Name: analysis of combinatorial mirna treatments to regulate cell cycle and angiogenesis
Uploaded: 2019-03-30T14:00:00
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1. transfection miR-143 et miR-506
Attention : Utilisez des gants en latex, lunettes de protection et un manteau de laboratoire tout en exécutant les expériences décrites. Au besoin, utiliser l’armoire de sécurité biologique avec le ventilateur d’armoire, sans bloquer les voies respiratoires ou de perturber le flux d’air laminaire. Toujours défini la vitre protectrice à la hauteur appropriée, telle que décrite par le fabricant.
<ol><li>Cellules A549 NSCLC graines dans une ass...

<ol>
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miARN peut fonctionner comme des thérapies ciblées pour le traitement du cancer, reconnaissant le dérèglement des niveaux d’expression dans malades vs les tissus normaux. Cette étude visait à déterminer les miARN qui potentiellement stopper la progression du cycle cellulaire au cours de plusieurs étapes. Il a été identifié que miR-143 et miR-506 de faire cesser le cycle cellulaire des cellules cancéreuses et les protocoles présentés visant à comprendre l’activité de ce traitement combinatoire miRNA.</...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/video/59460/analysis-combinatorial-mirna-treatments-to-regulate-cell-cycle">Analysis of Combinatorial miRNA Treatments to Regulate Cell Cycle and Angiogenesis</a>.&#160; An author name was updated.
One of the authors&#39; names was corrected from:
George Matthaiolampakis
to:
George Mattheolabakis

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/59460/analysis-combinatorial-mirna-treatments-to-regulate-cell-cycle">Analysis of Combinatorial miRNA Treatments to Regulate Cell Cycle and Angiogenesis</a>.&#160; An author name was updated.

Erratum: Analysis of Combinatorial miRNA Treatments to Regulate Cell Cycle and Angiogenesis

Le cycle cellulaire est une combinaison de plusieurs événements réglementaires qui autorise la duplication de l’ADN et cellules de prolifération à travers le processus mitotique1. Kinases cycline-dépendantes (CDKs) réglementent et promouvoir le cycle cellulaire2. Parmi eux, le CDK mitotique (CDK1) et interphase cdk2 (CDK2, CDK4 et CDK6) ont un rôle essentiel dans le cycle cellulaire progression3. Protéine du rétinoblastome (Rb) est phosphorylé par la CDK4/CDK6 complexe pour permettre la progression de cycle cellulaire4et CDK1 activation est essentielle pour la division cellulaire avec succès5. Plusieurs inhibiteurs de CDK ont été développés et évalués dans des essais cliniques au cours des dernières décennies, indiquant le potentiel du ciblage cdk2 dans le traitement du cancer. En fait, trois inhibiteurs de CDK ont été approuvés pour le traitement du cancer du sein récemment6,7,8,9,10. Ainsi, cdk2, et en particulier, la CDK1 et CDK4/6, sont d’un grand intérêt dans la régulation de la progression du cancer cell.
miARN (miRs) est petites, non codantes RNAs et régulateurs post-transcriptionnelle de l’expression des gènes, régulation environ 30 % de tous les gènes humains11. Leur activité est basée sur la répression traductionnelle ou dégradation des ARN messagers (ARNm)12. Illustrant leur signification biologique, plus de 5 000 miARN ont été identifiées et une molécule de miRNA seul peut régler plusieurs gènes11,13. Plus important encore, miRNA expression a été associée à différentes maladies et les statuts de la maladie, y compris le cancer13. En fait, les miARN ont été caractérisées comme oncogènes ou suppresseurs de tumeur, ayant la capacité à promouvoir ou à supprimer la tumeur développement et la progression de14,15. L’expression relative des miARN dans les tissus malades peut réguler la progression de la maladie ; ainsi, la tradition exogène des miARN a potentiel thérapeutique.
Cancer du poumon est la principale cause de décès liés au cancer et plus grande que 60 % de tous les cancers du poumon non à petites cellules16,les cancers du poumon17, avec un taux de survie à 5 ans inférieur à 20 %18. L’utilisation de miR-143-3 p et p miR-506-3 a été récemment évaluée afin de cibler les cycles cellulaires de cellules du cancer du poumon11. miR-143 et miR-506 ont des séquences qui sont complémentarité CDK1 et CDK4/CDK6, et les effets de ces deux miRs sur cellules A549 ont été analysés. Les détails expérimentaux sont présentés et discutés dans cet article. L’expression des gènes, la progression du cycle cellulaire et l’apoptose ont été évalués à l’aide de différents protocoles expérimentaux et h après transfection. Nous avons utilisé des méthodes PCR (RT-qPCR) quantitatives en temps réel ainsi que l’analyse de microarray de mesurer l’expression de gènes spécifiques et séquençage de RNA de prochaine génération a servi à déterminer le gène global dysrégulation11. Cette dernière méthode identifie l’abondance relative de transcription de chaque gène avec la sensibilité élevée et de la reproductibilité, tandis que des milliers de gènes peuvent être analysés d’une seule analyse expérimentale. En outre, apoptotic analyse suite à un traitement miRNA a été réalisée et est décrite ici. Bio-informatique complété l’analyse de la voie. Présentées ici sont protocoles utilisés pour l’analyse de la thérapeutique potentielle de la combinatoire miR-143 et miR-506.
L’objectif principal du présent protocole est d’identifier les effets des miARN dans les cellules, en mettant l’accent sur le cycle cellulaire. La variété des techniques présentées ici qui s’étend de l’analyse de l’expression génique prétraduction (à l’aide de qPCR) chargé d’élaborer et de nouvelles techniques d’analyse de gène au niveau des protéines, telles que l’analyse microarray. Il est à espérer que ce rapport est utile pour les chercheurs intéressés à travailler avec les miARN. Par ailleurs, la méthodologie d’analyse en cytométrie en flux du cycle cellulaire et l’apoptose des cellules est présenté.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:2067px;" width="2066">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">-80 &#176;C Freezer</td>
			<td style="width:210px;">VWR</td>
			<td style="width:1167px;">VWR40086A</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">96 well plate</td>
			<td style="width:210px;">CELLTREAT Scientific&#160;</td>
			<td style="width:1167px;">50-607-511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">96-well Microwell Plates&#160;&#160;</td>
			<td style="width:210px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:1167px;">12-556-008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">A549 Non Small Cell Lung Cancer Cells</td>
			<td style="width:210px;">ATCC</td>
			<td style="width:1167px;">ATCC&#160;CCL-185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">Agarose</td>
			<td style="width:210px;">VWR</td>
			<td style="width:1167px;">0710-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">Agilent 2100 Bioanalyzer</td>
			<td style="width:210px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:1167px;">G2938c</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ambion Silencer Negative Control No. 1 siRNA</td>
			<td style="width:210px;">Ambion</td>
			<td>AM4611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">Antibiotic-Antimycotic Solution (100x)</td>
			<td style="width:210px;">Gibco</td>
			<td style="width:1167px;">15240-062&#160;&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">Antibody Array Assay Kit, 2 Reactions</td>
			<td style="width:210px;">Full Moon Bio</td>
			<td style="width:1167px;">KAS02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">Bright field microscope&#160;&#160;</td>
			<td style="width:210px;">Microscoptics&#160;</td>
			<td style="width:1167px;">IV-900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">Bright field microscope&#160;&#160;</td>
			<td style="width:210px;">New Star Environment LLC</td>
			<td style="width:1167px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">Cell Cycle Antibody Array, 2 Slides</td>
			<td style="width:210px;">Full Moon Bio</td>
			<td style="width:1167px;">ACC058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">Cell Logic+ Biosafety Cabinate</td>
			<td style="width:210px;">Labconco</td>
			<td style="width:1167px;">342391100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">Cellquest Pro</td>
			<td style="width:210px;">BD bioscience</td>
			<td style="width:1167px;">Steps 5.14; 6.13: Used for calculating the population distrubution according to the cell cycle&#160; phase and for&#160; calculating the population distribution for the analysis of apoptosis&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">CFX96 Real Time System</td>
			<td style="width:210px;">BioRad</td>
			<td style="width:1167px;">CFX96 Optics Module</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">Chemidoc Touch Imaging System</td>
			<td style="width:210px;">BioRad</td>
			<td style="width:1167px;">Chemidoc Touch Imaging System</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">CO2 Incubator</td>
			<td style="width:210px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:1167px;">HERAcell 150i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix</td>
			<td style="width:210px;">Trevigen</td>
			<td style="width:1167px;">3433-010-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">Digital Camera</td>
			<td style="width:210px;">AmScope&#160;</td>
			<td style="width:1167px;">FMA050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMEM 4.5 g/L Glucose, w/out Sodium Pyruvate, w/ L-Glutamine</td>
			<td style="width:210px;">VWR</td>
			<td>VWRL0100-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">DNAse I</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>E1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">Endothelial Cell Growth Supplement (ECGS)</td>
			<td style="width:210px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:1167px;">356006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">Eppendorf Pipette Pick-A-Pack Sets</td>
			<td style="width:210px;">Eppendrof</td>
			<td style="width:1167px;">05-403-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethanol, Absolute (200 Proof), Molecular Biology Grade,&#160;</td>
			<td style="width:210px;">Fisher BioReagents</td>
			<td>BP2818500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">Ethidium bromide</td>
			<td style="width:210px;">Alfa acar</td>
			<td style="width:1167px;">L07462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">F-12K Nutrient Mixture (Kaighn&#39;s Mod.) with L-glutamine, Corning</td>
			<td style="width:210px;">Corning</td>
			<td>45000-354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">FACS Calibur Flowcytometer</td>
			<td style="width:210px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:1167px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fetal Bovine Serum - Premium</td>
			<td>Antlanta Biologicals</td>
			<td>S11150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:210px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:1167px;">10438026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fisherbrand Basix Microcentrifuge Tubes with Standard Snap Caps</td>
			<td style="width:210px;">Fisherbrand Basix</td>
			<td style="width:1167px;">02-682-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">Forma Series II water Jacket CO2 incubator</td>
			<td style="width:210px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:1167px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">Heparin Solution (5000 U/mL)</td>
			<td style="width:210px;">Hospira</td>
			<td style="width:1167px;">NDC#63739-920-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">Horixontal Electrophoresis system</td>
			<td style="width:210px;">Benchtop lab system</td>
			<td style="width:1167px;">BT102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">hsa-miR-143-3p miRNA Mimic</td>
			<td style="width:210px;">ABM</td>
			<td>MCH01315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">hsa-miR-506-3p miRNA Mimic</td>
			<td style="width:210px;">ABM</td>
			<td>MCH02824</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">Human Recombinant Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF)</td>
			<td style="width:210px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:1167px;">PHC9394&#160;&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC)</td>
			<td style="width:210px;">Individual donors</td>
			<td style="width:1167px;">IRB# A15-3891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">HyClone Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td style="width:210px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:1167px;">SH30256FS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">Ingenuity Pathway Analysis</td>
			<td style="width:210px;">Qiagen</td>
			<td style="width:1167px;">Results: Used for bioinformatics pathway analysis</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Invitrogen UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water</td>
			<td style="width:210px;">Invitrogen</td>
			<td>10-977-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">Lipofectamine 2000&#160;</td>
			<td style="width:210px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:1167px;">11-668-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">Loading dye 10X</td>
			<td style="width:210px;">ward&#39;s science+</td>
			<td style="width:1167px;">470024-814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">Medium M199 (with Earle&#8242;s salts, L-glutamine and sodium bicarbonate)</td>
			<td style="width:210px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:1167px;">M4530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">Microscope Digital Camera</td>
			<td style="width:210px;">AmScope&#160;</td>
			<td style="width:1167px;">MU130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">Modfit LT</td>
			<td style="width:210px;">Verity Software</td>
			<td style="width:1167px;">Step 5.15: Alternative software for analysis of cell cycle population distributions</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">Nanodrop</td>
			<td style="width:210px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:1167px;">NanoDrop one C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Opti-MEM</td>
			<td style="width:210px;">Gibco by life technologies</td>
			<td>31985-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin-streptomycin 10/10</td>
			<td>Antlanta Biologicals</td>
			<td>B21210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Power UP sybr green master mix</td>
			<td style="width:210px;">Applied Biosystems</td>
			<td>A25780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Propidium Iodide</td>
			<td style="width:210px;">MP Biochemicals LLC</td>
			<td>IC19545825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">Proscanarray HT Microarray scanner</td>
			<td style="width:210px;">Perkin elmer</td>
			<td style="width:1167px;">ASCNPHRG. We used excitation laser wavelength at 543 nm.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">q PCR optical adhesive cover</td>
			<td style="width:210px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:1167px;">4360954</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">Quick-RNA Kits</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R1055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ribonuclease A from Bovine pancreas</td>
			<td style="width:210px;">Sigma</td>
			<td>R6513-50MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">ScanArray Express</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td style="width:1167px;">Step 7.33: Microarray analysis software</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">Shaker</td>
			<td style="width:210px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:1167px;">2314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">SimpliAmp Thermal Cycler</td>
			<td style="width:210px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:1167px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">SpectraTube Centrifuge Tubes 15ml</td>
			<td style="width:210px;">VWR</td>
			<td style="width:1167px;">470224-998</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">SpectraTube Centrifuge Tubes 50ml</td>
			<td style="width:210px;">VWR</td>
			<td style="width:1167px;">470225-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TBS Buffer, 20x liquid</td>
			<td style="width:210px;">VWR</td>
			<td>10791-796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">Temperature controlled&#160; centrifuge matchine</td>
			<td style="width:210px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:1167px;">ST16R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">Temperature controlled micro centrifuge matchine</td>
			<td style="width:210px;">Eppendrof</td>
			<td style="width:1167px;">5415R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Thermo Scientific BioLite Cell Culture Treated Flasks</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12-556-009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">Thermo Scientific Pierce BCA Protein Assay</td>
			<td style="width:210px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:1167px;">PI23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Thermo Scientific Pierce RIPA Buffer</td>
			<td style="width:210px;">Thermo Scientific</td>
			<td>PI89900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Thermo Scientific Thermo-Fast 96-Well Full-Skirted Plates</td>
			<td style="width:210px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:1167px;">AB0800WL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Thermo Scientific Verso cDNA synthesis Kit (100 runs)</td>
			<td style="width:210px;">Thermo Scientific</td>
			<td>AB1453B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">Ultra Low Range DNA Ladder</td>
			<td style="width:210px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:1167px;">10597012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">VWR standard solid door laboratory refrigerator</td>
			<td style="width:210px;">VWR</td>
			<td style="width:1167px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of combinatorial mirna treatments to regulate cell cycle and angiogenesis

Cancer du poumon (LC) est la principale cause de décès liés au cancer dans le monde entier. Semblable à d’autres cellules cancéreuses, une caractéristique fondamentale des cellules LC est non réglementée de la prolifération et la division cellulaire. Inhibition de la prolifération en stoppant la progression du cycle cellulaire s’est avérée être une approche prometteuse pour le traitement du cancer, y compris les LC.
miRNA therapeutics ont émergé en tant que régulateurs des gènes post-transcriptionnels important et sont de plus en plus étudiées pour une utilisation dans le traitement du cancer. Dans des travaux récents, nous avons utilisé deux miARN, miR-143 et miR-506, pour réguler la progression du cycle cellulaire. Cellules A549 non-small cell lung cancer (NSCLC) ont été transfectées, modifications d’expression génique ont été analysées et activité apoptotique grâce au traitement a été finalement analysée. Diminution de l’expression des kinases cycline-dépendantes (CDKs) ont été détectés (CDK1, CDK4 et CDK6), et le cycle cellulaire s’arrêta aux transitions de phase G1/S et G2/M. Analyse de la voie a indiqué activité anti-angiogénique potentielle du traitement, qui dote l’approche de l’activité aux multiples facettes. Ici décrites sont les méthodes utilisées pour identifier l’activité miRNA concernant l’inhibition du cycle cellulaire, l’induction de l’apoptose et les effets du traitement sur les cellules endothéliales par l’inhibition de l’angiogenèse. Il est à espérer que les méthodes présentées ici soutiendra les recherches futures sur miRNA thérapeutique et l’activité correspondante et que les données représentatives guidera d’autres chercheurs au cours des analyses expérimentales.

Analyse de l’expression génique à l’aide de la RT-qPCR et gel d’électrophorèse
Analyse de l’expression différentielle des gènes à l’aide de la RT-qPCR a démontré une diminution significative des gènes ciblés CDK1, CDK4 et CDK6. CDK1 et CDK4/6 ont été montré pour être un instrument pour le G2/M et les transitions G1/S, respectivement. L’analyse effectuée a permis de comparaison directe...

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Analysis of Combinatorial miRNA Treatments to Regulate Cell Cycle and Angiogenesis

miRNA therapeutics ont un potentiel important dans la régulation de la progression du cancer. Démontré ici sont des approches analytiques utilisées pour l’identification de l’activité d’un traitement de miRNA combinatoire pour stopper le cycle cellulaire et l’angiogénèse.

Analyse de miRNA combinatoire des traitements pour réguler le Cycle cellulaire et l’angiogenèse

Lung cancer (LC) is the leading cause of cancer-related deaths worldwide. Similar to other cancer cells, a fundamental characteristic of LC cells is ...

Cette méthode aidera à comprendre et à effectuer les techniques de laboratoire nécessaires pour identifier l’activité de deux microARN dans les cellules cancéreuses du poumon in vitro. Le cancer du poumon est la principale cause de décès lié au cancer dans le monde. Ici, nous présentons des techniques allant des méthodologies de laboratoire de base aux protocoles plus complexes, tels que l’analyse de l’expression des gènes et le microARN protéique anticorps, spécifiquement utilisé pour identifier l’effet des actions de microARN.Les méthodes suivantes nous aideront à répondre aux questions clés concernant l’effet de deux microARN, microARN 143 et microARN 506, sur la régulation du cycle cellulaire dans les cellules cancéreuses pulmonaires. Nous présentons différentes techniques de laboratoire, comme la transfection cellulaire, l’extraction de l’ARN, l’analyse quantitative en temps réel du PCR et du microARN. Nous espérons que notre présentation contribuera à la réalisation réussie de ces analyses.Tout d’abord, placez les cellules d’culture dans un flacon approprié suffisant pour l’extraction de l’ARN et des protéines, pour effectuer l’expression des gènes à l’aide de qPCR ou d’analyse de micro-réseau. Puis incuber pendant la nuit avec des médias complétés par 10 pour cent FBS et 1 pour cent streptocotomycine pénicilline. Le lendemain, préparez l’échantillon de microARN à la transfection en diluant le microARN 143 et le microARN 506 dans les médias à une concentration de 100 nanomolaires chacun.Sortez le flacon de l’incubateur et retirez les supports. Laver avec 1x PBS. Tous les contrôles non traités ne contiendront que des supports incomplets avec des cellules.Incuber les cellules avec des supports de transfection pendant six heures dans un incubateur. Après six heures, retirez les supports et remplacez-les par quatre millilitres de supports frais et complets. Récolter les cellules après 24 heures et 48 heures par trypsinisation.Ensuite, lavez-les deux fois avec 1x PBS dans chaque tube et retirez le surnatant. Afin d’effectuer l’extraction de l’ARN à un moment ultérieur, congeler les cellules à moins 80 degrés Celsius. L’extraction de l’ARN a été effectuée à l’aide d’un kit d’ARN, suivant les instructions du fabricant.Tout d’abord, retirer les tubes de moins 80 degrés Celsius et laisser décongeler. Ajouter 300 microlitres de tampon de lyse et pipette de haut en bas pour briser la membrane cellulaire. Ajouter un volume égal d’éthanol 100 % ultra pur.Ensuite, bien mélanger et placer dans la colonne séparée. Centrifugeuse et enlever le flux à travers. Ajouter 400 microlitres de lavage et de tampon et centrifugeuse pour enlever le tampon.Ajouter 5 microlitres de DNAse 1 avec 75 microlitres tampon de digestion VNA dans chaque échantillon, et incuber pendant 15 minutes. Ensuite, lavez l’échantillon avec 400 microlitres tampon de préparation de l’ARN. Ensuite, lavez-les deux fois avec le tampon de lavage d’ARN.Maintenant, ajoutez de l’eau sans nucléase à la colonne, centrifugeuse, puis recueillez l’ARN. Mesurer la concentration d’ARN. À ce stade, deux microgrammes d’échantillon d’ARN peuvent être envoyés pour le séquençage de l’ARN.Préparer l’ADND selon le protocole décrit dans la section texte, à l’aide du thermocycleur. Préparez des solutions d’amorce avant et arrière avec de l’eau sans RNAse DNAse à une concentration de 10 micromolaires. Préparez un mélange maître pour que chaque gène soit détecté en fonction du nombre d’échantillons.Pour chaque échantillon cDNA, la quantité de réaction est selon le tableau décrit dans le texte. Placez chaque échantillon dans leurs puits respectifs. Pour qPCR, il est toujours bon de préparer un document Excel avec 96 plaques de puits, afin de garder une trace des échantillons.Pour chaque échantillon et gène analysé, effectuer leur réaction en triplicates, ou du moins en double. Sceller la plaque de plastique avec un scellant en plastique transparent et optiquement transparent. Évitez de toucher la fine couche de plastique avec les doigts, car cela peut produire un faux signal.Faites tourner rapidement la plaque pour mélanger tous les reagents au fond de leurs puits. Ensuite, exécutez la plaque d’échantillon à l’aide d’une machine PCR quantitative en temps réel. Obtenez les valeurs CT générées par la machine qPCR et analysez l’expression relative des gènes.Transfect les cellules comme décrit dans la section précédente de cette vidéo. Récoltez les cellules de chaque échantillon dans des tubes stériles séparés de 15 millilitres pour la trypsinisation. Ensuite, lavez les cellules deux fois avec 1x PBS, par centrifugation à 751G pendant cinq minutes, puis retirez le supernatant.Suspendez et brisez la palette en ajoutant 200 microlitres glacés 1x PBS à travers une pipette. Ajouter deux millilitres d’éthanol glacé à 70 pour cent, laisser tomber au tube, tout en vortexant doucement le tube pour fixer les cellules. Incuber les tubes pendant 30 minutes à température ambiante et les placer en quatre degrés Celsius pendant une heure.Retirer les tubes de quatre degrés Celsius et de centrifugeuses. Ajouter 2 ml de PBS et vortex glacés, puis retirer le supernatant par centrifugation. Ajouter 500 microlitres de 1x PBS contenant de l’iodure de propidium et de la ribonuclease A avec une concentration de 50 et 200 microgrammes par millilitre, respectivement, dans chaque échantillon, et incuber pendant 30 minutes à température ambiante.Transférez des échantillons dans des tubes appropriés, à l’protection de la lumière, et exécutez sur le cytomètre d’écoulement. Cette expérience est d’identifier l’expression de toutes les protéines de la voie du cycle cellulaire modifiées par le traitement par microARN. Recueillir des échantillons de protéines selon la procédure décrite dans la section transfection, et quantifier avec l’analyse BCA.Retirez les glissières de moins quatre degrés Celsius une heure avant l’expérience pour amener à la température ambiante et pour éliminer l’humidité. Prenez 70 microgrammes d’échantillons de protéines et préparez des diapositives d’échantillons selon les instructions du fabricant, qui sont également décrites étape par étape dans la section texte. Ici pour noter, le lavage approprié des glissières avec de l’eau déionisée ultra-pure est une autre étape importante, car cela aidera à réduire l’arrière-plan des diapositives.En outre, il est très essentiel dans cette expérience de ne pas assécher les diapositives de l’échantillon jusqu’à l’étape finale. Enfin, numérisez la diapositive à l’aide d’une machine à micro-tableau et analysez les données. L’analyse qPCR des échantillons traités par microARN a eu lieu pour déterminer l’expression génétique de CDK1, CDK4 et CDK6.Ces gènes régulent le cycle cellulaire des cellules normales et cancéreuses, et ont été ciblés comme un moyen d’inhiber la progression tumorale. Les données ont démontré l’effet downregulatory de ces gènes dus au traitement avec le microARN 143 et 506. Les données de distribution de cycle cellulaire de la cytométrie de flux ont démontré une augmentation de population dans la phase G0 et G1, et une diminution de population dans la phase de S due à l’effet du traitement combinatorial du microARN 143 et 506.L’analyse spécifique du micro-tableau du cycle cellulaire a détecté des changements d’expression des protéines d’environ 60 gènes. La carte thermique représentée indiquait une downregulation au niveau protéique de plusieurs gènes nécessaires à la progression du cycle cellulaire et à la prolifération, tels que CDK2, Helen 1 et 3, RE2F1. En revanche, les protéines couramment reconnues par leur effet inhibiteur cultivé ont été régulées.Bien que les résultats soient semi-quantitatifs et qu’une analyse plus approfondie soit nécessaire, l’analyse des micro-réseaux donne un aperçu rapide de l’activité de la voie. Nous croyons qu’après avoir regardé cette vidéo, vous serez en mesure d’effectuer des expérimentations fondamentales, ainsi complexes, en laboratoire qui vous aideront à identifier l’activité microARN dans les cellules.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

MicroRNA Based Liquid Biopsy: The Experience of the Plasma miRNA Signature Classifier (MSC) for Lung Cancer Screening

MicroRNA Based Liquid Biopsy: The Experience of the Plasma miRNA Signature Classifier MSC for Lung Cancer Screening

Micro-ARN après biopsie liquide : L’expérience de la miRNA Plasma Signature classificateur (SMC) pour le dépistage du Cancer du poumon

The development of a minimally invasive test, such as liquid biopsy, for early lung cancer detection in its preclinical phase is crucial to improve the ...

Recherche

Recherche en cancérologie

Preparation of Primary Acute Lymphoblastic Leukemia Cells in Different Cell Cycle Phases by Centrifugal Elutriation

Préparation des cellules primaires de leucémie lymphoblastique aiguë en Phases de Cycle de cellules différentes par élutriation centrifuge

The ability to synchronize cells has been central to advancing our understanding of cell cycle regulation. Common techniques employed include serum ...

Simple and Rapid Method to Obtain High-quality Tumor DNA from Clinical-pathological Specimens Using Touch Imprint Cytology

Méthode simple et rapide d’obtenir qualité tumeur ADN provenant d’échantillons cliniques pathologiques à l’aide de la cytologie mentions légales contact

It is critical to determine the mutational status in cancer before administration and treatment of specific molecular targeted drugs for cancer patients. ...

Generation and Isolation of Cell Cycle-arrested Cells with Complex Karyotypes

Génération et l’isolement des cellules Cycle cellulaire-arrêté avec caryotypes complexes

Chromosome mis-segregation leads to aneuploidy, a condition in which cells harbor an imbalanced chromosome number. Several lines of evidence strongly ...

Phospho Flow Cytometry with Fluorescent Cell Barcoding for Single Cell Signaling Analysis and Biomarker Discovery

Cytométrie en flux phospho avec cellule fluorescente code-barres pour seule cellule signalisation d’analyse et découverte de Biomarker

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Analyse cytométrique de flux des espèces réactives d'oxygène mitochondrial dans les cellules hématopoïétiques de tige et de progéniture de Murine et la leucémie entraînée mLL-AF9

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Optimization, Design and Avoiding Pitfalls in Manual Multiplex Fluorescent Immunohistochemistry

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Microenvironment evaluation of intact tissue for analysis of cell infiltration and spatial organization are essential in understanding the complexity of ...

Cell Cycle-specific Measurement of &#947;H2AX and Apoptosis After Genotoxic Stress by Flow Cytometry

Mesure spécifique au cycle cellulaire de h2AX et d'apoptose après stress génotoxique par cytométrie de flux

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Analyse de la population latérale dans les variétés de cellule de tumeur solide

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Évaluation de la mort cellulaire à l’aide d’un surnageant sans cellules de probiotiques dans des cultures sphéroïdes tridimensionnelles de cellules cancéreuses colorectales

This manuscript describes a protocol to evaluate cancer cell deaths in three dimensional (3D) spheroids of multicellular types of cancer cells using ...