Name: analysis of combinatorial mirna treatments to regulate cell cycle and angiogenesis
Uploaded: 2019-03-30T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Combinatorial miRNA Treatments to Regulate Cell Cycle and Angiogenesis at JoVE.com

Non vengono dichiarati conflitti di interesse.

1. miR-143 e miR-506 transfezione
Attenzione: Utilizzare un camice da laboratorio, occhiali protettivi e guanti in lattice durante l'esecuzione di esperimenti descritti. Quando richiesto, è possibile utilizzare l'armadio di sicurezza biologica con il ventilatore su, senza bloccare le vie respiratorie o disturbare il flusso d'aria laminare. Impostare sempre la finestra di vetro proteggente all'altezza appropriata, come descritto dal produttore.
<ol><li>Le cellule A549 NSCLC seme in una piast...

<ol>
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Mirna possono operare come terapie mirate per il trattamento del cancro, riconoscendo l'alterazione dei livelli di espressione in malati vs tessuti normali. Questo studio mira a determinare i miRNA che potenzialmente fermare la progressione del ciclo cellulare durante le fasi multiple. È stato identificato che miR-143 e miR-506 arrestare il ciclo cellulare delle cellule tumorali e i protocolli presentati volti a comprendere l'attività di questo trattamento di miRNA combinatoria.
Le metodolog...

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One of the authors&#39; names was corrected from:
George Matthaiolampakis
to:
George Mattheolabakis

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Erratum: Analysis of Combinatorial miRNA Treatments to Regulate Cell Cycle and Angiogenesis

Il ciclo cellulare è una combinazione di più eventi normativi che consentono la duplicazione del DNA e la proliferazione cellulare attraverso il processo mitotico1. Chinasi ciclina-dipendenti (CDKs) regolare e promuovere il ciclo cellulare2. Tra questi, il CDK mitotica (CDK1) e interfase CDKs (CDK2, CDK4 e CDK6) hanno un ruolo fondamentale nel ciclo cellulare progressione3. Proteina del retinoblastoma (Rb) è fosforilata da CDK4/CDK6 complessi per consentire il ciclo cellulare progressione4, e l'attivazione CDK1 è essenziale per la divisione cellulare successo5. Numerosi inibitori delle CDK sono stati sviluppati e valutati in studi clinici negli ultimi decenni, che indica il potenziale di targeting CDKs nel trattamento del cancro. Infatti, tre inibitori delle CDK sono stati approvati per il trattamento di cancro al seno recentemente6,7,8,9,10. Così, CDKs, e in particolare, CDK1 e CDK4/6, sono di grande interesse nella regolazione della progressione del cancro delle cellule.
Mirna (miRs) sono piccole, non-codificazione RNAs e regolatori post-trascrizionale dell'espressione genica, circa il 30% di tutti i geni umani11di regolazione. Loro attività è basata sulla repressione traduzionale o degradazione del RNA messaggero (mRNA)12. Indicativo del loro significato biologico, sono stati identificati più di 5.000 Mirna e una molecola di miRNA singolo può regolare più geni11,13. Ancora più importante, espressione dei miRNA è stata associata con diverse malattie e Stati di malattia, compreso cancro13. Infatti, i miRNA sono stati caratterizzati come oncogeni o soppressori tumorali, essendo in grado di promuovere o sopprimere tumore sviluppo e progressione di14,15. L'espressione relativa di Mirna in tessuti malati può regolare la progressione di malattia; così, consegna esogeno di Mirna ha potenziale terapeutico.
Cancro del polmone è la principale causa di decessi per cancro e più grande di 60% di tutti i tumori maligni del polmone non a piccole cellule16,i cancri del polmone17, con un tasso di sopravvivenza a 5 anni inferiore al 20%18. L'uso di miR-143-3 p e miR-506-3 p recentemente è stata valutata per il targeting i cicli delle cellule nel polmone cancro cellule11. miR-143 e miR-506 hanno sequenze di complementarità CDK1 e CDK4/CDK6, e sono stati analizzati gli effetti di questi due miRs sulle cellule A549. I dati sperimentali sono presentati e discussi in questa carta. Espressione genica, progressione del ciclo cellulare e apoptosi sono stati valutati usando diversi disegni sperimentali e punti temporali dopo trasfezione. Abbiamo usato metodi quantitativi in tempo reale di PCR (RT-qPCR) insieme con l'analisi di microarray per misurare l'espressione di specifici geni, e sequenziamento di RNA di nuova generazione è stato usato per determinare di disregolazione genica globale11. Quest'ultimo metodo identifica l'abbondanza relativa di trascrizione di ogni gene con alta sensibilità e riproducibilità, mentre migliaia di geni possa essere analizzati da una singola analisi sperimentale. Inoltre, analisi apoptotiche dovuto il trattamento di miRNA è stata eseguita e viene descritto qui. Bioinformatica ha completato l'analisi dei percorsi. Presentato qui sono protocolli utilizzati per l'analisi di terapeutico potenziale della combinatoria miR-143 e miR-506.
Lo scopo principale di questo protocollo è quello di identificare gli effetti dei miRNA nelle cellule, con un focus sul ciclo cellulare. La varietà delle tecniche qui presentate spaziano dalla analisi di espressione genica romanzo e pretraduzione (utilizzando qPCR) di elaborare tecniche per l'analisi del gene a livello proteico, come ad esempio l'analisi di microarray. Si spera che questo rapporto è utile per i ricercatori interessati a lavorare con Mirna. Inoltre, la metodologia per l'analisi cytometric di flusso del ciclo cellulare e apoptosi delle cellule è presentato.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:2067px;" width="2066">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">-80 &#176;C Freezer</td>
			<td style="width:210px;">VWR</td>
			<td style="width:1167px;">VWR40086A</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">96 well plate</td>
			<td style="width:210px;">CELLTREAT Scientific&#160;</td>
			<td style="width:1167px;">50-607-511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">96-well Microwell Plates&#160;&#160;</td>
			<td style="width:210px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:1167px;">12-556-008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">A549 Non Small Cell Lung Cancer Cells</td>
			<td style="width:210px;">ATCC</td>
			<td style="width:1167px;">ATCC&#160;CCL-185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">Agarose</td>
			<td style="width:210px;">VWR</td>
			<td style="width:1167px;">0710-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">Agilent 2100 Bioanalyzer</td>
			<td style="width:210px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:1167px;">G2938c</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ambion Silencer Negative Control No. 1 siRNA</td>
			<td style="width:210px;">Ambion</td>
			<td>AM4611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">Antibiotic-Antimycotic Solution (100x)</td>
			<td style="width:210px;">Gibco</td>
			<td style="width:1167px;">15240-062&#160;&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">Antibody Array Assay Kit, 2 Reactions</td>
			<td style="width:210px;">Full Moon Bio</td>
			<td style="width:1167px;">KAS02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">Bright field microscope&#160;&#160;</td>
			<td style="width:210px;">Microscoptics&#160;</td>
			<td style="width:1167px;">IV-900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">Bright field microscope&#160;&#160;</td>
			<td style="width:210px;">New Star Environment LLC</td>
			<td style="width:1167px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">Cell Cycle Antibody Array, 2 Slides</td>
			<td style="width:210px;">Full Moon Bio</td>
			<td style="width:1167px;">ACC058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">Cell Logic+ Biosafety Cabinate</td>
			<td style="width:210px;">Labconco</td>
			<td style="width:1167px;">342391100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">Cellquest Pro</td>
			<td style="width:210px;">BD bioscience</td>
			<td style="width:1167px;">Steps 5.14; 6.13: Used for calculating the population distrubution according to the cell cycle&#160; phase and for&#160; calculating the population distribution for the analysis of apoptosis&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">CFX96 Real Time System</td>
			<td style="width:210px;">BioRad</td>
			<td style="width:1167px;">CFX96 Optics Module</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">Chemidoc Touch Imaging System</td>
			<td style="width:210px;">BioRad</td>
			<td style="width:1167px;">Chemidoc Touch Imaging System</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">CO2 Incubator</td>
			<td style="width:210px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:1167px;">HERAcell 150i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix</td>
			<td style="width:210px;">Trevigen</td>
			<td style="width:1167px;">3433-010-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">Digital Camera</td>
			<td style="width:210px;">AmScope&#160;</td>
			<td style="width:1167px;">FMA050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMEM 4.5 g/L Glucose, w/out Sodium Pyruvate, w/ L-Glutamine</td>
			<td style="width:210px;">VWR</td>
			<td>VWRL0100-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">DNAse I</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>E1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">Endothelial Cell Growth Supplement (ECGS)</td>
			<td style="width:210px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:1167px;">356006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">Eppendorf Pipette Pick-A-Pack Sets</td>
			<td style="width:210px;">Eppendrof</td>
			<td style="width:1167px;">05-403-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethanol, Absolute (200 Proof), Molecular Biology Grade,&#160;</td>
			<td style="width:210px;">Fisher BioReagents</td>
			<td>BP2818500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">Ethidium bromide</td>
			<td style="width:210px;">Alfa acar</td>
			<td style="width:1167px;">L07462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">F-12K Nutrient Mixture (Kaighn&#39;s Mod.) with L-glutamine, Corning</td>
			<td style="width:210px;">Corning</td>
			<td>45000-354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">FACS Calibur Flowcytometer</td>
			<td style="width:210px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:1167px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fetal Bovine Serum - Premium</td>
			<td>Antlanta Biologicals</td>
			<td>S11150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:210px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:1167px;">10438026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fisherbrand Basix Microcentrifuge Tubes with Standard Snap Caps</td>
			<td style="width:210px;">Fisherbrand Basix</td>
			<td style="width:1167px;">02-682-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">Forma Series II water Jacket CO2 incubator</td>
			<td style="width:210px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:1167px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">Heparin Solution (5000 U/mL)</td>
			<td style="width:210px;">Hospira</td>
			<td style="width:1167px;">NDC#63739-920-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">Horixontal Electrophoresis system</td>
			<td style="width:210px;">Benchtop lab system</td>
			<td style="width:1167px;">BT102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">hsa-miR-143-3p miRNA Mimic</td>
			<td style="width:210px;">ABM</td>
			<td>MCH01315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">hsa-miR-506-3p miRNA Mimic</td>
			<td style="width:210px;">ABM</td>
			<td>MCH02824</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">Human Recombinant Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF)</td>
			<td style="width:210px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:1167px;">PHC9394&#160;&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC)</td>
			<td style="width:210px;">Individual donors</td>
			<td style="width:1167px;">IRB# A15-3891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">HyClone Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td style="width:210px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:1167px;">SH30256FS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">Ingenuity Pathway Analysis</td>
			<td style="width:210px;">Qiagen</td>
			<td style="width:1167px;">Results: Used for bioinformatics pathway analysis</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Invitrogen UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water</td>
			<td style="width:210px;">Invitrogen</td>
			<td>10-977-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">Lipofectamine 2000&#160;</td>
			<td style="width:210px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:1167px;">11-668-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">Loading dye 10X</td>
			<td style="width:210px;">ward&#39;s science+</td>
			<td style="width:1167px;">470024-814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">Medium M199 (with Earle&#8242;s salts, L-glutamine and sodium bicarbonate)</td>
			<td style="width:210px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:1167px;">M4530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">Microscope Digital Camera</td>
			<td style="width:210px;">AmScope&#160;</td>
			<td style="width:1167px;">MU130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">Modfit LT</td>
			<td style="width:210px;">Verity Software</td>
			<td style="width:1167px;">Step 5.15: Alternative software for analysis of cell cycle population distributions</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">Nanodrop</td>
			<td style="width:210px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:1167px;">NanoDrop one C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Opti-MEM</td>
			<td style="width:210px;">Gibco by life technologies</td>
			<td>31985-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin-streptomycin 10/10</td>
			<td>Antlanta Biologicals</td>
			<td>B21210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Power UP sybr green master mix</td>
			<td style="width:210px;">Applied Biosystems</td>
			<td>A25780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Propidium Iodide</td>
			<td style="width:210px;">MP Biochemicals LLC</td>
			<td>IC19545825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">Proscanarray HT Microarray scanner</td>
			<td style="width:210px;">Perkin elmer</td>
			<td style="width:1167px;">ASCNPHRG. We used excitation laser wavelength at 543 nm.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">q PCR optical adhesive cover</td>
			<td style="width:210px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:1167px;">4360954</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">Quick-RNA Kits</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R1055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ribonuclease A from Bovine pancreas</td>
			<td style="width:210px;">Sigma</td>
			<td>R6513-50MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">ScanArray Express</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td style="width:1167px;">Step 7.33: Microarray analysis software</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">Shaker</td>
			<td style="width:210px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:1167px;">2314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">SimpliAmp Thermal Cycler</td>
			<td style="width:210px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:1167px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">SpectraTube Centrifuge Tubes 15ml</td>
			<td style="width:210px;">VWR</td>
			<td style="width:1167px;">470224-998</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">SpectraTube Centrifuge Tubes 50ml</td>
			<td style="width:210px;">VWR</td>
			<td style="width:1167px;">470225-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TBS Buffer, 20x liquid</td>
			<td style="width:210px;">VWR</td>
			<td>10791-796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">Temperature controlled&#160; centrifuge matchine</td>
			<td style="width:210px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:1167px;">ST16R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">Temperature controlled micro centrifuge matchine</td>
			<td style="width:210px;">Eppendrof</td>
			<td style="width:1167px;">5415R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Thermo Scientific BioLite Cell Culture Treated Flasks</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12-556-009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">Thermo Scientific Pierce BCA Protein Assay</td>
			<td style="width:210px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:1167px;">PI23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Thermo Scientific Pierce RIPA Buffer</td>
			<td style="width:210px;">Thermo Scientific</td>
			<td>PI89900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Thermo Scientific Thermo-Fast 96-Well Full-Skirted Plates</td>
			<td style="width:210px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:1167px;">AB0800WL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Thermo Scientific Verso cDNA synthesis Kit (100 runs)</td>
			<td style="width:210px;">Thermo Scientific</td>
			<td>AB1453B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">Ultra Low Range DNA Ladder</td>
			<td style="width:210px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:1167px;">10597012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">VWR standard solid door laboratory refrigerator</td>
			<td style="width:210px;">VWR</td>
			<td style="width:1167px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of combinatorial mirna treatments to regulate cell cycle and angiogenesis

Il cancro del polmone (LC) è la causa principale delle morti legate al cancro in tutto il mondo. Simile ad altre cellule di cancro, una caratteristica fondamentale delle cellule LC è proliferazione non regolamentata e la divisione cellulare. Inibizione della proliferazione di arrestare la progressione del ciclo cellulare ha dimostrato di essere un promettente approccio per il trattamento del cancro, tra cui LC.
terapeutica di miRNA sono emerse come regolatori di genico post-trascrizionale importante e sempre più stanno studiandi per uso nel trattamento del cancro. In recenti lavori, abbiamo utilizzato due Mirna, miR-143 e miR-506, per regolare la progressione del ciclo cellulare. Transfected le cellule A549 non a piccole cellule del polmone cancro (NSCLC), modificazioni dell'espressione genica sono stati analizzati e attività apoptotica dovuta al trattamento infine è stato analizzato. Downregulation di chinasi ciclina-dipendenti (CDKs) sono stati rilevati (cioè, CDK1, CDK4 e CDK6), e ciclo cellulare fermato presso le transizioni di fase di G1/S e G2/M. Analisi del percorso indicano potenziali attività antiangiogenica del trattamento, che conferisce l'approccio multiforme attività. Qui, le metodologie utilizzate per identificare l'attività di miRNA per quanto riguarda l'inibizione del ciclo cellulare, induzione di apoptosi e gli effetti del trattamento sulle cellule endoteliali tramite inibizione dell'angiogenesi sono descritti. Si spera che i metodi presentati qui sosterrà la ricerca futura su miRNA terapeutica e attività corrispondente e che i dati rappresentativi guiderà altri ricercatori durante analisi sperimentali.

Analisi dell'espressione genica tramite RT-qPCR ed elettroforesi su gel
Analisi di espressione genica differenziale usando RT-qPCR dimostrato significativi downregulation dei geni mirati CDK1, CDK4 e CDK6. CDK1 e CDK4/6 sono stati indicati per essere strumentale per il G2/M e transizioni G1/S, rispettivamente. Le analisi eseguite ha permesso il confronto diretto tra miRs individuale e attività di miR combinator...

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Analysis of Combinatorial miRNA Treatments to Regulate Cell Cycle and Angiogenesis

terapeutica di miRNA hanno un potenziale significativo nella regolazione della progressione del cancro. Ha dimostrato qui approcci analitici utilizzati per l'identificazione dell'attività di un trattamento di combinatoria miRNA nell'arrestare il ciclo cellulare e l'angiogenesi.

Analisi di miRNA combinatoria trattamenti per regolare il ciclo cellulare e l'angiogenesi

Lung cancer (LC) is the leading cause of cancer-related deaths worldwide. Similar to other cancer cells, a fundamental characteristic of LC cells is ...

Questo metodo aiuterà a comprendere ed eseguire le tecniche di laboratorio necessarie per identificare l'attività di due microRNA nelle cellule tumorali polmonari in vitro. Il cancro ai polmoni è la principale causa di morte correlata al cancro in tutto il mondo. Qui presentiamo tecniche che vanno dalle metodologie di laboratorio di base ai protocolli più complessi, come l'analisi dell'espressione genica e il microRNA proteico anticorpale, specificamente utilizzati per identificare l'effetto delle azioni del microRNA.I seguenti metodi ci aiuteranno a rispondere a domande chiave riguardanti l'effetto di due microRNA, microRNA 143 e microRNA 506, sulla regolazione del ciclo cellulare nelle cellule tumorali polmonari. Presentiamo diverse tecniche di laboratorio, come la trasfezione cellulare, l'estrazione di RNA, l'analisi quantitativa in tempo reale pcr e microRNA. Speriamo che la nostra presentazione contribuisca a completare con successo queste analisi.In primo luogo, seduti le cellule coltivate in un pallone appropriato sufficiente per l'estrazione di RNA e proteine, per eseguire l'espressione genica utilizzando qPCR o analisi micro-array. Quindi incubare durante la notte con supporti integrati con 10 per cento FBS e 1 per cento di streptomicina penicillina. Il giorno successivo, preparare il campione di microRNA per la trasfezione diluire il microRNA 143 e il microRNA 506 in media ad una concentrazione di 100 nanomolari ciascuno.Esenzi il pallone dall'incubatore e rimuovi il supporto. Lavare con 1x PBS. Tutti i controlli non trattati conterranno solo supporti incompleti con celle.Incubare le cellule con mezzi di trasfezione per sei ore in un'incubatrice. Dopo sei ore, rimuovere il supporto e sostituirlo con quattro millilitri di supporti freschi e completi. Raccogliere le cellule dopo 24 ore e 48 ore per tripsicinazione.Quindi, lavare due volte con 1x PBS in ogni tubo e rimuovere il supernatante. Per eseguire l'estrazione dell'RNA in un secondo momento, congelare le cellule a meno 80 gradi Celsius. L'estrazione dell'RNA è stata eseguita utilizzando un kit di RNA, seguendo le istruzioni del produttore.In primo luogo, rimuovere i tubi da meno 80 gradi Celsius e lasciare scongelare. Aggiungere 300 microlitri di tampone dilisi e pipetta su e giù per rompere la membrana cellulare. Aggiungere lo stesso volume di etanolo ultra puro al 100%.Quindi mescolare bene e posizionare in colonna separata. Centrifugare e rimuovere il flusso. Aggiungere 400 microlitri di lavaggio e tampone e centrifuga per rimuovere il tampone.Aggiungere 5 microlitri di DNAsi 1 con 75 microlitri VNA buffer di digestione in ogni campione e incubare per 15 minuti. Quindi lavare il campione con tampone di preparazione dell'RNA a 400 microliter. Quindi, lavare due volte con tampone di lavaggio dell'RNA.Ora, aggiungi acqua priva di nucleasi alla colonna, centrifuga e poi raccogli l'RNA. Misurare la concentrazione di RNA. In questa fase, due microgrammi di campione di RNA possono essere inviati per il sequenziamento dell'RNA.Preparare il cDNA secondo il protocollo descritto nella sezione di testo, utilizzando il termociclo. Preparare soluzioni primer in avanti e in retromarcia con acqua priva di RNAse DNAse a una concentrazione di 10 micromolari. Preparare un master mix per ogni gene da rilevare in base al numero di campioni.Per ogni campione di cDNA, la quantità di reazione è in base alla tabella descritta nel testo. Posizionare ogni campione nei rispettivi pozzi. Per qPCR, è sempre bene preparare un documento Excel con 96 layout di piastra di pozzo, al fine di tenere traccia dei campioni.Per ogni campione e gene analizzato, eseguire la loro reazione in triplicati, o almeno duplicati. Sigillare la piastra di plastica con sigillare in plastica trasparente e otticamente trasparente. Evitare di toccare il sottile strato di plastica con le dita, in quanto ciò può produrre un segnale falso.Ruotare rapidamente la piastra per mescolare tutti i reagenti sul fondo dei loro pozzi. Quindi, eseguire la piastra campione utilizzando una macchina PCR quantitativa in tempo reale. Ottenere i valori CT generati dalla macchina qPCR e analizzare per l'espressione genica relativa.Trasfetto le celle come descritto nella sezione precedente di questo video. Raccogliere le cellule da ciascun campione in tubi sterili separati da 15 millilitri per la trippsinizzazione. Quindi, lavare le cellule due volte con 1x PBS, centrifugando a 751G per cinque minuti, quindi rimuovere il supernatante.Sospendere e rompere la tavolozza aggiungendo 200 microliter ghiacciati 1x PBS attraverso una pipetta. Aggiungere due millilitri di etanolo ghiacciato al 70%, per quanto riguarda la goccia al tubo, mentre si vortice delicatamente il tubo per fissare le cellule. Incubare i tubi per 30 minuti a temperatura ambiente e metterli in quattro gradi Celsius per un'ora.Rimuovere i tubi da quattro gradi Celsius e centrifuga. Aggiungere PBS e vortice ghiacciati da 2 ml, quindi rimuovere il supernatante mediante centrifugazione. Aggiungere 500 microlitri di 1x PBS contenenti propidioduro e ribonucleasi A con concentrazione rispettivamente di 50 e 200 microgrammi per millilitro in ciascun campione e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente.Trasferire campioni in tubi appropriati, proteggendosi dalla luce, ed eseguire su citometro di flusso. Questo esperimento è quello di identificare tutta l'espressione delle proteine della via del ciclo cellulare cambiata dal trattamento con microRNA. Raccogliere campioni proteici secondo la procedura descritta nella sezione di trasfezione e quantificare con il saggio BCA.Rimuovere le diapositive da meno quattro gradi Celsius un'ora prima dell'esperimento per portare a temperatura ambiente e rimuovere l'umidità. Prelevare 70 microgrammi di campioni proteici e preparare diapositive campione secondo le istruzioni del produttore, che è anche descritto passo dopo passo nella sezione di testo. Qui da notare, un corretto lavaggio degli scivoli con acqua deionizzata ultra pura è un altro passo importante, in quanto ciò aiuterà a ridurre lo sfondo delle diapositive.Inoltre, è molto critico in questo esperimento non asciugare le diapositive campione fino al passaggio finale. Infine, scansionare la diapositiva utilizzando la macchina micro-array e analizzare i dati. L'analisi qPCR dei campioni trattati con microRNA ha avuto luogo per determinare l'espressione genica di CDK1, CDK4 e CDK6.Questi geni regolano il ciclo cellulare delle cellule normali e tumorali, e sono stati presi di mira come mezzo per inibire la progressione tumorale. I dati hanno dimostrato l'effetto downregolatorio di questi geni dovuto al trattamento con microRNA 143 e 506. I dati sulla distribuzione del ciclo cellulare dalla citometria del flusso hanno dimostrato un aumento della popolazione nella fase G0 e G1 e una diminuzione della popolazione nella fase S a causa dell'effetto del trattamento combinatorio del microRNA 143 e 506.L'analisi specifica del micro-array del ciclo cellulare ha rilevato cambiamenti di espressione proteica di circa 60 geni. La mappa termica rappresentata indicava la downregolazione a livello proteico di più geni necessari per la progressione del ciclo cellulare e la proliferazione, come CDK2, Helen 1 e 3, RE2F1. Al contrario, le proteine comunemente riconosciute dal loro effetto inibitorio adulto sono state upregolamentate.Sebbene i risultati siano semi-quantitativi e siano necessarie ulteriori analisi, l'analisi dei micro-array fornisce una rapida panoramica dell'attività del percorso. Crediamo che, dopo aver visto questo video, sarai in grado di eseguire sperimentazioni di laboratorio fondamentali, oltre che complesse, che ti aiuteranno nell'identificazione dell'attività del microRNA nelle cellule.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

MicroRNA Based Liquid Biopsy: The Experience of the Plasma miRNA Signature Classifier (MSC) for Lung Cancer Screening

MicroRNA Based Liquid Biopsy: The Experience of the Plasma miRNA Signature Classifier MSC for Lung Cancer Screening

MicroRNA biopsia liquida di base: L'esperienza del Plasma quieto firma classificatore (MSC) per lo Screening del cancro del polmone

The development of a minimally invasive test, such as liquid biopsy, for early lung cancer detection in its preclinical phase is crucial to improve the ...

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