Name: thawing, culturing, and cryopreserving drosophila cell lines
Uploaded: 2019-04-16T15:00:00
Duration: 7 min 57 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines at JoVE.com

Biz ulusal sağlık Enstitüleri (Ödülü NIH P40OD010949) ve araştırma topluluğu DGRC küratörlüğünü çeşitli D. melanogaster DNA/vektör/hücre kaynakları kullanmak için teşekkür ederiz.

1. çözülme ve canlandırıcı dondurulmuş Drosophila hücre hatları
<ol><li>Başlık çalışma yüzeyi % 70 etanol ile silerek sterilize. Uygun orta (Tablo 1) 5 mL 25 cm2 T-şişesi (T-25) dağıtmak.</li>
	<li>Cryovial/ampul sıvı N2 veya kuru buz kaldırma. Cryovial % 70 etanol ile silin, dikkatle gevşetin ve ampul açıldı.</li>
	<li>Pasteur pipet kullanarak, oda sıcaklığında (RT) medya 1 mL T-25 şişeye geri alıyorum. Yavaş yavaş cryovial medya ekleyin ve karışımı yavaşça donmuş hücreleri hücre süspansiyon değil taşması sağlanması, çözülme.</li>
	<li>Birimin tümü çözdürülen hücre süspansiyon ampul T-25 şişesi aktarın. Hücre süspansiyon tamamen transfer edildi emin olmak için yineleyin.</li>
	<li>25 ° C kuluçka makinesine şişeye koyun, hücreleri en hücreleri artan yüzeyinde yerleşmiş emin olmak için mikroskop altında incelemek hücrelere yerleşmek ve en az 2 h. için uygun izin. Yavaşça eski medya kaldırın ve 5 mL taze medya ile değiştirin. Şişeye kuluçka makinesi dönün.</li>
	<li>Ertesi gün, yavaşça eski medya kaldırın ve 5 mL taze medya ile değiştirin. Kültür için kuluçka dönün.</li>
</ol>2. çözülme ve canlandırıcı dondurulmuş Drosophila hücre hatları (seçimli)
<ol><li>Steril bir başlık, 1 mL RT medya ile dondurulmuş Pelet resuspending tarafından hücreleri çözülme. Çözdürülen hücre süspansiyon 15 mL konik tüp içine aktarın.</li>
	<li>Hücreleri tarafından Santrifüjü 1000 x g 5 dk. atmak için de süpernatant cips ve hücre Pelet 5 mL taze medya resuspend.</li>
	<li>Tüm birim hücre süspansiyon, bir T-25 şişesi aktarmak ve kültür 25 ° C'de kuluçkaya</li>
	<li>1-2 h sonra hücreleri en hücreleri artan yüzeyinde yerleşmiş emin olmak için mikroskop altında incelemek. Ertesi gün, eski ortamı ile 5 mL taze medya değiştirin ve kültür için kuluçka dönün.</li>
</ol>3. subculturing yarı yapışık hücreleri 100 mm kültür levha yetiştirilen
<ol><li>Başlık % 70 etanol ile silerek sterilize. Subculturing için steril malzemeler medya şişeleri, Pipetler, pipet yardım ve kültür tabak gibi başlık getirin.</li>
	<li>Morfoloji ve izdiham kültür bir mikroskop altında incelemek. Kültür microorganismal contaminations net işaretler arayın. Hücreleri pasajlı için hazır olup olmadığını belirlemek kültür özelliklerine göre: hücre yoğunluğu ve zaman, en son ne zaman onlar subcultured dahil iki katına çıkarın.</li>
	<li>Eğer kültür yüksek gözükmek birleşmesi (şekil 1), hücre yoğunluğu belirlemek. Steril mahallede büyüyen yüzeyine hücrelerinden plaka ortamından ilâ 10 mL pipetting ve hücrenin üzerine dağıtımı tarafından çıkarmak. Birkaç kez, büyüyen yüzeyi açık hale gelinceye kadar köpük, yaratmak için değil sağlanması yineleyin. Bir hemasitometre veya bir otomatik parçacık sayaç (Bölüm 5, şekil 3) kullanarak hücre yoğunluğu belirlemek. Alt kültür hücreleri hücre yoğunluğu 5 x 106 ve 1 x 107 hücre/mL arasında ise. Not: Değil alt kültür Drosophila hücre hatları için bir hücre yoğunluğu 1 x 106 hücre/mL altında yapmak.</li>
	<li>
Buna göre en az 1 x 106 hücre/mL nihai bir tohumlama konsantrasyon için uygun bir ortam kullanarak hücre süspansiyon sulandırmak.
	<ol>
<li>Rutin passaging ve bakım için önceden belirlenmiş bir birime orta istenen tohumlama hücre yoğunluğu sağlamak için yeni bir kültür plaka hücre süspansiyon uygun bir hacmi ekleyin.</li>
		<li>Bir kültür ölçekleme için tüm hücre süspansiyon büyük bir şişesi aktarın. Hücre süspansiyon için uygun bir birimdeki orta istenilen hücre yoğunluğu oranında seyreltin. Seyreltilmiş hücre süspansiyon yeni plakalar için eşit miktarda dağıtın. Bu yöntem hücre yoğunluğu plaka arasındaki varyasyonları en aza indirir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kapak ve etiket plakaları operatör baş harfleri, Tarih, split oranı, tohumlama hücre yoğunluğu, hücre satırı tanımlayıcıları, medya, geçiş numarası ve antibiyotikler gibi herhangi bir medya ekleme.</li>
	<li>Tabakları bir plastik konteyner içine yerleştirin ve kutusuna da kuluçka için dönün. Not: Tablo 3 Drosophila hücre satırları ve ilişkili çalışma birimleri kültür için yaygın olarak kullanılan kültür damarları listeler.</li>
</ol>4. kekii 100 mm kültür levha yetiştirilen yapışık hücreleri
<ol><li>Tüm Orta plaka için yeni bir steril şişe aktarın. Orta kaydedin.</li>
	<li>Hücreleri 1 mL % 0.05 tripsin-EDTA plakasına yavaş yavaş ekleyerek durulayın. Tripsin çözüm tüm büyüme yüzey kapsar emin olmak için yavaşça girdap. Tripsin çözüm atın.</li>
	<li>Yavaşça 1 mL % 0.05 tripsin-EDTA plaka ekleyin. 25 ° c arasında hücre katmanı ayırma görünür işaretleri için izleme ve sürgülü büyüyen yüzeyi kapalı iken 3−10 min plaka kuluçkaya.</li>
	<li>Kaydedilmiş orta 9 mL tripsin etkinliğini durdurmak için plaka ekleyin. Hücre kümeleri ayırmak için hücre süspansiyon karıştırın. Bir kez tüm hücreleri yerinden, büyüyen yüzeyi açık olacak. Not: Güçlü yapisan hücre hatları passaging içinde tripsin AIDS gibi sindirim enzimleri kullanımı. Tripsin proteaz kez domuz pankreas türetilmiş bir karışımıdır ve saflık farklı sınıflarda ticari olarak kullanılabilir.</li>
</ol>5. el ile hücre kullanarak slayt sayımı Neubauer Hücre sayımı
<ol><li>Hemasitometre slayt ve coverslip % 70 alkol ile yüzey silerek hazırlayın.</li>
	<li>Hücre süspansiyon mix ve hücre süspansiyon 15 µL yivli (hemasitometre ilk TMMOB doldurmak için,şekil 3A) hemasitometre kenarına dağıtmak. Hemasitometre ikinci TMMOB doldurun. Hücre süspansiyon kılcal eylem tarafından sayım odasına çekilecek.</li>
	<li>10 x mikroskop objektif kullanarak, 1 mm2 alanı paralel çizgiler (şekil 3 c,D) tarafından bağlı kılavuz ortasında içinde hücreleri saymak. Yinelenen sayma önlemek için üst ve sol sınırları yerleşimi hücreleri, ama değil 200 µm2 kareler sağ ve alt sınırları çapraz hücre sayısı. 100−200 hücreler arasında saymak. İkinci odası sayısıyla yineleyin.</li>
	<li>İki adet ortalamasını hesaplamak ve hücre yoğunluğu aşağıdaki formüle göre belirlemek: hücre yoğunluğu (hücre/mL) ortalama hücre sayısı (n1 + n2/2) x 10 =4. Not: Hücre canlılığı üzerinde toplam hücreler hücrelerin yüzdesi olarak ifade edilir. Hücre canlılığı belirlemek için hücre süspansiyon (% 0,4) trypan mavi eşit bir hacmi ile karıştırın el ile veya otomatik Hücre sayımı önce çözüm. Ölü hücreleri mavi lekeli iken canlı hücreleri boya kadar etkili olmayacaktır.</li>
</ol>6. Drosophila hücre satırları dondurma
<ol><li>Kültür sağlıklı morfolojisi, büyüme ve kontaminasyon olmaması için kontrol edin. Kültürler hasat ortalarında geç günlük büyüme aşamasına (Adım 3.3 veya bölüm 4). Birçok Drosophila hücre hatlarında, bu yaklaşık 4 x 106 hücre/mL 8 x 106 hücre/ml arasındadır.</li>
	<li>Tüm hücre süspansiyon 15 mL veya 50 mL konik tüp içine aktarın. Santrifüjü 1000 x g 5 min için de tarafından hücreleri toplamak ve süpernatant atın.</li>
	<li>Hücre Pelet bir birimdeki bir son hücre yoğunluğu en az 4 x 107 hücre/mL neden olur donma orta (Tablo 4) resuspend.</li>
	<li>Öyle ki son DMSO konsantrasyonu % 10 dropwise cryoprotectant Dimetil sülfoksit (DMSO) uygun miktarda hücre süspansiyon ekleyin. Hücre süspansiyon karışımı yavaşça.</li>
	<li>Dikkatli bir şekilde hücre süspansiyon 0.5 mL önceden etiketli cryovials (~ 2 x 107 hücreler/şişe) aliquots içine dağıtmak. Ampul isopropanol (şekil 4A) ile dolu bir dondurucu kaba yerleştirin. Dondurma konteyner yavaş yavaş düşmeye cryovials sıcaklığını izin vermek için bir-80 ° C dondurucu içine gecede transfer (-1 ° C/dak) derin dondurucu sıcaklık için.</li>
	<li>Donmuş cryovials almak ve hızlı bir şekilde köpekler (şekil 4B) ekleyebilirsiniz. Cryovials bir teneke kutu (şekil 4 c) içeren köpekler yerleştirin. Alternatif olarak, donmuş cryovials önceden soğutulmuş dondurucu kutusunun (şekil 4 d) içine yerleştirir. Mağaza cryovials N2 derin Dondurucular (şekil 4E,F) sıvı faz donmuş. Not: Dondurucu medya içeren DMSO kullanırken, RT, 30 dakikaya kadar bir gecikme hücrelere zararlı değildir.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Baum, B., Cherbas, L., Dahmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila:+Methods+and+Protocols.">Drosophila: Methods and Protocols.</a> Methods in Molecular Biology. 420, 391-424 (2008).</li><li>Cherbas, L., Gong, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lines.">Cell lines.</a> Methods. 68 (1), 74-81 (2014).</li><li>Luhur, A., Klueg, K. M., Zelhof, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+and+working+with+Drosophila+cell+cultures:+Current+challenges+and+opportunities.">Generating and working with Drosophila cell cultures: Current challenges and opportunities.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: Developmental Biology. , e339 (2018).</li><li>Franz, A., Brunner, E., Basler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+genome-modified+Drosophila+cell+lines+using+SwAP.">Generation of genome-modified Drosophila cell lines using SwAP.</a> Fly (Austin). 11 (4), 303-311 (2017).</li><li>Housden, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+potential+drug+targets+for+tuberous+sclerosis+complex+by+synthetic+screens+combining+CRISPR-based+knockouts+with+RNAi.">Identification of potential drug targets for tuberous sclerosis complex by synthetic screens combining CRISPR-based knockouts with RNAi.</a> Science Signaling. 8 (393), r9 (2015).</li><li>Kunzelmann, S., Bottcher, R., Schmidts, I., Forstemann, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comprehensive+Toolbox+for+Genome+Editing+in+Cultured+Drosophila+melanogaster+Cells.">A Comprehensive Toolbox for Genome Editing in Cultured Drosophila melanogaster Cells.</a> G3 (Bethesda). 6 (6), 1777-1785 (2016).</li><li>Ishizu, H., Sumiyoshi, T., Siomi, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+CRISPR-Cas9+system+for+genome+editing+in+cultured+Drosophila+ovarian+somatic+cells.">Use of the CRISPR-Cas9 system for genome editing in cultured Drosophila ovarian somatic cells.</a> Methods. 126, 186-192 (2017).</li><li>Echalier, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Drosophila Cells in Culture. , (1997).</li><li>Echalier, G., Perrimon, N., Mohr, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Drosophila cells in culture. 2nd edition. , (2017).</li><li>Cherbas, L., Cherbas, P., Roberts, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Drosophila: A practical approach. 10, 319-346 (1998).</li><li>Schneider, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lines+derived+from+late+embryonic+stages+of+Drosophila+melanogaster.">Cell lines derived from late embryonic stages of Drosophila melanogaster.</a> Journal of Embryollgy and Experimental Morphology. 27 (2), 353-365 (1972).</li><li>Echalier, G., Ohanessian, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolement,+en+cultures+in+vitro,+de+lignees+cellulaires+diploides+de+Drosophila+melanogaster.">Isolement, en cultures in vitro, de lignees cellulaires diploides de Drosophila melanogaster.</a> Comptes rendus de l'Acad&#233;mie des Sciences. 268, 1771-1773 (1969).</li><li>Ui, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Newly+established+cell+lines+from+Drosophila+larval+CNS+express+neural+specific+characteristics.">Newly established cell lines from Drosophila larval CNS express neural specific characteristics.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology &#8722; Animal. 30A (4), 209-216 (1994).</li><li>Ui, K., Ueda, R., Miyake, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lines+from+imaginal+discs+of+Drosophila+melanogaster.">Cell lines from imaginal discs of Drosophila melanogaster.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology. 23 (10), 707-711 (1987).</li><li>Currie, D. A., Milner, M. J., Evans, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+growth+and+differentiation+in+vitro+of+leg+and+wing+imaginal+disc+cells+from+Drosophila+melanogaster.">The growth and differentiation in vitro of leg and wing imaginal disc cells from Drosophila melanogaster.</a> Development. 102, 805-814 (1988).</li><li>Niki, Y., Yamaguchi, T., Mahowald, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+stable+cell+lines+of+Drosophila+germ-line+stem+cells.">Establishment of stable cell lines of Drosophila germ-line stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (44), 16325-16330 (2006).</li><li>Saito, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+regulatory+circuit+for+piwi+by+the+large+Maf+gene+traffic+jam+in+Drosophila.">A regulatory circuit for piwi by the large Maf gene traffic jam in Drosophila.</a> Nature. 461 (7268), 1296-1299 (2009).</li><li>Simcox, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+genetic+method+for+establishing+Drosophila+cell+lines+unlocks+the+potential+to+create+lines+of+specific+genotypes.">Efficient genetic method for establishing Drosophila cell lines unlocks the potential to create lines of specific genotypes.</a> PLoS Genetics. 4 (8), e1000142 (2008).</li><li>Sumiyoshi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+l(3)mbt+leads+to+acquisition+of+the+ping-pong+cycle+in+Drosophila+ovarian+somatic+cells.">Loss of l(3)mbt leads to acquisition of the ping-pong cycle in Drosophila ovarian somatic cells.</a> Genes &amp; Development. 30 (14), 1617-1622 (2016).</li><li>Dequeant, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+progenitor+cell+signatures+by+time-series+synexpression+analysis+during+Drosophila+embryonic+cell+immortalization.">Discovery of progenitor cell signatures by time-series synexpression analysis during Drosophila embryonic cell immortalization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (42), 12974-12979 (2015).</li><li>Young, L., Sung, J., Stacey, G., Masters, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Mycoplasma+in+cell+cultures.">Detection of Mycoplasma in cell cultures.</a> Nature Protocols. 5 (5), 929-934 (2010).</li><li>Shields, G., Sang, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+medium+for+culture+of+Drosophila+embryonic+cells.">Improved medium for culture of Drosophila embryonic cells.</a> Drosophila Information Service. 52, 161 (1977).</li><li>Freshney, R. I., Capes-Davis, A., Gregory, C., Przyborski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Culture of animal cells : a manual of basic technique and specialized applications. Seventh edition. edn. , (2016).</li><li>Lee, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+copy+number+evolution+in+Drosophila+cell+lines.">DNA copy number evolution in Drosophila cell lines.</a> Genome Biology. 15 (8), R70 (2014).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Drosophila hücre kültürleri yüksek üretilen iş hücre tabanlı ekranlar için birincil reaktifler vardır. Bunların kullanımı aynı zamanda tamamlar içinde vivo genetik araştırma yanında-mek şartıyla hücrelerin biyokimya, sinekler, hücre biyolojisi, mikroskobu ve daha yakın zamanlarda genetik somatik hücre enjekte önce transgenik yapıları, test hızlı için uygun homojen bir nüfusa 1,2,3,8,9,10düzenleme genom tarafından manipülasyonlar.
Canlılık ve kurtarma donmuş Drosophila hücre düşük sıcaklıklarda dahi şiddetli dalgalanmalara hassas. DGRC N2 (-196 ° C) sıvı faz donmuş hücre satırlarını depolar ve onları kuru buz (-78.5 ° C) taşır. Kuru buzun içinde taşınan donmuş ampul geri sıvı N2 veya depolama için bir-80 ° C dondurucu içine aktarılmamalıdır. Bunun yerine, donmuş hücreleri olmalı çözdürülen, yüksek hücre yoğunluğu en kısa zamanda girişte (iletişim kuralı Bölüm 1) adlı reseeded ve onların Hedeflenen Amaçlar (iletişim kuralı Bölüm 3) için kültürlü. Hücre hatları hemen deneyler için kullanılmaz, kullanıma hazır olana satırları olmalıdır hücre (iletişim kuralı Bölüm 6) cryopreserved.
ML-BG2-c2 ve Ras hatları gibi bazı hücre hatları cryopreserved durumundan canlanan etkileri kurtarmak için birkaç güne ihtiyacım var. Hücresel enkaz önemli miktarda bu hücre satırları çözdürme sonra ilk birkaç gün eşlik eder. Rahatsız edilmeden yaptı, hücrelerin prolifere yeniden elde etmek ve. Birçok Drosophila hücre hatları DGRC M3 tabanlı medya22yılında büyümeye uyarlanmıştır. Çözdürme etkilerinden kurtarmak yavaş hücre satırlarını için şartına medya kullanımı yararlı olabilir. Klimalı ortamları olası kurtarma ve çözdürme sonra hücrelerin çoğalması teşvik medya içine hücreleri tarafından salgılanan büyüme faktörleri içerir.
Hücre hatları genellikle lag faz, üssel faz, plato faz ve bir bozulma faz oluşan bir klişeleşmiş büyüme eğrisi izleyin. Ne zaman onlar bir yoğunluğu 1 x 106 ila 1 x 107 hücre/mL 25 ° C'de, kültürlü kadar Drosophila hücre satır büyüme log fazı içinde prolifere Öyle ki her zaman üstel büyüme aşamasında olduklarını hücre hatları pasajlı ki esastır.
Yüzde olarak ifade edilen bir kültür, izdiham hücreleri tarafından kaplıdır büyüme yüzey alanı açıklar. Hücre izdiham bir hücre satırı için hücre şekli ve boyutu bağlıdır. Farklı hücre satır türleri farklı morfoloji ve bağlılık özellikleri var. Sonuç olarak, farklı hücre hatları yaklaşık benzer izdiham, büyük ölçüde farklı hücre yoğunluğu (şekil 1) olabilir. Kültür izdiham Drosophila hücre hatları bile büyüme yüzey edildikten sonra bir başka üstüne kazık foci olarak mı yoksa süspansiyon tarafından çoğalırlar devam etmesi Drosophila hücre kültürleri passaging için ideal bir göstergesi olmayabilir kapalı (şekil 1). Ancak, kullanıcılar belirli hücre hatları ile deneyimli kez izdiham için hızlı görsel bir kılavuz olarak için alt kültür zaman kullanabilir.
O 19−25 ° C arasında ortam RT Drosophila çizgilere büyümek mümkün olmakla birlikte, ortam sıcaklığı dalgalanmalar nükleer silahların yayılmasına karşı kurunu etkileyebilir çünkü önerilmez. Bir adanmış 25 ° C kuluçka kullanılması önerilir. Kuluçka makinesi Drosophila hücre kültürleri için arabelleğe almak için CO2 Drosophila hücre kültür medya kullanmayın çünkü CO2 gaz alışverişini kolaylaştırmak gerekmez. Hücre hatları kültür için kuluçka makinesi içinde nem plakaları hücrelerde kültür zaman gözden değil için önemli bir faktördür. Kuluçka makinesi ve çalışma ortamı türüne bağlı olarak, kuluçka makinesi içinde steril su kabı yerleştirmek için gerekli olabilir. Medya buharlaşma en aza indirmek için kapalı T-flask kullanın veya kültür plakaları sıkıca kapalı bir plastik konteyner kombine kuluçka makinesi iken içinde saklayın.
Drosophila hücre hatları subculturing için bir program geliştirmek önemlidir. Büyüme oranı ve monitör tutarlılık tahmin etmek için bu alt kültür bile geometrik bir oranında (oranı split 1:2, 1:4, 1:8) için uygundur. Örneğin, bir 10 mL Konfluent tabak Kc167 hücre 8 x 106 hücre/mL, 1 x 106 hücre/mL (1,25 mL taze medya 8,75 mL sulandırılmış hücre süspansiyon) tohumlama yoğunluğu elde etmek için 1:8 oranında bölebilirsiniz. 72 saat içinde Kc167 kültürler 24 h katlama zaman verilen 8 x 106 hücre/mL, bir yoğunluk için çoğalırlar bekleniyor. Split oranı bu nedenle hücreleri her zaman onların büyüme üstel günlük aşamasında kültürlü sağlanması bir uygun alt kültür rutin kadar haftada iki kez, kolaylaştırmak için belirlenir. Bu ne çok kısa ne de çok uzun zaman izdiham için böylece hücreleri subculturing düzenli bir zamanlama sağlar. İzdiham zaman çok kısa ise, hücreleri bir alt hücre yoğunluğuna (daha yüksek split oranı) subcultured. Benzer şekilde, izdiham ulaşmak için zaman çok uzun ise, hücreleri daha yüksek bir hücre yoğunluğuna (alt bölme oranı) subcultured. Çoğu Drosophila hücre satırlarının düşük hücre yoğunluğu için çok hassas olduğunu unutmamak gerekir (< 1 x 105 hücre/mL), hangi hücrelerin pek çoğalırlar ve sonunda ölebilir.
Drosophila hücre hatları büyüme özellikleri ve Morfoloji değişir. Sonuç olarak, hücre hatları farklı özelliklere sahip farklı şekilde ele alınması gerekebilir. Çoğu Drosophila hücre hatları yarı yapisan vardır. Alt hücre yoğunluğu, onlar daha güçlü büyüme yüzeye bağlı kalmak ve kültür Konfluent hale geldikçe, hücreler daha az yapışık olmak ve kolayca ayırmak. Sadece onları çıkarmak için hücre monolayer medya dağıtmak operatör sağlar gibi hücre bağlılık bu dereceli değişim kolay subculturing en çok kullanılan Drosophila hücre hatları (Schneider, Kc çizgiler, Imaginal disk ve CNS satırları) kolaylaştırır Kültür yoğun olduğunda büyüme yüzeyden. Yüzey yapışık gibi satırları için kadın mikrop-line kök/yumurtalık somatik kılıf (fGS/OSS) ve Ras çizgiler, tripsin büyüme yüzey hücreleri ayırma yardım etmek kısa bir süre için hücrelerde kuluçkaya için gerekli olduğunu.
Medya eklemeleri için çoğu Drosophila hücre hatları fetal buzağı serum (FCS) içerir. İnsülin ve yetişkin sinek özü (FEX) bazı belirli satırları için gereklidir. FEX tanımsız bileşenleri belirli larva Imaginal disk yetişkin yumurtalık hücre satırları ve büyüme için gerekli içerir. DGRC hazırlar ve yapar kullanılabilir yetişkin FEX elde edilen 1 haftalık Oregon-R-modENCODE sinekler (RRID: BDSC_25211) 2.5 mL ve 10 mL aliquots içinde. DGRC de küçük ölçekli FEX hazırlık için yönergeler kendi web sitesinde sağlar. < https://dgrc.bio.indiana.edu/include/file/additions_to_medium.pdf>. FEX hazırlık, ancak, zaman alıcı ve yetişkin sinekler büyük miktarda gerektirir.
Drosophila hücre satırları dondurma zaman ve hücre hatları bakım Kimyasalları hemen kullanılmıyor olarak kaydeder. Dondurma yavaş yavaş hücreleri (-1 ° C/dak) dondurarak-80 ° c DMSO, bir cryoprotective ajan içeren bir ortamda elde edilir. Yavaş soğutma başarılı dondurma için kritik bir adımdır. -80 ° C dondurucuya hücre ampul-1 ° C/dk isopropanol ile dolu bir dondurma konteyner yerleştirildiğinde bir hızda soğutulur. 25 ° C ortam sıcaklığında başlayarak, o-ecek almak en fazla 2 saat-80 ° C. ulaşmak için ampul sıcaklığı için Bir gecede donarak ampul bırakmanız önerilir.
Donmuş ampul hızla uzun süreli depolama için azot sıvı fazına aktarılmalıdır. Ortam sıcaklığında cryovial hızla yaklaşık 10 ° C/dak Isıtınız ve canlılığı,-50 ° C23tehlikeye girer. Transfer hızlı tutmak için ampul maruz kalma ortam sıcaklığı en aza indirmek için küçük gruplar halinde ele. Alternatif olarak, donmuş cryovials sıvı N içine transfer için hazırlarken kuru Buza koyun2. Sıvı azot yoksa, hücreleri rağmen zaman içinde önemli bozulma riski ile-80 ° C dondurucuda saklanabilir.
Hücre yoğunluğu başarılı dondurma ve hücre hatları izleyen bir canlanma için önemlidir. Genel olarak, yeni hücre satırları ilk oluşturmak için dondurulmuş Dondur (1−3 ampul) hücrelerinin aşırı kullanılabilir duruma gelir gelmez. Hücre kültürünü daha stabil kültürlü bir kez 10−20 ampul donmuş stokunun oluşturulması gerekir. Bu hisse senedi sonra onun sonrası donma hücre kurtarma ve canlılığı, sonra Hollow'a için dağıtılır olup olmadığını denetlemek için veya dondurulmuş hisse senedi ampul sayısı beş düştüğünde hisse senedi yerine çözdürülen. Son olarak, çözdürülen hücreleri hücre hatları3,24gelişmeye bilinmektedir onun ebeveyn hisse senedi özellikleri saklamanız doğrulanması önemlidir.
Sonuç olarak, bu yazı çeşitli çizgiler, en iyi yöntemler ve görsel-işitsel iletişim kuralları üzerinde Drosophila hücre satırlarını temel kullanımı için temel bilgileri sağlayarak Drosophila hücre kültürleri ile çalışmak için bir astar sunar. Bu erişilebilir kaynak sorunsuz kültürlü Drosophila hücreleri ile çalışmaya giriş kolaylaştırmak için ve herhangi bir araştırma laboratuvarı mevcut Eğitim Kılavuzları tamamlayacak anlamına da gelmektedir.

Drosophila kullanımı tamamlar içinde vivo genetik analiz sinek ve birçok temel biyolojik sorular1,2,3adresleme için birincil araştırma aracı olarak hizmet veren hücreler kültürlü. Drosophila hücre hatları farklı genetik kökenli farklı doku kaynaklardan elde edilen hücre benzersiz homojen nüfus sunuyoruz. Hücre hatları transgenik gen ekspresyonu, genomik, transcriptomics, proteomik, metabolomics, yüksek işlem hacmi RNA müdahale (RNAi) ekranlar, hücre biyolojisi ve mikroskobu gibi birçok uygulamalar için uygundur. Önemlisi, bilinen uyaranlara karşı hemen geçici yanıt karakterizasyonu Drosophila hücre kültürü kullanımını kolaylaştırır. Ayrıca, Drosophila hücre kültürü düzenleme, nispeten kolay belirli genom değişiklikler4,5,6ile, yeni hücre satırları oluşturmak için yapım CRISPR Cas9 genom mükellef 7.
Drosophila genomik Kaynak Merkezi (DGRC) Drosophila hücre hatları için bir depo ve dağıtım merkezi olarak hizmet vermektedir. DGRC amaçlarından biri de Drosophila hücre kültür kaynakları kullanarak araştırma topluluk üyeleri yardımcı olmaktır. Bu makale Drosophila hücre satırlarını işleme için temel iletişim kuralları sunar. Drosophila hücre kültürleri işleme ile rahat olmak ve bağımsızlık kendi deneyleri1,2,8,9 seviyesindeki araştırmacılar yardımcı olmak için mevcut kaynakları tamamlar ,10.
En sık kullanılan Drosophila hücre hatları: Schneider hatları11, Kc16712, Mitsubishi/Miyake Imaginal disk ve merkezi sinir sistemi (MSS)13,14, Milner laboratuvar Imaginal disk satırları satırları 15, Yetişkin yumurtalık hücre hatları16,17ve Ras hatları18 (Tablo 1). Schneider ve Kc167 satırları biyokimya, rekombinant transgenik gen ekspresyonu ve ters genetik ekranlar için genel amaçlı cep çizgiler vardır. Mitsubishi/Miyake laboratuvar (ML) satırları ya larva Imaginal diskler ya da merkezi sinir sistemi (MSS) elde edilmiştir ve neurosecretion, transkripsiyon yönetmelik ve RNA işlenmesi ile ilgili çalışmaları için yararlı olmuştur. Milner (CME) disk satırları sinyal iletimi eğitimi için önemli bir şey. Mutasyona uğramış yetişkin yumurtalık türetilmiş fGS/OSS hücre satırlar kodlamayan RNA küçük, biyoloji germ hücreli bakım ve farklılaşma17,19etkisini incelemek için önemli reaktifler kalır. Son olarak, çünkü ectopically Ras onkogen ifade embriyo elde edilen hücre hatları bunlar Ras satırlar benzersizdir. Onlar kas öncü hücrelerinin transkripsiyon imzaya sahip ve aktif piRNA makine20ifade eder. Son derleme ve kitap bölümleri daha fazla ayrıntılı bilgi2,3,9popüler hücre et uygulamaları kapsar.
Bu hücre satırları subcultured ve donmuş. Her hücre kültürünü nasıl tutulur ve dondurma için hazırlanan için küçük ama önemli farklı gereksinimleri vardır. Örneğin, farklı hücre hatları farklı medya ve takviyeleri (Tablo 1) gerektirir. Satırları yüzey yapışma özellikleri, türleri Morfoloji (Resim 1 ve Şekil 2), genotip ve katlama zaman (Tablo 2) de değişir. Biz temel iletişim kuralları sunmak ve çeşitli yaygın olarak kullanılan Drosophila hücre satırlarını işlemek için benzersiz farklılıkları vurgulayın.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:899px;" width="898">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:354px;">100 mm tissue culture plates</td>
			<td style="width:252px;">Corning&#160;</td>
			<td align="right" style="width:123px;">430167</td>
			<td style="width:171px;">Subculturing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:354px;">25 cm2 T-flask</td>
			<td style="width:252px;">Corning&#160;</td>
			<td align="right" style="width:123px;">430168</td>
			<td>Subculturing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:354px;">35HC Liquid Nitrogen Storage Tank</td>
			<td style="width:252px;">Taylor-Wharton</td>
			<td style="width:123px;">35HCB-11M</td>
			<td>Cryopreservation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:354px;">Automated Cell counter</td>
			<td style="width:252px;">BIO-RAD</td>
			<td style="width:123px;">TC20</td>
			<td>Counting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:354px;">Bactopeptone</td>
			<td style="width:252px;">BD BioSciences</td>
			<td style="width:123px;">211677</td>
			<td>Medium additions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:354px;">Counting Slides</td>
			<td style="width:252px;">BIO-RAD</td>
			<td style="width:123px;">145-0011</td>
			<td>Counting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:354px;">Cryovial 1 mL</td>
			<td style="width:252px;">Greiner&#160;</td>
			<td align="right" style="width:123px;">123263</td>
			<td>Cryopreservation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:354px;">DMSO</td>
			<td style="width:252px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">D5879</td>
			<td>Cryopreservation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:354px;">Freezing Box</td>
			<td style="width:252px;">Nalgene</td>
			<td style="width:123px;">5029-0909</td>
			<td>Cryopreservation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:354px;">Freezing Container</td>
			<td style="width:252px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">15-350-50</td>
			<td>Cryopreservation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:354px;">Hematocytometer</td>
			<td style="width:252px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">#0267110</td>
			<td>Counting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:354px;">Human Insulin</td>
			<td style="width:252px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:123px;">I9278</td>
			<td>Medium additions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:354px;">Hyclone CCM3 media</td>
			<td style="width:252px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:123px;">SH30061.03</td>
			<td>Medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:354px;">Hyclone Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:252px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:123px;">SH30070.03</td>
			<td>Medium additions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Glutamic acid potassium salt monohydrate</td>
			<td style="width:252px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:123px;">G1149</td>
			<td>Medium additions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:354px;">L-Glutathione reduced</td>
			<td style="width:252px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:123px;">G6013</td>
			<td>Medium additions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:354px;">Potassium Bicarbonate</td>
			<td style="width:252px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:123px;">237205</td>
			<td>Medium additions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:354px;">Select Yeast Extract&#160;</td>
			<td style="width:252px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:123px;">Y1000</td>
			<td>Medium additions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:354px;">Shields and Sang&#39;s M3 Insect medium</td>
			<td style="width:252px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:123px;">S8398</td>
			<td>Medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:354px;">Trpsin-EDTA (0.05 %), phenol red&#160;</td>
			<td style="width:252px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">25300054</td>
			<td>Subculturing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:354px;">Trypan Blue (0.4%)</td>
			<td style="width:252px;">BIO-RAD</td>
			<td style="width:123px;">145-0013</td>
			<td>Counting</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

thawing, culturing, and cryopreserving drosophila cell lines

Sitemizde şuan Drosophila genomik Kaynak Merkezi (DGRC) tarafından dağıtılan 160 ayrı Drosophila hücre hatları üzerinden. Genom Mühendisliği ile roman hücre satır sayısını artırması bekleniyor. DGRC deneysel bir aracı olarak tamamlayan ve onların araştırma gündemi sürücü Drosophila hücre hatları kullanarak araştırmacılar tanıtmak amaçlanmaktadır. Çözdürme, kültür ve hücre hatları cryopreserving için protokol de dahil olmak üzere Drosophila hücre hatları farklı özelliklere sahip çeşitli ile çalışmaya yönelik yordamlar verilmektedir. Önemlisi, bu yayın contaminations adventif mikroorganizmalar veya diğer hücre hatları riskini en aza indirmek için Drosophila hücre hatları ile çalışması gereken en iyi yöntemleri gösterir. Bu yordamları ile aşina olmak araştırmacılar kültürlü Drosophila hücrelerin biyokimya, hücre biyolojisi ve fonksiyonel genomik gibi kullanan birçok uygulamalar delve edebilecektir.

Donmuş Drosophila hücreleri hızla çözülme ve onları kültür geri büyüme aşamasında içine getiriyor bir hücre yoğunluğu, kültür önemlidir. Dondurma ve çözme için yordamlar yapıştırılır vardır T-25 şişeye hücre yoğunluğu en az 4 x 106 hücre/mL eşit. 1-2 saat sonra çözülme, çoğu Drosophila hücre hatları büyüyen yüzeye eklemek başlar. Hangi hücrelerin çoğu büyüyen yüzeyde çözdürme sonra iki saat içinde ekli değil durum altında bu gecede medya değiştirmeden önce hücreleri kuluçkaya önerilir.
Subculturing amacı büyüme eğrisi sağlıklı üssel günlük-faz hücrelerinde muhafaza etmektir. Subculturing ölçütlerini microorganismal kirlenme, hücre yoğunluğu ve düzenli bakım zamanlamayı gerek görünür olmaması bağlıdır. İlk hücrelerin sağlığını değerlendirmek ve donma önce adventif kirletici yokluğu belirlemek önemlidir. Çoğu bakteri ve mantar kirletici maddeler sadece görsel denetimler tarafından tespit etmek kolaydır. Kirlenmiş kültürleri medya bulanıklık içinde artış tarafından tespit edilebilir. Mikroskop altında kirletici bakteriyel çubuklar, cocci, Maya hücreleri veya dize gibi mantar hif tomurcuklanma görünebilir. Diğer kaynakları kirlenme cytopathic sigara Mikoplazma gibi görsel olarak tespit edilemez ve rutin deneyleri PCR tabanlı21tarafından test edilecek.
Bir hücre kültürünü izdiham görsel olarak belirlenebilir (şekil 1). Hızlı büyüyen hücre hatları kesiştiği yerde erken ulaşmak ve düzenli olarak pasajlı gerekir. Bu satırları haftada iki gün kadar subcultured. Buna ek olarak, yavaş büyüyen hücreler pasajlı en az bir kez her iki hafta veya daha uzun. Ancak, hücreleri taze medya her hafta beslenmeleri gerekir. Medya tükenme önlemek için ve hücreler metabolik atık ürünleri sulandırmak için bu. Hücre hatları kaynakları onların morfolojisi içinde (Resim 2), bağlılık özellikleri, ortam gereksinimleri (Tablo 1) farklı doku değişen ve zaman (Tablo 2) iki katına türetilmiştir. Tablo 5, Tablo 6, Tablo 7ve Tablo 8 çeşitli Drosophila hücre kültür medya tariflerini listelenmektedir.
Hücre sayımı doğru bir tohumlama yoğunluk ve subculturing için öngörülebilir bir yordam sağlar. Nicel deneyler için Hücre sayımı esastır. Hücreleri bir hemasitometre (3A rakam) veya bir otomatik parçacık sayacı (3B rakam) kullanarak dikkate alınır. Bir otomatik sayaç kullanıyorsanız, üreticinin yönergeleri izleyin. Hücreleri elle sayım bir hemasitometre ekonomik ve kolay kullanmaktır. Orta Neubauer Kılavuzlar içinde kapalı hücre sayısı dikkate alınır ve hücre yoğunluğu hesaplanır; Örneğin, n = 106 hücre/mL (şekil 3D) x 2,14 hücre yoğunluğu sonuçlanan 214 hücre.
Hücre süspansiyon iki 100 mm tabak, 4 x 106 hücre/mL, hücre süspansiyon içeren her 10 mL üzerinden toplanan ve 4 x 107 hücre/mL yoğunluğu elde etmek için medya buz gibi 2 mL içinde resuspended. Hücre süspansiyon 0.5 mL ile dondurulmuş her cryovial 2 x 107 hücreler içeriyor. Bu bir kültür 4 x 106 hücre/mL 1 kısmı protokole göre çözdürülen zaman ile sonuçlanır.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59459/59459fig1.jpg"> Resim 1 : Üç farklı temsilcisi görüntüleri Drosophila hücre hatları farklı izdiham ve hücre yoğunlukları. (A)S2-DGRC 1 x 106 hücre/mL kültür. (A') 4.5 x 106 hücre/mL, S2-DGRC kültür. (B) ML-BG2-c2 2 x 106 hücre/mL kültür. (B') 8 x 106 hücre/mL hangi hücreleri kazık ve foci toplayarak ML-BG2-c2 kültür. 1 x 106 hücre/mL, (C) OSS kültür. (C') 4 x 106 hücre/mL, OSS kültür. Süspansiyon hücrelerde aynı odak düzlemi üzerinde yakalanan değil. Ölçek çubuğu 100 µm. = <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59459/59459fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a> 
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59459/59459fig2.jpg"> Resim 2 : Sekiz ayrı Drosophila hücre hatları temsilcisi görüntüler. (A)yuvarlak embriyo elde edilen S2-DGRC. (B) yuvarlak embriyo elde edilen Kc167. (C) yuvarlak larva CNS kaynaklı ML-BG2-c2. (D) yuvarlak larva ML-BG3-c2 seklinde. (E) CME L1, larva bacak Imaginal disklerinden türetilmiş bir hücre kültürünü daha küçük ve yuvarlak/fusiform morfolojisi vardır. (F) OSS, Yetişkin yumurtalık türetilmiş bir hücre kültürünü Morfoloji seklinde görüntüler. (G) RasV12 seklinde hücre kültürünü ifade Ras aktif. (H) RasV12; wtsRNAi (WRR1), etkin Ras ve çift iplikçikli RNA Tümör baskılayıcı siğiller (wts), hedefleme ifade bir hücre kültürünü epitel özellikleri görüntüler. Ölçek çubuğu 50 µm. = <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59459/59459fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59459/59459fig3.jpg"> Şekil 3 : Hücre yoğunluğu bir hemasitometre kullanarak el ile veya otomatik olarak bir otomatik parçacık sayaç kullanarak sayılır. (A) A hemasitometre iki odaları ile. (B) bir hücre sayısı çıktısını görüntüleme bir otomatik hücre sayaç. (C) geliştirilmiş Neubauer hücre kılavuz sayım 10 x amaç altında görüntülendi. 0,1 mm3 Merkez kılavuz (kırmızı kesik çizgili kare) tarafından bağlı hücreleri saymak. (D) hücre sayımı için merkezi ağ hemasitometre'dolu. Ölçek çubuğu = 1 mm (C); 0.2 mm (D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59459/59459fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59459/59459fig4.jpg"> Şekil 4 : Dondurma donatımı. (A) A dondurma konteyner mağazaları ampul dik bir pozisyonda yavaş dondurma için. (B) A metal baston donmuş ampul tutmak için. (C) A teneke kutu köpekler tutmak için. (D) A plastik dondurma kutusu (cryobox). (E) A kutu birden çok köpekler bir sıvı N2 depolama tankı eklenen tutarak. (F) sıvı N2 depolama tankı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59459/59459fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Hücre zorlanma</td>
			<td>Medya</td>
			<td>Bağlılık</td>
			<td>Tripsin</td>
		</tr>
<tr>
<td>Schneider satırları</td>
			<td rowspan="2">M3 + BPYE + %10 fetal buzağı serum (FCS), pH 6,6</td>
			<td rowspan="3">Yarı yapışık</td>
			<td rowspan="3">Hayır</td>
		</tr>
<tr>
<td>(S2R +, S2-DRSC, S2-DGRC, Sg4) 11
</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Schneider'ın medya+ + % 10 FCS</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">KC hatları (Kc167, Kc7E10)21,22
</td>
			<td>M3 + BPYE + % 5 FCS, pH 6,6</td>
			<td rowspan="2">Yarı yapışık</td>
			<td rowspan="2">Hayır</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hyclone-CCM3, pH 6.2</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">Imaginal disk ve CNS çizgiler (ML-çizgiler)13,14
</td>
			<td>M3 + BPYE + % 10 FCS, pH 6,6</td>
			<td rowspan="3">Yarı yapışık</td>
			<td rowspan="3">Hayır</td>
		</tr>
<tr>
<td>10 µg/mL insülin</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">Milner Imaginal disk (CME-satır)15 hatları
</td>
			<td>M3 + % 2 FCS</td>
			<td rowspan="4">Yarı yapışık</td>
			<td rowspan="4">Hayır</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 µg/mL insülin</td>
		</tr>
<tr>
<td>% 2.5 sinek özü</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="6">fGS/OSS16
</td>
			<td>M3 + % 10 FCS, pH 6.8</td>
			<td rowspan="6">Yapışık</td>
			<td rowspan="6">*</td>
		</tr>
<tr>
<td>10 µg/mL insülin</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 mg/mL C5H8KNO4  </td>
		</tr>
<tr>
<td>0,5 mg/mL KHCO3 </td>
		</tr>
<tr>
<td>0.6 mg/mL glutatyon</td>
		</tr>
<tr>
<td>% 10 sinek özü</td>
		</tr>
<tr>
<td>RASV12 hatları18
</td>
			<td>M3 + BPYE + % 10 FCS, pH 6,6</td>
			<td>Yapışık</td>
			<td>Evet</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1: Çeşitli özellikleri ve ortam şartları Drosophila hücre hatları. Yarı yapisan Schneider satırlarının S2R + S2-Drosophila RNAi eleme Merkezi (DRSC), S2-Drosophila genomik Kaynak Merkezi (DGRC) ve Sg4 de dahil olmak üzere farklı yalıtır sağlam ne zaman M3 medyada kültürlü çoğalırlar sık kullanılan hücre satır olduğunu + Bactopetone Maya özü (BPYE) % 10 fetal buzağı serum (FCS) ile desteklenmiştir. Alternatif olarak, Schneider'ın medya (pH 6.7-6.8) genellikle M3 + BPYE yerine kullanılır. Kc satırları çoğalırlar M3 + BPYE (%5 FCS) veya serum-Alerjik CCM3 medya. ML Imaginal disk ve merkezi sinir sistemi (MSS) satırları insülin takviyesi yayılması için gerektirir. Milner Imaginal disk çizgiler takviyesi insülin ve sinek ayıklamak gerektirir. Yapisan fGS/OSS hücre hatları büyümesi için insülin, sinek özü gibi glutatyon daha yüksek bir konsantrasyon gerektirir. Yapisan RasV12 satırları büyümek de M3 + BPYE (% 10 FCS). Tripsin yapisan hücre hatları büyüme yüzeyinden çıkarmak için kullanılır.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Hücre satırı (stok #)</td>
			<td>Genotip</td>
			<td>Saat (h) iki katına *</td>
			<td>Doku kaynağı</td>
		</tr>
<tr>
<td>S2R + (150)</td>
			<td>Örer</td>
			<td>39</td>
			<td>Geç embriyolar</td>
		</tr>
<tr>
<td>S2-DGRC (6)</td>
			<td>Örer</td>
			<td>23</td>
			<td>Geç embriyolar</td>
		</tr>
<tr>
<td>S2-DRSC (181)</td>
			<td>Örer</td>
			<td>46</td>
			<td>Geç embriyolar</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kc167 (1)</td>
			<td>e/se</td>
			<td>22</td>
			<td>6−12 s embriyolar</td>
		</tr>
<tr>
<td>ML-BG2-c2 (53)</td>
			<td>y v f mal</td>
			<td>48</td>
			<td>3rd INSTAR larva CNS</td>
		</tr>
<tr>
<td>ML-BG3-c2 (68)</td>
			<td>y v f mal</td>
			<td>104</td>
			<td>3rd INSTAR larva CNS</td>
		</tr>
<tr>
<td>ML-DmD8 (92)</td>
			<td>y v f mal</td>
			<td>66</td>
			<td>3rd INSTAR larva kanat disk</td>
		</tr>
<tr>
<td>CME W1 Cl.8+ (151)</td>
			<td>Örer</td>
			<td>46</td>
			<td>3rd INSTAR larva kanat disk</td>
		</tr>
<tr>
<td>CME L1 (156)</td>
			<td>Örer</td>
			<td>47</td>
			<td>3rd INSTAR larva bacak disk</td>
		</tr>
<tr>
<td>OSS (190)</td>
			<td>bamD86</td>
			<td>45</td>
			<td>Yetişkin bam mutant yumurtalık</td>
		</tr>
<tr>
<td>RASV12 satırları</td>
			<td>UAS-GFP; P(UAS-Ras85D.v12) / P (Act5C-GAL4) 17bFO1</td>
			<td>41−65</td>
			<td>Embriyo</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 2: Genotip, zaman ve doku kaynakları yaygın olarak iki katına kullanılan Drosophila hücre hatları. Doku genotip, kaynak ve yaygın olarak kullanılan hücre satırları saati değerini iki katına nüfus sunulmaktadır. 25 ° C'de önerilen medya büyüme zaman iki katına temel
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Kültür gemi</td>
			<td>Medya (mL) hacmi</td>
		</tr>
<tr>
<td>12,5 cm2 T-flask</td>
			<td>2.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>25 cm2 T-flask</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>75 cm2 T-flask</td>
			<td>15</td>
		</tr>
<tr>
<td>35 mm plaka</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>60 mm plaka</td>
			<td>4</td>
		</tr>
<tr>
<td>100 mm plaka</td>
			<td>10</td>
		</tr>
<tr>
<td>384-şey plaka *</td>
			<td>0,04/iyi</td>
		</tr>
<tr>
<td>96-şey plaka *</td>
			<td>0,1/iyi</td>
		</tr>
<tr>
<td>48-şey plaka *</td>
			<td>0.3/iyi</td>
		</tr>
<tr>
<td>24-şey plaka *</td>
			<td>0,5/iyi</td>
		</tr>
<tr>
<td>12-şey plaka</td>
			<td>1.0/iyi</td>
		</tr>
<tr>
<td>6-şey plaka</td>
			<td>2.0/iyi</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 3: Kültür gemiler ve önerilen ortam birimleri. Kültür damarları irili ufaklı Drosophila hücre kültürü çalışmalarının için kullanılabilir. Uygun ortam birimleri (mL) her araç için tavsiye edilir. Hücre süspansiyon ile parafin film medya kaybı buharlaşma nedeniyle azaltmak için daha az 0.5 mL içeren çok iyi plakalarının.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>Birim</td>
		</tr>
<tr>
<td>M3 + BPYE, pH 6,6</td>
			<td>70 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Isı FCS inaktive</td>
			<td>20 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Steril süzülmüş DMSO *</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 4: 100 mL (M3 + BPYE, % 20 FCS, % 10 DMSO) dondurma ortamının hazırlanması için reçete. Gerektiği gibi dondurma ortam hazırlamak ve uzun süre DMSO içeren dondurucu ortamları saklama kaçının.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>M3 + BPYE orta</td>
			<td>Tutar</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kalkanlar ve seslendirdi'nın M323
</td>
			<td>1 şişe</td>
		</tr>
<tr>
<td>KHCO3
</td>
			<td>0,5 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>Seçme Maya ekstresi</td>
			<td>1.0 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>Bactopeptone</td>
			<td>2.5 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>Steril arıtılmış su</td>
			<td>1000 mL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 5: 1 L M3 + BPYE hazırlanması için reçete doku kültürü orta. PH 6,6 için ayarlayın. Orta 0,22 µm filtreden geçirilerek sterilize.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>FGS/OSS hücre satırı için temel M3 orta</td>
			<td>Tutar</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kalkanlar ve M3 şarkı söyledi</td>
			<td>1 şişe</td>
		</tr>
<tr>
<td>KHCO3
</td>
			<td>0,5 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>C5H8KNO4  </td>
			<td>1.0 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>Steril arıtılmış su</td>
			<td>1000 mL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 6: 1 L fGS/OSS M3 temel orta tarifini. PH 6.8 için ayarlayın. Orta 0,22 µm filtreden geçirilerek sterilize.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Hyclone-CCM3</td>
			<td>Tutar</td>
		</tr>
<tr>
<td>CCM3 toz</td>
			<td>28,6 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaHCO3
</td>
			<td>0.35 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>10 N NaOH</td>
			<td>2.5 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>CaCl2
</td>
			<td>0,5 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>Steril arıtılmış su</td>
			<td>1000 mL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 7: Hyclone-CCM3 doku kültürü orta 1 L tarifini. PH 6.2 için ayarlayın. Orta 0,22 µm filtreden geçirilerek sterilize.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>M3 + BPYE + % 10 FCS</td>
			<td>Miyake disk ve CNS hatları orta</td>
			<td>Milner disk hatları orta</td>
			<td>fGS/OSS tam orta</td>
		</tr>
<tr>
<td>M3 + BPYE, pH 6,6</td>
			<td>90 mL</td>
			<td>90 mL</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>Isı FCS * inaktive</td>
			<td>10 mL</td>
			<td>10 mL</td>
			<td>2 mL</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>İnsülin (10 mg/mL)</td>
			<td>-</td>
			<td>100 ΜL</td>
			<td>50 ΜL</td>
			<td>100 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sinek özü</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>2.5 mL</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Glutatyon (60 mg/mL)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>M3, pH 6,6</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>97,5 mL</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>fGS/OSS M3, pH 6.8</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
			<td>79 mL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 8: Çeşitli ortak 100 mL hazırlanması için reçete Drosophila hücre kültür medya. 56 ° c için 1 h FCS kuluçkaya ve Kompleman proteinleri ısı devre dışı için beş dakikada sallayın.

Watch this Scientific Journal Video about Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines at JoVE.com

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Drosophila hücre hatları temel ve Biyomedikal Araştırma önemli Kimyasalları vardır. Bu makalede çözdürme, subculturing ve araştırmacılar araştırma bu Kimyasalları kullanımı birleşmeyle yardımcı olmak için yaygın olarak kullanılan Drosophila hücre satırları dondurma protokolleri sağlar.

Çözdürme, kültür ve Drosophila hücre hatları Cryopreserving

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...

Bu protokoller herhangi bir araştırmacı sürücü veya araştırma gündemini tamamlamak için Drosophila hücre hatlarının kullanımını dahil yardımcı olacaktır. Çoğu değilse tüm Drosophila hücre kültürleri canlandırmak, çoğalır, ve kriyo-korumak iyi zaman bu kurallara göre ele. %70 etanollü bir laminar akış kaputunun çalışma yüzeyini sildikten sonra, uygun ortamın beş mililitresini 25 santimetre karelik bir T-şişesine dağıtın.Dondurulmuş hücre hattının kabını %70 etanol ile silin ve kapağı dikkatlice gevşetin ve kapatını açın. Pasteur pipeti kullanarak, bir mililitre oda sıcaklığındaki orta aracı şişeden kriyo-şişeye aktarın ve donmuş hücreleri eritmek için hafifçe karıştırın. Hücre süspansiyonunun taşmayamadığını göz önünde bulundurarak, çözülmüş hücre süspansiyonunun tüm hacmini şişeye aktarın ve kriyo-şişeyi taze orta maddeyle durulayın.Hücrelerin 25 derecelik bir kuluçka makinesinde en az iki saat boyunca şişenin dibine yerleşmesine izin verin. Uzun bir süre için eksi 80 santigrat derece dondurucuya geri seyahat için paketlenmiş dondurulmuş hücreleri iade etmeyin. Bunun yerine hücreleri en kısa sürede eritin.Hafif bir mikroskop altında eki doğruladıktan sonra, şişeyi kuvöze geri vermeden önce süpernatantı beş mililitre taze orta ile nazikçe değiştirin. Alternatif olarak, çözüldükten sonra, santrifüj için 15 mililitrelik konik bir tüp içine hücre süspansiyon aktarın ve taze orta beş mililitre pelet yeniden askıya bir T-25 şişesi içine tohumlama önce sadece gösterildiği gibi. Hücrelerin geçişe hazır olup olmadığını belirlemek için, mikroskop altında kültürün morfolojisini ve birleşimini inceleyin.Hücre yoğunluğu ve iki katına çıkarma süresi göz önüne alındığında, hücreler en son ne zaman alt kültüre alındı ve kültürde mikroorganizmakontaminasyonu belirtileri vardı. Kültür son derece etkili görünüyorsa, kültür tabakasıaltından hücreleri yavaşça çıkarmak ve ortaya çıkan tek hücre süspansiyonu canlı hücrelerin sayısını sayarak hücre yoğunluğunu belirlemek için kültür supernatant on mililitre kullanın. Hücre yoğunluğu uygun ortamda mililitre başına altıncı hücrelere beş ila on kat arasında ise alt kültür hücreleri.İstenilen tohumlama hücre yoğunluğunu elde etmek için yeni bir kültür plakamililitre konsantrasyonu başına altıncı hücrelere en az bir kez on ekleyin. Daha sonra plakaları operatör baş harfleri, tarih, bölme oranı, tohumlama hücre yoğunluğu, hücre hattı tanımlayıcısı, orta, geçiş numarası ve antibiyotikler gibi tüm orta eklemelerle kaplayın ve plakaları 25 derece lik inkübatörde kuluçkaya yatsın lar için plastik konteyneriçine yerleştirin. Yapışık hücreleri çıkarmak için 100 milimetrelik bir kültür çanak alt formu, ilk steril bir şişe içine supernatant tüm transfer ve 0.05% tripsin EDTA bir mililitre yavaş bir ek ile hücreleri durulayın.Trypsin çözeltisinin çözeltiyi atmadan önce tüm büyüme yüzeyini kapladığından emin olmak için yavaşça girdap. Daha sonra, yavaşça plakaya taze 0.05% tripsin EDTA bir ila iki mililitre ekleyin ve üç ila on dakika boyunca 25 derece santigrat santigrat kantimetre plaka yerleştirin. Hücre tabakasının büyüyen yüzeyden ayrılması ve kayması gözlemlendiğinde, kaydedilen süpernatantın dokuz mililitre eklenmesiyle tripsin aktivitesini durdurun ve hücre kümelerini ayırmak için hücre süspansiyonunu iyice karıştırın.Tüm hücreler yerinden edildiğinde, büyüyen yüzey temiz olacaktır. Neubauer hücre sayma slaytını kullanarak hücreleri elle saymak için, önce hemositometre slaytının yüzeyini silin ve %70 alkolle kapağını kapatın. Karıştırma sonra, her iki odacık doldurmak için hemocytometer her oluklü kenarına hücrelerin 15 mikrolitre ekleyin.Hücre süspansiyonu kılcal eylem le sayım odasına çekilecek. 10x mikroskop hedefi kullanarak, paralel çizgilerle bağlı ızgaranın ortasındaki bir milimetre karelik alan içinde 100 ila 200 hücre yi sayın. Daha sonra ikinci oda ile numaralandırma tekrarlayın ve formüle göre hücre yoğunluğunu belirlemek için iki sayma ortalamasını kullanın.Drosophila hücre hattı kriyo-koruma için, mililitre başına yedinci hücrelere en az dört kat on son hücre yoğunluğu neden olacak dondurucu ortam hacmi nde hücre pelet yeniden askıya. Son DMSO konsantrasyonu% 10 ve yavaşça hücre süspansiyon karışımı gibi akıllıca hücre süspansiyon damla içine, kriyo koruyucu, dimetil sülfoksit veya DMSO uygun bir hacim ekleyin. Daha sonra, önceden etiketlenmiş kriyo-şişeler içine hücre süspansiyon0.5 mililitre aliquots ekleyin ve dondurucu bir kap içine dondurucu şişeler yerleştirin isopropanol dolu.Daha sonra dondurucu kabı gece boyunca eksi 80 derecelik bir dondurucuya aktarArak dondurucuşişelerinin sıcaklığının dondurucu sıcaklığına yavaşça düşmesini bekleyin. Sonra, hızlı bir sıvı nitrojen teneke kutu içine yerleştirmek için kutulara kriyo-şişeleri transfer. Alternatif olarak, dondurulmuş kriyo-şişeleri önceden soğutulmuş bir dondurma kutusuna aktarın ve dondurulmuş kriyo-şişeleri azot dondurucunun sıvı fazında saklayın.Bir hücre hattının birleşimi ışık mikroskobu ile belirlenebilir. Erken bir araya gelen hızlı büyüyen hücre hatlarının düzenli olarak haftada iki kez geçirilmesi gerekir. Buna karşılık, yavaş büyüyen hücreler en az bir kez her iki haftada bir veya daha uzun geçit edilebilir, Bu hücrelerin her hafta taze orta beslenmesi gerekir rağmen.Değişen doku kaynaklarından elde edilen hücre hatları morfolojisi, yapışma özellikleri, ortam gereksinimleri ve katlama süreleri açısından farklılık gösterir. Nicel deneyler için hücre sayma esastır. Hücreler hemositometre veya otomatik parçacık sayacı kullanılarak sayılabilir.Hücre birleşimi, deneyimli işleç için alt kültüre ne zaman girilen görsel bir kılavuzdur. Ancak, hücre sayma öngörülebilir bir subculturing programı yol açar ve büyüme anomalilerinin tespitini kolaylaştırır. Sıvı nitrojen le çalışırken dikkatli olun ve uygun koruyucu donanımı kullanın.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

Ve tahlil Kan Hücresi popülasyonlar<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Larva

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila ...

Establishment of Genome-edited Human Pluripotent Stem Cell Lines: From Targeting to Isolation

Genom düzenlenmiş İnsan Pluripotent Kök Hücre Hatları oluşturulması: İzolasyon hedefleyen Gönderen

Genome-editing of human pluripotent stem cells (hPSCs) provides a genetically controlled and clinically relevant platform from which to understand human ...

Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research

Temel ve Klinik öncesi Araştırma bir Kapalı Hücre Kültürü Sistemi İnsan Pluripotent ve Sinir Kök Hücre Kültürleme

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety ...

Imaging of Cell Shape Alteration and Cell Movement in Drosophila Gastrulation Using DE-cadherin Reporter Transgenic Flies

Imaging of Cell Shape Alteration and Cell Movement in Drosophila Gastrulation Using DE-cadherin Reporter Transgenic Flies

Hücre Şekli Alteration ve Hücre Hareketi Görüntüleme<em&gt; Drosophila</em&gt; Gastrulasyon kullanarak DE-kaderin Muhabir Transgenik Sinekler

Gastrulation is the first set of morphologically dynamic events that occur during the embryonic development of multicellular animals such as Drosophila. ...

Derivation of Stem Cell Lines from Mouse Preimplantation Embryos

Fare Preimplantasyon embriyo kök hücre satırlarından türetme

Mouse embryonic stem cell (mESC) derivation is the process by which pluripotent cell lines are established from preimplantation embryos. These lines ...

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Diseksiyon ve Drosophila pupa yumurtalık boyama

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a ...

An Efficient Strategy for Generating Tissue-specific Binary Transcription Systems in Drosophila by Genome Editing

An Efficient Strategy for Generating Tissue-specific Binary Transcription Systems in Drosophila by Genome Editing

Genom düzenleyerek Drosophila içinde doku özel ikili transkripsiyon sistemleri oluşturmak için etkili bir strateji

Binary transcription systems are powerful genetic tools widely used for visualizing and manipulating cell fate and gene expression in specific groups of ...

In Vitro Assays to Evaluate the Migration, Invasion, and Proliferation of Immortalized Human First-trimester Trophoblast Cell Lines

Vitro deneyleri içinde geçiş, işgal ve ölümsüzleştirdi insan birinci üç aylık dönem Trofoblast hücre hatları yaygın değerlendirmek için

Cell movement is a critical property of trophoblasts during placental development and early pregnancy. The significance of proper trophoblast migration ...

Culturing and Measuring Fetal and Newborn Murine Long Bones

Kültür ve ölçme fetal ve yenidoğan Murine uzun kemikler

Long bones are complex and dynamic structures, which arise from endochondral ossification via a cartilage intermediate. The limited access to healthy ...

Cell-cell Fusion of Genome Edited Cell Lines for Perturbation of Cellular Structure and Function

Hücresel Yapı ve Fonksiyonun Perturbasyonu için Genom Düzenlenmiş Hücre Hatları hücre-hücre Füzyon

Life is spatially partitioned within lipid membranes to allow the isolated formation of distinct molecular states inside cells and organelles. Cell fusion ...