Name: analysis of combinatorial mirna treatments to regulate cell cycle and angiogenesis
Uploaded: 2019-03-30T14:00:00
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Não há conflitos de interesse são declarados.

1. miR-143 e miR-506 transfecção
Atenção: Utilize luvas de látex, óculos de protecção e um casaco de laboratório durante a realização dos experimentos descritos. Quando necessário, use o gabinete de segurança biológica com o ventilador do gabinete, sem bloqueio das vias aéreas ou perturbando o fluxo de ar laminar. Sempre como a janela de vidro protegendo a altura apropriada, conforme descrito pelo fabricante.
<ol><li>Células de NSCLC A549 semente em uma T25 cm2 bal...

<ol>
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os miRNAs pode operar como terapias alvo para tratamento de câncer, reconhecendo a desregulação dos níveis de expressão em doentes vs tecidos normais. Este estudo teve como objetivo determinar os miRNAs que potencialmente interromper a progressão do ciclo celular durante vários estágios. Identificou-se que miR-143 e miR-506 interromper o ciclo celular de células cancerosas e os protocolos apresentados objetivou compreender a atividade deste tratamento miRNA combinatória.
As metodolog...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/video/59460/analysis-combinatorial-mirna-treatments-to-regulate-cell-cycle">Analysis of Combinatorial miRNA Treatments to Regulate Cell Cycle and Angiogenesis</a>.&#160; An author name was updated.
One of the authors&#39; names was corrected from:
George Matthaiolampakis
to:
George Mattheolabakis

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/59460/analysis-combinatorial-mirna-treatments-to-regulate-cell-cycle">Analysis of Combinatorial miRNA Treatments to Regulate Cell Cycle and Angiogenesis</a>.&#160; An author name was updated.

Erratum: Analysis of Combinatorial miRNA Treatments to Regulate Cell Cycle and Angiogenesis

O ciclo celular é uma combinação de vários eventos regulatórios que permitem a duplicação de DNA e a célula proliferação através do processo mitótico1. Quinases cyclin-dependente (CDKs) regulam e promovem o ciclo celular2. Entre eles, o CDK mitótica (CDK1) e CDKs interfase (CDK2, CDK4 e CDK6) têm um papel essencial no ciclo celular progressão3. Proteína do retinoblastoma (Rb) é fosforilada pelo CDK4/CDK6 complexo para permitir de progressão do ciclo celular4, e ativação de CDK1 é essencial para o sucesso de divisão celular5. Inibidores CDK numerosas foram desenvolvidos e avaliados em ensaios clínicos ao longo das últimas décadas, indicando o potencial de segmentação CDKs no tratamento do câncer. Na verdade, três inibidores CDK foram aprovados para o tratamento do câncer de mama recentemente6,7,8,9,10. Assim, CDKs, e em particular, a CDK1 e CDK4/6, são de grande interesse na regulamentação da progressão de células de câncer.
os miRNAs (miRs) são RNAs pequenos, não-codificantes e reguladores pós-transcricional da expressão gênica, regulação de aproximadamente 30% de todos os genes humanos11. Sua atividade baseia-se na repressão translacional ou degradação de RNA mensageiro (mRNAs)12. Ilustrativos do seu significado biológico, mais de 5.000 miRNAs foram identificados e uma molécula de miRNA único pode regular vários genes11,13. Mais importante, miRNA expressão tem sido associado com doenças diferentes e status de doenças, incluindo câncer13. Na verdade, os miRNAs foram caracterizados como oncogênicos ou supressores de tumor, sendo capaz de promover ou suprimir tumor desenvolvimento e progressão de14,15. A expressão relativa de miRNAs em tecidos doentes pode regular a progressão da doença; assim, entrega exógena de miRNAs tem potencial terapêutico.
Câncer de pulmão é a principal causa de mortes relacionadas ao câncer e maior do que 60% de todas as neoplasias malignas de pulmão não-pequenas células de pulmão câncer16,17com uma taxa de sobrevida de 5 anos de menos de 20%18. O uso de miR-143-3 p e p miR-506-3 foi avaliado recentemente para o direcionamento os ciclos de celular de células de câncer de pulmão11. miR-143 e miR-506 têm sequências que são complementaridade a CDK1 e CDK4/CDK6, e foram analisados os efeitos destes dois miRs sobre A549 células. Os detalhes experimentais são apresentados e discutidos neste artigo. Expressão gênica, progressão do ciclo celular e apoptose foram avaliados usando diferentes desenhos experimentais e momentos seguindo do transfection. Usamos métodos quantitativos em tempo real do PCR (RT-qPCR) juntamente com a análise de microarray para medir a expressão de genes específicos, e a sequenciação do ARN de próxima geração foi usada para determinar o gene global desregulagem11. O último método identifica a abundância relativa de transcrição do gene cada com alta sensibilidade e reprodutibilidade, enquanto milhares de genes podem ser analisados a partir de uma única análise experimental. Além disso, análise de apoptose devido ao tratamento de miRNA foi realizada e está descrito aqui. Bioinformática completada a análise de percurso. Aqui apresentados são protocolos usados para análise da terapêutica potencial de miR-143 a combinatória e miR-506.
O principal objectivo do presente protocolo é identificar os efeitos de miRNAs nas células, com um foco sobre o ciclo celular. A variedade das técnicas aqui apresentadas extensão de análise de expressão do gene tradução prévia (usando qPCR) para elaborar e novela técnicas para análise do gene no nível da proteína, tais como análise de microarray. Espera-se que este relatório é útil para pesquisadores interessados em trabalhar com os miRNAs. Além disso, é apresentada a metodologia para análise de fluxo cytometric do ciclo celular e apoptose de células.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:2067px;" width="2066">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">-80 &#176;C Freezer</td>
			<td style="width:210px;">VWR</td>
			<td style="width:1167px;">VWR40086A</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">96 well plate</td>
			<td style="width:210px;">CELLTREAT Scientific&#160;</td>
			<td style="width:1167px;">50-607-511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">96-well Microwell Plates&#160;&#160;</td>
			<td style="width:210px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:1167px;">12-556-008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">A549 Non Small Cell Lung Cancer Cells</td>
			<td style="width:210px;">ATCC</td>
			<td style="width:1167px;">ATCC&#160;CCL-185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">Agarose</td>
			<td style="width:210px;">VWR</td>
			<td style="width:1167px;">0710-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">Agilent 2100 Bioanalyzer</td>
			<td style="width:210px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:1167px;">G2938c</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ambion Silencer Negative Control No. 1 siRNA</td>
			<td style="width:210px;">Ambion</td>
			<td>AM4611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">Antibiotic-Antimycotic Solution (100x)</td>
			<td style="width:210px;">Gibco</td>
			<td style="width:1167px;">15240-062&#160;&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">Antibody Array Assay Kit, 2 Reactions</td>
			<td style="width:210px;">Full Moon Bio</td>
			<td style="width:1167px;">KAS02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">Bright field microscope&#160;&#160;</td>
			<td style="width:210px;">Microscoptics&#160;</td>
			<td style="width:1167px;">IV-900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">Bright field microscope&#160;&#160;</td>
			<td style="width:210px;">New Star Environment LLC</td>
			<td style="width:1167px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">Cell Cycle Antibody Array, 2 Slides</td>
			<td style="width:210px;">Full Moon Bio</td>
			<td style="width:1167px;">ACC058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">Cell Logic+ Biosafety Cabinate</td>
			<td style="width:210px;">Labconco</td>
			<td style="width:1167px;">342391100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">Cellquest Pro</td>
			<td style="width:210px;">BD bioscience</td>
			<td style="width:1167px;">Steps 5.14; 6.13: Used for calculating the population distrubution according to the cell cycle&#160; phase and for&#160; calculating the population distribution for the analysis of apoptosis&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">CFX96 Real Time System</td>
			<td style="width:210px;">BioRad</td>
			<td style="width:1167px;">CFX96 Optics Module</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">Chemidoc Touch Imaging System</td>
			<td style="width:210px;">BioRad</td>
			<td style="width:1167px;">Chemidoc Touch Imaging System</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">CO2 Incubator</td>
			<td style="width:210px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:1167px;">HERAcell 150i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix</td>
			<td style="width:210px;">Trevigen</td>
			<td style="width:1167px;">3433-010-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">Digital Camera</td>
			<td style="width:210px;">AmScope&#160;</td>
			<td style="width:1167px;">FMA050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMEM 4.5 g/L Glucose, w/out Sodium Pyruvate, w/ L-Glutamine</td>
			<td style="width:210px;">VWR</td>
			<td>VWRL0100-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">DNAse I</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>E1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">Endothelial Cell Growth Supplement (ECGS)</td>
			<td style="width:210px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:1167px;">356006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">Eppendorf Pipette Pick-A-Pack Sets</td>
			<td style="width:210px;">Eppendrof</td>
			<td style="width:1167px;">05-403-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethanol, Absolute (200 Proof), Molecular Biology Grade,&#160;</td>
			<td style="width:210px;">Fisher BioReagents</td>
			<td>BP2818500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">Ethidium bromide</td>
			<td style="width:210px;">Alfa acar</td>
			<td style="width:1167px;">L07462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">F-12K Nutrient Mixture (Kaighn&#39;s Mod.) with L-glutamine, Corning</td>
			<td style="width:210px;">Corning</td>
			<td>45000-354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">FACS Calibur Flowcytometer</td>
			<td style="width:210px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:1167px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fetal Bovine Serum - Premium</td>
			<td>Antlanta Biologicals</td>
			<td>S11150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:210px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:1167px;">10438026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fisherbrand Basix Microcentrifuge Tubes with Standard Snap Caps</td>
			<td style="width:210px;">Fisherbrand Basix</td>
			<td style="width:1167px;">02-682-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">Forma Series II water Jacket CO2 incubator</td>
			<td style="width:210px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:1167px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">Heparin Solution (5000 U/mL)</td>
			<td style="width:210px;">Hospira</td>
			<td style="width:1167px;">NDC#63739-920-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">Horixontal Electrophoresis system</td>
			<td style="width:210px;">Benchtop lab system</td>
			<td style="width:1167px;">BT102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">hsa-miR-143-3p miRNA Mimic</td>
			<td style="width:210px;">ABM</td>
			<td>MCH01315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">hsa-miR-506-3p miRNA Mimic</td>
			<td style="width:210px;">ABM</td>
			<td>MCH02824</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">Human Recombinant Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF)</td>
			<td style="width:210px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:1167px;">PHC9394&#160;&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC)</td>
			<td style="width:210px;">Individual donors</td>
			<td style="width:1167px;">IRB# A15-3891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">HyClone Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td style="width:210px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:1167px;">SH30256FS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">Ingenuity Pathway Analysis</td>
			<td style="width:210px;">Qiagen</td>
			<td style="width:1167px;">Results: Used for bioinformatics pathway analysis</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Invitrogen UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water</td>
			<td style="width:210px;">Invitrogen</td>
			<td>10-977-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">Lipofectamine 2000&#160;</td>
			<td style="width:210px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:1167px;">11-668-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">Loading dye 10X</td>
			<td style="width:210px;">ward&#39;s science+</td>
			<td style="width:1167px;">470024-814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">Medium M199 (with Earle&#8242;s salts, L-glutamine and sodium bicarbonate)</td>
			<td style="width:210px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:1167px;">M4530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">Microscope Digital Camera</td>
			<td style="width:210px;">AmScope&#160;</td>
			<td style="width:1167px;">MU130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">Modfit LT</td>
			<td style="width:210px;">Verity Software</td>
			<td style="width:1167px;">Step 5.15: Alternative software for analysis of cell cycle population distributions</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">Nanodrop</td>
			<td style="width:210px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:1167px;">NanoDrop one C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Opti-MEM</td>
			<td style="width:210px;">Gibco by life technologies</td>
			<td>31985-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin-streptomycin 10/10</td>
			<td>Antlanta Biologicals</td>
			<td>B21210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Power UP sybr green master mix</td>
			<td style="width:210px;">Applied Biosystems</td>
			<td>A25780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Propidium Iodide</td>
			<td style="width:210px;">MP Biochemicals LLC</td>
			<td>IC19545825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">Proscanarray HT Microarray scanner</td>
			<td style="width:210px;">Perkin elmer</td>
			<td style="width:1167px;">ASCNPHRG. We used excitation laser wavelength at 543 nm.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">q PCR optical adhesive cover</td>
			<td style="width:210px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:1167px;">4360954</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">Quick-RNA Kits</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R1055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ribonuclease A from Bovine pancreas</td>
			<td style="width:210px;">Sigma</td>
			<td>R6513-50MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">ScanArray Express</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td style="width:1167px;">Step 7.33: Microarray analysis software</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">Shaker</td>
			<td style="width:210px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:1167px;">2314</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">SimpliAmp Thermal Cycler</td>
			<td style="width:210px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:1167px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">SpectraTube Centrifuge Tubes 15ml</td>
			<td style="width:210px;">VWR</td>
			<td style="width:1167px;">470224-998</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">SpectraTube Centrifuge Tubes 50ml</td>
			<td style="width:210px;">VWR</td>
			<td style="width:1167px;">470225-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TBS Buffer, 20x liquid</td>
			<td style="width:210px;">VWR</td>
			<td>10791-796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">Temperature controlled&#160; centrifuge matchine</td>
			<td style="width:210px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:1167px;">ST16R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">Temperature controlled micro centrifuge matchine</td>
			<td style="width:210px;">Eppendrof</td>
			<td style="width:1167px;">5415R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Thermo Scientific BioLite Cell Culture Treated Flasks</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12-556-009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">Thermo Scientific Pierce BCA Protein Assay</td>
			<td style="width:210px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:1167px;">PI23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Thermo Scientific Pierce RIPA Buffer</td>
			<td style="width:210px;">Thermo Scientific</td>
			<td>PI89900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Thermo Scientific Thermo-Fast 96-Well Full-Skirted Plates</td>
			<td style="width:210px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:1167px;">AB0800WL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Thermo Scientific Verso cDNA synthesis Kit (100 runs)</td>
			<td style="width:210px;">Thermo Scientific</td>
			<td>AB1453B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">Ultra Low Range DNA Ladder</td>
			<td style="width:210px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:1167px;">10597012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:519px;">VWR standard solid door laboratory refrigerator</td>
			<td style="width:210px;">VWR</td>
			<td style="width:1167px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of combinatorial mirna treatments to regulate cell cycle and angiogenesis

Câncer de pulmão (LC) é a principal causa de mortes relacionadas ao câncer em todo o mundo. Semelhante a outras células de câncer, uma característica fundamental das células LC é a proliferação desregulada e divisão celular. Inibição da proliferação de travar a progressão do ciclo celular tem demonstrada ser uma abordagem promissora para o tratamento de câncer, incluindo o LC.
miRNA terapêutica têm emergido como reguladores do importante gene pós-transcricional e cada vez mais estão sendo estudadas para uso no tratamento do câncer. Em recente trabalho, utilizamos dois miRNAs, miR-143 e miR-506, para regular a progressão do ciclo celular. Células de câncer (NSCLC) de pulmão não-pequenas células A549 foram transfectadas, analisaram-se alterações de expressão de gene e atividade apoptotic devido ao tratamento foi finalmente analisada. Downregulation de quinases cyclin-dependente (CDKs) foram detectados (i.e., CDK1, CDK4 e CDK6), e o ciclo celular parou nas transições de fase G1/S e G2/M. Análise do caminho indicado potencial atividade antiangiogênica do tratamento, que dota a abordagem com atividade multifacetada. Aqui descritos são as metodologias utilizadas para identificar a atividade de miRNA relativas à inibição do ciclo celular, indução da apoptose e efeitos do tratamento em células endoteliais através da inibição da angiogênese. Espera-se que os métodos apresentados aqui vão apoiar pesquisas futuras na terapêutica de miRNA e atividade correspondente e que os dados representativos guiará outros pesquisadores durante as análises experimentais.

Análise da expressão de gene usando a electroforese do gel e RT-qPCR
Análise da expressão de genes diferencial usando RT-qPCR demonstrou significativa downregulation de genes alvo CDK1, CDK4 e CDK6. CDK1 e CDK4/6 foram mostrados para ser instrumental para o G2/M e transições de G1/S, respectivamente. A análise realizada permitiu a comparação directa entre miRs individuais e atividade combinatória miR. ...

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Analysis of Combinatorial miRNA Treatments to Regulate Cell Cycle and Angiogenesis

miRNA terapêutica tem potencial significativo na regulamentação da progressão do câncer. Demonstrado aqui abordagens analíticas são usadas para a identificação da atividade de um tratamento de combinatória miRNA em travar o ciclo celular e a angiogênese.

Análise de combinatória miRNA tratamentos para regular o ciclo de celular e a angiogênese

Lung cancer (LC) is the leading cause of cancer-related deaths worldwide. Similar to other cancer cells, a fundamental characteristic of LC cells is ...

Este método ajudará a entender e executar técnicas de laboratório necessárias para identificar a atividade de dois microRNA em células cancerígenas de pulmão in vitro. O câncer de pulmão é a principal causa de morte relacionada ao câncer em todo o mundo. Aqui, apresentamos técnicas que abrangem desde metodologias básicas de laboratório até protocolos mais complexos, como análise de expressão genética e microRNA de proteína de anticorpos, especificamente utilizados para identificar o efeito das ações do microRNA.Os seguintes métodos nos ajudarão a responder a perguntas-chave sobre o efeito de dois microRNAs, microRNA 143 e microRNA 506, sobre a regulação do ciclo celular em células cancerígenas de pulmão. Apresentamos diferentes técnicas de laboratório, como transfecção celular, extração de RNA, análise quantitativa de PCR em tempo real e microRNA. Esperamos que nossa apresentação contribua para concluir com sucesso essas análises.Primeiro, acomodar as células cultivadas em um frasco apropriado suficiente para extração de RNA e proteína, para realizar a expressão genética usando qPCR ou análise de micro array. Em seguida, incubar durante a noite com mídia suplementada com 10% de FBS e 1% de estreptomicina de penicilina. No dia seguinte, prepare a amostra de microRNA para transfecção diluindo o microRNA 143 e o microRNA 506 em mídia a uma concentração de 100 nanomolar cada.Tire o frasco da incubadora e remova a mídia. Lave com 1x PBS. Todos os controles não tratados conterão apenas mídia incompleta com células.Incubar as células com mídia de transfecção por seis horas em uma incubadora. Após seis horas, remova a mídia e substitua por quatro mililitros de mídia fresca e completa. Colher as células após 24 horas e 48 horas por experimentação.Em seguida, lave duas vezes com 1x PBS em cada tubo e remova o supernasciente. A fim de realizar a extração de RNA mais tarde, congele as células a menos 80 graus Celsius. A extração de RNA foi realizada utilizando-se um kit RNA, seguindo as instruções do fabricante.Primeiro, remova os tubos de menos 80 graus Celsius e deixe descongelar. Adicione 300 microliters de tampão de lise e pipeta para cima e para baixo para quebrar a membrana celular. Adicione o mesmo volume de 100% de etanol ultra-puro.Em seguida, misture bem e coloque em coluna separada. Centrifugar e remover o fluxo. Adicione 400 microliters de lavagem e tampão e centrífuga para remover o buffer.Adicione 5 microliters de DNAse 1 com 75 microliters VNA tampão de digestão em cada amostra e incubar por 15 minutos. Em seguida, lave a amostra com 400 tampão de preparação de RNA microliter. Em seguida, lave duas vezes com tampão de lavagem de RNA.Agora, adicione água sem nuclease à coluna, centrífuga e, em seguida, colete o RNA. Meça a concentração de RNA. Nesta fase, dois microgramas de amostra de RNA podem ser enviados para o sequenciamento de RNA.Prepare o cDNA de acordo com o protocolo descrito na seção texto, usando termociclador. Prepare soluções de primer para frente e invertida com água livre de DNAse RNAse para uma concentração de 10 micromolar. Prepare uma mistura mestra para que cada gene seja detectado de acordo com o número de amostras.Para cada amostra de cDNA, a quantidade de reação é de acordo com a tabela descrita no texto. Coloque cada amostra em seus respectivos poços. Para qPCR, é sempre bom preparar um documento Excel com layout de placa de 96 poços, a fim de acompanhar as amostras.Para cada amostra e gene analisado, realize sua reação em triplicados, ou pelo menos duplicados. Sele a placa de plástico com um selador plástico transparente e opticamente transparente. Evite tocar na fina camada plástica com os dedos, pois isso pode produzir sinal falso.Gire rapidamente a placa para misturar todos os reagentes ao fundo de seus poços. Em seguida, execute a placa de amostra usando uma máquina PCR quantitativa em tempo real. Obtenha os valores de TC gerados pela máquina qPCR e analise para a expressão genética relativa.Transfeito as células como descrito na seção anterior deste vídeo. Células de colheita de cada amostra em tubos estéreis separados de 15 mililitros para trippsinização. Em seguida, lave as células duas vezes com 1x PBS, por centrifugação a 751G por cinco minutos, e depois remova o supernante.Suspenda e quebre a paleta adicionando 200 microliter gelado 1x PBS através de uma pipeta. Adicione dois mililitros de 70% de etanol gelado, em termos de gota ao tubo, enquanto o vórtice do tubo suavemente para consertar as células. Incubar tubos por 30 minutos em temperatura ambiente e colocá-los em quatro graus Celsius por uma hora.Remova os tubos de quatro graus Celsius e centrífuga. Adicione 2ml de PBS gelado e vórtice e, em seguida, remova o sobrenatante por centrifugação. Adicione 500 microliters de 1x PBS contendo iodeto de propídio e ribonuclease A com concentração de 50 e 200 microgramas por mililitro, respectivamente, em cada amostra, e incubar por 30 minutos à temperatura ambiente.Transfira amostras para tubos apropriados, protegendo da luz e execute em citômetro de fluxo. Este experimento é identificar toda a expressão das proteínas da via do ciclo celular alterada pelo tratamento microRNA. Coletar amostras de proteína de acordo com o procedimento descrito na seção de transfecção e quantificar com o ensaio BCA.Remova os slides de menos quatro graus Celsius uma hora antes do experimento para trazer à temperatura ambiente e remover a umidade. Pegue 70 microgramas de amostras de proteínas e prepare slides de amostra de acordo com as instruções do fabricante, que também é descrito passo a passo na seção de texto. Aqui para notar, a lavagem adequada de lâminas com água deionizada ultra-pura é outro passo importante, pois isso ajudará a reduzir o fundo dos slides.Além disso, é muito crítico neste experimento não secar os slides da amostra até a etapa final. Finalmente, escaneie o slide usando a máquina de micro array e analise os dados. A análise qPCR das amostras tratadas com microRNA ocorreu para determinar a expressão genética de CDK1, CDK4 e CDK6.Esses genes regulam o ciclo celular de células normais e cancerosas, e têm sido alvo como um meio de inibir a progressão do tumor. Os dados demonstraram o efeito de baixa regulação desses genes devido ao tratamento com microRNA 143 e 506. Os dados de distribuição do ciclo celular da citometria de fluxo demonstraram um aumento populacional na fase G0 e G1, e uma diminuição populacional na fase S devido ao efeito do tratamento combinatório do microRNA 143 e 506.A análise específica de micro array do ciclo celular detectou alterações na expressão proteica de aproximadamente 60 genes. O mapa de calor representado indicou a baixa regulação no nível proteico de múltiplos genes necessários para a progressão do ciclo celular e proliferação, como CDK2, Helen 1 e 3, RE2F1. Em contraste, as proteínas comumente reconhecidas pelo seu efeito inibidor crescido foram reguladas.Embora os resultados sejam semi-quantitativos e uma análise mais aprofundada seja necessária, a análise de micro array fornece uma visão geral rápida da atividade da via. Acreditamos que, depois de assistir a este vídeo, você será capaz de realizar experimentações de laboratório fundamentais, bem complexas, que irão ajudá-lo na identificação da atividade de microRNA nas células.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

MicroRNA Based Liquid Biopsy: The Experience of the Plasma miRNA Signature Classifier (MSC) for Lung Cancer Screening

MicroRNA Based Liquid Biopsy: The Experience of the Plasma miRNA Signature Classifier MSC for Lung Cancer Screening

MicroRNA baseado biópsia líquida: A experiência de miRNA o Plasma assinatura classificador (MSC) para triagem de câncer de pulmão

The development of a minimally invasive test, such as liquid biopsy, for early lung cancer detection in its preclinical phase is crucial to improve the ...

Pesquisa do câncer

Preparation of Primary Acute Lymphoblastic Leukemia Cells in Different Cell Cycle Phases by Centrifugal Elutriation

Preparação de células de leucemia linfoblástica aguda primária em fases diferentes de ciclo celular por Elutriation centrífuga

The ability to synchronize cells has been central to advancing our understanding of cell cycle regulation. Common techniques employed include serum ...

Simple and Rapid Method to Obtain High-quality Tumor DNA from Clinical-pathological Specimens Using Touch Imprint Cytology

Método simples e rápido para obter alta qualidade Tumor DNA de espécimes clínico-patológica usando toque citologia de impressão

It is critical to determine the mutational status in cancer before administration and treatment of specific molecular targeted drugs for cancer patients. ...

Generation and Isolation of Cell Cycle-arrested Cells with Complex Karyotypes

Geração e isolamento de células de ciclo celular-preso com cariótipos complexos

Chromosome mis-segregation leads to aneuploidy, a condition in which cells harbor an imbalanced chromosome number. Several lines of evidence strongly ...

Phospho Flow Cytometry with Fluorescent Cell Barcoding for Single Cell Signaling Analysis and Biomarker Discovery

Citometria de fluxo phospho com Barcoding fluorescente de célula para célula única sinalização análise e descoberta de Biomarker

Aberrant cell signaling plays a central role in cancer development and progression. Most novel targeted therapies are indeed directed at proteins and ...

Flow Cytometric Analysis of Mitochondrial Reactive Oxygen Species in Murine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells and MLL-AF9 Driven Leukemia

Análise Citométrica de fluxo de espécies reativas de oxigênio mitocondrial em células tronco e progenitoras hematopoiéticas Murinas e leucemia acionada por MLL-AF9

We present a flow cytometric approach for analyzing mitochondrial ROS in various live bone marrow (BM)-derived stem and progenitor cell populations from ...

Optimization, Design and Avoiding Pitfalls in Manual Multiplex Fluorescent Immunohistochemistry

Otimização, design e evitando armadilhas em manual multiplex fluorescente imuno-histoquímica

Microenvironment evaluation of intact tissue for analysis of cell infiltration and spatial organization are essential in understanding the complexity of ...

Cell Cycle-specific Measurement of &#947;H2AX and Apoptosis After Genotoxic Stress by Flow Cytometry

Medição específica do ciclo celular de γH2AX e apoptose após estresse genotóxico por citometria de fluxo

The presented method or slightly modified versions have been devised to study specific treatment responses and side effects of various anti-cancer ...

Analysis of Side Population in Solid Tumor Cell Lines

Análise da população lateral em linhas celulares tumorais sólidas

Cancer stem cells (CSCs) are an important cause of tumor growth, metastasis, and recurrence. Isolation and identification of CSCs are of great ...

Evaluating Cell Death Using Cell-Free Supernatant of Probiotics in Three-Dimensional Spheroid Cultures of Colorectal Cancer Cells

Avaliação da morte celular usando supernanato livre de células de probióticos em culturas esferoides tridimensionais de células cancerígenas colorretais

This manuscript describes a protocol to evaluate cancer cell deaths in three dimensional (3D) spheroids of multicellular types of cancer cells using ...