenilen tohumlama hücre yoğunluğunu elde etmek için yeni bir kültür plakamililitre konsantrasyonu başına altıncı hücrelere en az bir kez on ekleyin. Daha sonra plakaları operatör baş harfleri, tarih, bölme oranı, tohumlama hücre yoğunluğu, hücre hattı tanımlayıcısı, orta, geçiş numarası ve antibiyotikler gibi tüm orta eklemelerle kaplayın ve plakaları 25 derece lik inkübatörde kuluçkaya yatsın lar için plastik konteyneriçine yerleştirin. Yapışık hücreleri çıkarmak için 100 milimetrelik bir kültür çanak alt formu, ilk steril bir şişe içine supernatant tüm transfer ve 0.05% tripsin EDTA bir mililitre yavaş bir ek ile hücreleri durulayın.

Trypsin çözeltisinin çözeltiyi atmadan önce tüm büyüme yüzeyini kapladığından emin olmak için yavaşça girdap. Daha sonra, yavaşça plakaya taze 0.05% tripsin EDTA bir ila iki mililitre ekleyin ve üç ila on dakika boyunca 25 derece santigrat santigrat kantimetre plaka yerleştirin. Hücre tabakasının büyüyen yüzeyden ayrılması ve kayması gözlemlendiğinde, kaydedilen süpernatantın dokuz mililitre eklenmesiyle tripsin aktivitesini durdurun ve hücre kümelerini ayırmak için hücre süspansiyonunu iyice karıştırın.

Tüm hücreler yerinden edildiğinde, büyüyen yüzey temiz olacaktır. Neubauer hücre sayma slaytını kullanarak hücreleri elle saymak için, önce hemositometre slaytının yüzeyini silin ve %70 alkolle kapağını kapatın. Karıştırma sonra, her iki odacık doldurmak için hemocytometer her oluklü kenarına hücrelerin 15 mikrolitre ekleyin.

Hücre süspansiyonu kılcal eylem le sayım odasına çekilecek. 10x mikroskop hedefi kullanarak, paralel çizgilerle bağlı ızgaranın ortasındaki bir milimetre karelik alan içinde 100 ila 200 hücre yi sayın. Daha sonra ikinci oda ile numaralandırma tekrarlayın ve formüle göre hücre yoğunluğunu belirlemek için iki sayma ortalamasını kullanın.

Drosophila hücre hattı kriyo-koruma için, mililitre başına yedinci hücrelere en az dört kat on son hücre yoğunluğu neden olacak dondurucu ortam hacmi nde hücre pelet yeniden askıya. Son DMSO konsantrasyonu% 10 ve yavaşça hücre süspansiyon karışımı gibi akıllıca hücre süspansiyon damla içine, kriyo koruyucu, dimetil sülfoksit veya DMSO uygun bir hacim ekleyin. Daha sonra, önceden etiketlenmiş kriyo-şişeler içine hücre süspansiyon0.5 mililitre aliquots ekleyin ve dondurucu bir kap içine dondurucu şişeler yerleştirin isopropanol dolu.

Daha sonra dondurucu kabı gece boyunca eksi 80 derecelik bir dondurucuya aktarArak dondurucuşişelerinin sıcaklığının dondurucu sıcaklığına yavaşça düşmesini bekleyin. Sonra, hızlı bir sıvı nitrojen teneke kutu içine yerleştirmek için kutulara kriyo-şişeleri transfer. Alternatif olarak, dondurulmuş kriyo-şişeleri önceden soğutulmuş bir dondurma kutusuna aktarın ve dondurulmuş kriyo-şişeleri azot dondurucunun sıvı fazında saklayın.

Bir hücre hattının birleşimi ışık mikroskobu ile belirlenebilir. Erken bir araya gelen hızlı büyüyen hücre hatlarının düzenli olarak haftada iki kez geçirilmesi gerekir. Buna karşılık, yavaş büyüyen hücreler en az bir kez her iki haftada bir veya daha uzun geçit edilebilir, Bu hücrelerin her hafta taze orta beslenmesi gerekir rağmen.

Değişen doku kaynaklarından elde edilen hücre hatları morfolojisi, yapışma özellikleri, ortam gereksinimleri ve katlama süreleri açısından farklılık gösterir. Nicel deneyler için hücre sayma esastır. Hücreler hemositometre veya otomatik parçacık sayacı kullanılarak sayılabilir.

Hücre birleşimi, deneyimli işleç için alt kültüre ne zaman girilen görsel bir kılavuzdur. Ancak, hücre sayma öngörülebilir bir subculturing programı yol açar ve büyüme anomalilerinin tespitini kolaylaştırır. Sıvı nitrojen le çalışırken dikkatli olun ve uygun koruyucu donanımı kullanın.